王曉臻，王曉雯，王 乙，王倩倩，曹亦菲

(杭州師范大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江 杭州 311121)

砷廣泛分布在自然界的土壤和礦藏中，是一種類金屬物質(zhì)，也是公認(rèn)的致癌物。人類長(zhǎng)期暴露于砷會(huì)導(dǎo)致肺癌、膀胱癌和皮膚癌等癌癥，還會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、腸胃炎、糖尿病、生殖疾病和外周神經(jīng)病變等疾病[1-2]。雖然砷具有毒性，但砷化合物被用作藥物治療疾病在東西方已有千年歷史[3]。

水-甘油通道蛋白(aquaglyceroporins, AQPs)是轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油和二氧化碳等小分子的特異性通道蛋白，砷進(jìn)入機(jī)體的主要方式為通過AQPs進(jìn)出細(xì)胞。本文討論AQPs在砷運(yùn)輸中的作用、AQPs與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)的相互關(guān)系，以及對(duì)各種人類疾病的功能影響。

1 水-甘油通道蛋白作為類金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

水-甘油通道蛋白是主要內(nèi)在蛋白(major intrinsic protein，MIP)超家族的成員，水、甘油、二氧化碳和尿素等小分子溶質(zhì)可以借助該家族蛋白在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)。MIP超家族有三個(gè)亞家族：水通道蛋白，水-甘油通道蛋白和超水通道蛋白[4-5]。其中AQPs在大多數(shù)生物中廣泛存在[6]，在原核生物、真核生物和哺乳動(dòng)物中皆有發(fā)現(xiàn)。有研究顯示，將砷作用于小鼠的不同組織中，AQPs mRNA在小鼠的食道、腎臟、心臟和肝組織的表達(dá)水平都有明顯升高[7]。AQPs主要負(fù)責(zé)三價(jià)砷進(jìn)入細(xì)胞[8]。亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]和砷酸鹽[As(Ⅴ)]是砷的兩種重要的氧化形態(tài)，As(Ⅴ)的毒性遠(yuǎn)小于As(Ⅲ)。As(Ⅴ)在溶液中，以氧陰離子的形式存在，它的性質(zhì)與磷酸鹽類似，是許多酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。一般情況下，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽水平足夠高時(shí)，As(Ⅴ)不會(huì)直接引起砷毒性。而As(Ⅲ)則以As(OH)3的形式在溶液中存在，其性質(zhì)類似于甘油，是一種無機(jī)多元醇，又因?yàn)锳QPs是一種雙向通道，它的孔隙可以讓甘油等分子通過，因此，As(Ⅲ)可以通過AQPs進(jìn)入細(xì)胞[9]。

2 砷在生物體中的運(yùn)輸

2.1 砷在原核生物中的運(yùn)輸 1972年，Richey等[10]證明水-甘油通道蛋白(glycerol facilitator protein,GlpF)可以促進(jìn)甘油的擴(kuò)散。1997年，Barry P. Rosen團(tuán)隊(duì)[11]首次發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中，As(Ⅲ)可以通過GlpF進(jìn)入細(xì)胞。2004年，該團(tuán)隊(duì)在缺失砷抗性操縱子arsRBC的AW3110大腸桿菌和利用轉(zhuǎn)位子TnphoA插入glpF基因建立的OSBR1突變體中，觀察As(Ⅲ)的吸收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)破壞glpF基因會(huì)大大降低As(Ⅲ)的吸收率[12]，這表明GlpF是As(Ⅲ)進(jìn)入細(xì)胞的主要吸收途徑。水-甘油通道蛋白還可與其他蛋白合作產(chǎn)生累加效應(yīng)。2008年，Singh等[13]在一種名為墨角藻的耐砷海藻中鑒定出一種砷螯合金屬硫蛋白(arsenic-chelating metallothionein，fMT)，在大腸桿菌中表達(dá)fMT時(shí)，fMT和GlpF在一起可以增加亞砷酸鹽的吸收。同時(shí)AQPs也是砷的一種外排途徑。豆科植物共生體苜蓿中華根瘤菌會(huì)利用水-甘油通道蛋白(AqpS，GlpF同系物)作為砷的解毒途徑[14]。研究表明，當(dāng)苜蓿根瘤菌暴露于As(Ⅴ)環(huán)境時(shí)，As(Ⅴ)通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，并被砷酸鹽還原酶ArsC還原為As(Ⅲ)，然后通過AqpS沿著濃度梯度流出細(xì)胞[15]。同樣，甲基亞砷酸鹽[Mas(Ⅲ)]也可通過AqpS沿著濃度梯度流入苜蓿細(xì)胞，在那里被抗Mas(Ⅲ)蛋白ArsH氧化成甲基砷酸鹽Mas(Ⅴ)，然后Mas(Ⅴ)也通過AqpS沿著濃度梯度流出細(xì)胞，是Mas(Ⅲ)的解毒途徑[15]。

