王顯江，程俊亞，陳小麗

(嘉興市第一醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學科；2.急診科，浙江 嘉興 314000；3.廈門大學 抗癌研究中心，福建 廈門 361005)

鼻咽癌在我國華南、西南地區(qū)的發(fā)病率極高，其五年生存率為50%～70%，嚴重影響我國南方地區(qū)人民生活質量[1]。鼻咽癌是一種高侵襲性和轉移性的頭頸部惡性腫瘤，30%～40%的進展期患者會發(fā)生遠處轉移[2]。因此，研究鼻咽癌細胞侵襲和轉移的分子機制對于開發(fā)新的鼻咽癌治療方法十分關鍵。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一組進化保守的內源性非編碼小分子RNA，能與mRNA特異性結合在轉錄后水平負性調控基因的表達。近年來大量研究發(fā)現，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移和代謝中普遍存在表達失調[3]。Wang等[4]對100例鼻咽癌患者進行miRNA檢測后發(fā)現miR-103在鼻咽癌患者中上調，且其高表達預示預后不良。miR-103能夠通過靶向TIMP-3調控wnt/β-catenin信號通路影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[5]，Dluzen等[6]研究則證實miR-103能夠通過PARP-1調節(jié)高血壓患者的氧化應激。但miR-103是否會通過PARP-1影響鼻咽癌，目前還沒有研究報道。本研究旨在分析miR-103對鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞株SUNE1購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-103模擬物(miR-103 mimic)，miR-103抑制物(miR-103 inhibitor)和陰性對照(miR-103 negative control, miR-103 NC)由上海吉瑪股份有限公司設計并合成；LipofectaminTM 2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、CCK-8分析試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；單克隆抗體cyclinD1、vimentin、PARP-1和GAPDH購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 細胞轉染與RT-PCR鑒定 取對數生長期SUNE1細胞，每孔1×105個細胞接種于12孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，按照LipofectaminTM 2000轉染試劑盒說明書，分別將miR-103 mimic、miR-103 inhibitor和miR-103 NC轉染SUNE1細胞，轉染6 h后更換正常培養(yǎng)基。按照RNA提取試劑盒說明書，提取各組細胞RNA，逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR法測定miR-103的表達水平。實驗設3個復孔，以U6為內參，定量結果以ΔCt表示。

1.3 CCK-8實驗 取各組對數生長期細胞，每孔2×104個細胞重新接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設置6個復孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入CCK-8試劑，37 ℃溫育3 h，酶標儀檢測在450 nm處的吸光度， 繪制細胞生長曲線分析細胞增殖情況。

1.4 Transwell實驗 取各組對數生長期細胞使用無血清培養(yǎng)基重懸，以每孔1×105個細胞接種于Transwell小室的上室(侵襲實驗孔上室需預先加入100 μL基質膠)，下室則加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下計數，分析細胞遷移和侵襲情況。

1.5 流式細胞術 收集各組對數生長期細胞，用細胞篩過濾，PBS洗滌2次，計數2×105個細胞，加入0.3 mL Binding buffer重懸細胞， 再加入5 μL FITC- AnnexinV和5 μL PI，避光溫育15 min，加入400 μL×Binding buffer，流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分比。

1.6 Western blot實驗 收集各組對數生長期細胞，以RIPA裂解液提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后于100 ℃下變性5 min；變性蛋白樣本等量上樣至12%SDS-PAGE進行凝膠電泳分離蛋白，100 mA恒流轉膜120 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化學發(fā)光，暗室曝光顯影，使用Image J 軟件計算灰度值。GAPDH為內參。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件分析，測量數據以均數±標準差表示，采用非配對t檢驗，分析各組間差異的顯著性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-103轉染SUNE1鼻咽癌細胞的miR-103表達水平 RT-PCR檢測結果(圖1)顯示，miR-103 mimic組、miR-103 NC組、miR-103 inhibitor組和SUNE1組的miR-103的表達量分別為(9.737±0.376)、(1.280±0.335)、(0.387±0.074)和(1.000±0.000)，miR-103 mimic組高于miR-103組，miR-103組低于SUNE1組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

注：與對照組(SUNE1)比較，*P<0.05，**P<0.01。下同。

2.2 miR-103對SUNE1細胞增殖的影響 CCK-8檢測結果(圖2)顯示，與SUNE1組相比，miR-103 mimic組在48 h和72 h時的細胞生長速率均明顯升高，而miR-103 inhibitor組生長速率明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖2 CCK-8檢測SUNE1細胞的增殖