因此，在原核生物中，水-甘油通道蛋白既可以吸收As(Ⅲ)，也可以外排As(Ⅲ)。如圖1所示，在大腸桿菌和苜蓿根瘤菌中，砷酸鹽都是由磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體帶入細(xì)胞的[9]。大腸桿菌arsRDABC操縱子編碼的砷伴侶蛋白ArsD與As(Ⅲ)的外排泵蛋白ArsA之間的交互作用，可以在較低的亞砷酸鹽濃度下提高其ATPase活性，提高As(Ⅲ)的排出速率[16]。Mas(Ⅲ)通過AqpS沿著濃度梯度流入苜蓿細(xì)胞，被抗Mas(Ⅲ)蛋白ArsH氧化成甲基砷酸鹽Mas(Ⅴ)，然后Mas(Ⅴ)通過AqpS沿著濃度梯度流出細(xì)胞。

圖1 砷在大腸桿菌和苜蓿中華根瘤菌的進(jìn)入和流出途徑

2.2 砷在真核生物中的運(yùn)輸 2001年，Wysocki等[17]首次發(fā)現(xiàn)釀酒酵母FPS1基因編碼的水-甘油通道蛋白Fps1p可以介導(dǎo)As(Ⅲ)的攝取，F(xiàn)PS1基因的缺失可提高對(duì)As(Ⅲ)的耐受性。Fps1p通道組成性表達(dá)的細(xì)胞對(duì)砷高度敏感。在高滲透壓條件下，當(dāng)Fps1p通道關(guān)閉時(shí)，野生型細(xì)胞顯示出與fps1Δ突變體(缺失FPS1基因)同等程度對(duì)As(Ⅲ)的耐受性。因此，F(xiàn)ps1p介導(dǎo)的通路參與酵母中類金屬的吸收。在進(jìn)一步的研究中，Maciaszczyk等[18]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入As(Ⅲ)后，為了阻止細(xì)胞吸收As(Ⅲ)，F(xiàn)PS1基因早期的表達(dá)會(huì)下調(diào)，但當(dāng)砷中毒持續(xù)存在時(shí)，它的表達(dá)反而會(huì)再次增加，F(xiàn)ps1p與亞砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Acr3p協(xié)同調(diào)節(jié)排出As(Ⅲ)。這表明Fps1p在砷的解毒中也起著生理作用。另外在酵母水通道蛋白無效突變體和非洲爪蟾卵母細(xì)胞的異源系統(tǒng)中表達(dá)了三種已知的布氏錐蟲水-甘油通道蛋白(TbAQPs)，發(fā)現(xiàn)這兩種表達(dá)系統(tǒng)中，三種TbAQPs在合適的PH下都介導(dǎo)了As(Ⅲ)在細(xì)胞內(nèi)的攝入和排出[19]，表明TbAQPs也是砷進(jìn)出細(xì)胞的通道之一。

在哺乳動(dòng)物中，1993年，Agre等[20]首次從紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了AQP1，直到目前，已發(fā)現(xiàn)13個(gè)水通道蛋白(AQP)[21]。其中水-甘油通道蛋白主要有AQP3、AQP7、AQP9和AQP10。2002年，Liu等[22]發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾卵母細(xì)胞顯微注射AQP7或AQP9 cRNA探針后，73As(Ⅲ)轉(zhuǎn)運(yùn)增加。這些結(jié)果表明，AQP9和AQP7可能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取As(Ⅲ)的主要途徑。2004年，Liu等[23]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AQP7和AQP9在釀酒酵母和卵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可以轉(zhuǎn)運(yùn)73As(Ⅲ)，并且AQP9似乎是As(Ⅲ)最有效的轉(zhuǎn)運(yùn)體。在具體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，王春等[24]使用SPF級(jí)雄性ICR小鼠研究三價(jià)砷在小鼠胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)與AQPs表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃腸組織均表達(dá)AQP3，胃組織表達(dá)水平最高，AQP9在胃組織中也表達(dá)，小腸組織表達(dá)AQP7，給予AQPs抑制劑后能抑制小鼠胃腸組織吸收砷，提示AQPs與砷在胃腸道的生物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。Hamdi等[25]從斑馬魚cDNA中克隆了5個(gè)與人AQP3，AQP9和AQP10同源的基因，將它們命名為aqps。在砷的刺激下，檢測(cè)到它們?cè)诎唏R魚多個(gè)器官中表達(dá)，表明aqps是斑馬魚中砷攝入的主要途徑。本團(tuán)隊(duì)之前的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，砷能調(diào)節(jié)AQP9的表達(dá)和磷酸化水平，表明AQP9也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中砷攝入的主要途徑[26]。