2.3 miR-103對SUNE1細胞遷移侵襲的影響 Transwell實驗結果(圖3)顯示，miR-103 mimic組、miR-103 NC組、miR-103 inhibitor組和SUNE1組遷移穿入下室的細胞數分別為(87.67±8.02)個、(50.67±7.09)個、(12.33±3.06)個和(47.67±4.51)個；侵襲入下室細胞數分別為(72.33±8.14)個、(48.33±2.52)個、(11.67±1.53)個和(46.00±4.00)個。與SUNE1組比較，miR-103 mimic組細胞遷移能力和侵襲能力均顯著提升，miR-103 inhibitor組細胞遷移能力和侵襲能力均顯著減弱，差異均具有統計學意義(P<0.01)。

圖3 Transwell分析SUNE1細胞的遷移和侵襲

2.4 miR-103對SUNE1細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果(圖4)顯示，miR-103 mimic組、miR-103 NC組、miR-103 inhibitor組和SUNE1組的凋亡率分別為(4.05±0.23) %、(4.06±0.15)%、(4.11±0.21)%和(4.18±0.20)%，各組間細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 流式細胞術檢測SUNE1細胞的凋亡

2.5 miR-103對PARP-1和vimentin蛋白表達影響 Western blot實驗結果顯示，與對照SUNE1組相比，在miR-103 mimic組中vimentin蛋白的表達顯著升高，PARP-1蛋白的表達顯著降低；在miR-103 inhibitor組中，vimentin和cyclinD1蛋白的表達顯著降低，PARP-1蛋白的表達顯著升高；差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖5 Western blot檢測細胞中PARP-1, β-actenin, cyclinD1蛋白的表達

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA參與諸多腫瘤細胞的增殖、分化、轉移及凋亡等生物學過程。miR-103是miRNA家族中的一員，最早于2002年在人宮頸癌HeLa細胞系中被發(fā)現[7]。miR-103首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄生成原始miRNA轉錄產物(pri-miRNA-103)，在細胞核內被名稱為Drosha的RNA內切酶Ⅲ加工得到莖-環(huán)結構。隨后pre-miRNA-103被exportin-5蛋白運輸到細胞質中，再經第二種RNA內切酶Ⅲ -Dicer進一步加工得到成熟雙鏈RNA分子，其中一條成熟鏈插入RISC，與其靶基因mRNA的3’UTR結合，裂解其靶基因mRNA或抑制蛋白質表達[8]。一種miRNA能調控成百上千種下游基因的表達，不同miRNA之間也有交叉調控的蛋白，這種復雜的網狀結構調控著機體細胞的代謝活動[9]。

Fasihi等[10]研究發(fā)現，miR-103a在結直腸癌組織中高表達，并能激活Wnt促癌信號通路；Tan等[11]研究發(fā)現，miR-103通過靶向PTEN，激活PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞增殖與侵襲能力；Zhao等[12]觀察到，血清中高表達miR-103的食管癌患者較正常表達或低表達miR-103的患者生存率明顯下降；Zheng等[13]研究發(fā)現，miR-103在胃癌中通過KLF4促進增殖與轉移；Liang等[14]的研究顯示過表達miR-103a能明顯抑制胃癌MGC-803細胞的增殖、遷移和侵襲。

本研究在細胞水平上觀察到提高miR-103表達能夠抑制鼻咽癌SUNE1細胞增殖、遷移和侵襲的能力。Vimentin是一種中間絲蛋白，在多項研究中被證明是細胞運動的重要調節(jié)因子，可通過被Akt1磷酸化而增強細胞的遷移和侵襲能力[15]。Western blot實驗結果顯示，提高miR-103表達鼻咽癌細胞中vimentin蛋白的表達顯著升高，提示腫瘤細胞可獲得更強的遷移、侵襲能力，此結果與遷移侵襲實驗結果相一致。CyclinD1又稱G1 /S-特異性周期蛋白-D1，其通過激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶，促進G1周期抑制蛋白的磷酸化，推動細胞周期向S期過渡，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化[16]。Western blot實驗結果顯示：抑制miR-103表達鼻咽癌細胞中cyclinD1蛋白的表達減弱，但是提高miR-103表達并沒有明顯增強cyclinD1蛋白的表達，提示miR-103影響鼻咽癌細胞增殖可能另有途徑。PAPR是一種聚合酶，PARP-1下游產物表達增加可修復損傷的DNA分子，減少細胞凋亡[17]。miR-103高表達的鼻咽癌細胞中PARP-1表達顯著降低，即可能增加細胞凋亡，該作用可能抗衡了cyclinD1介導的細胞增殖。

綜上，本研究結果顯示miR-103能夠在細胞水平影響鼻咽癌細胞的生物學行為，該作用可能涉及到多重分子機制。miR-103有望成為鼻咽癌治療的新靶點，但其具體分子機制仍需進一步研究。