2.3 p38 MAPK蛋白激酶對(duì)AQP9表達(dá)和砷運(yùn)輸?shù)挠绊?AQP9是主要的肝臟水-甘油通道蛋白，它同時(shí)傳導(dǎo)無機(jī)As(Ⅲ)和有機(jī)單甲基亞砷酸[MMA(Ⅲ)]，MMA(Ⅲ)是細(xì)胞甲基化過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。已證明AQP9是一種參與砷吸收的跨膜蛋白[8]，它可能在無機(jī)As(Ⅲ)從血液流入肝臟和As代謝物MMA(Ⅲ)從肝臟流出到血液的過程中發(fā)揮重要作用[27]。過量表達(dá)AQP9能提高肝癌細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率，抑制AQP9表達(dá)則相反[28]。2012年，有研究首次報(bào)道利什曼原蟲水-甘油通道蛋白的活性受MAPK蛋白激酶的調(diào)節(jié)[29]。不同的AQP可以由不同的MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)。Yang等[30]研究表明，砷刺激增加了大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中的AQP3、-4、-5、-8和-9的表達(dá)，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑可減弱砷暴露后AQP3、-5和-8的表達(dá)，而p38 MAPK蛋白激酶抑制劑抑制了AQP4和AQP9的表達(dá)。鄧盧翠等[31]的研究顯示，p38 MAPK在正常肝細(xì)胞L-02中對(duì)AQP9磷酸化有一定的調(diào)控作用。這表明調(diào)節(jié)MAPKs活性將影響AQP的表達(dá)，p38 MAPK與AQP4和AQP9的表達(dá)有關(guān)聯(lián)。2013年，Johnson等[32]通過篩選釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的全套基因缺失突變體，發(fā)現(xiàn)了75個(gè)對(duì)As(Ⅲ)敏感的突變體和39個(gè)對(duì)As(Ⅲ)抗性突變體。他們首次將轉(zhuǎn)錄因子yap3p與細(xì)胞對(duì)As(Ⅲ)的解毒作用聯(lián)系在一起，證實(shí)Hog1p MAPK通路在抗砷中毒的作用[32]，Maciaszczyk等[18]也發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Hog1p可以使釀酒酵母中的Fps1p下調(diào)從而減少As(Ⅲ)的攝取。還有研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK在砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)期具有抑制作用，但也有研究顯示當(dāng)p38 MAPK受到砷刺激時(shí)，表達(dá)量也會(huì)增高，加速細(xì)胞凋亡[33]。以上研究表明p38 MAPK的表達(dá)在抗砷毒性的過程中，可能與AQP9的表達(dá)關(guān)聯(lián)緊密，但目前相關(guān)方面的研究未見較多報(bào)道，還有待深入。對(duì)于砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，p38 MAPK的作用也仍有爭(zhēng)議。

3 水甘油通道蛋白與砷運(yùn)輸對(duì)人類疾病的影響

砷作為藥物已經(jīng)有悠久的歷史。As2O3現(xiàn)在常被用作治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)。2004年，Bhattacharjee等[34]首次發(fā)現(xiàn)AQP9可以調(diào)節(jié)人白血病細(xì)胞的藥物敏感性，低劑量的As2O3與維生素D聯(lián)合使用，與避免毒性的化療方案一樣有效。他們用維生素D對(duì)HL60細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示AQP9的表達(dá)較高，并且對(duì)As(Ⅲ)和Sb(Ⅲ)有超敏性。這種敏感性歸因于隨著AQP9藥物吸收系統(tǒng)表達(dá)的增加，三價(jià)類金屬的吸收率增高。同樣，Iriyama等[35]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AQP9后，肝癌細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率高于單純As2O3組，抑制AQP9表達(dá)則相反，提示AQP9的表達(dá)增多，可增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞對(duì)As2O3化療的敏感性。這與唐潔[28]的研究結(jié)果一致。

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)和三氧化二砷(ATO)是治療APL的有效誘導(dǎo)療法。由于APL治療期間，早期血栓出血并發(fā)癥和死亡率仍然很高，為了研究ATRA啟動(dòng)時(shí)間和ATO的納入對(duì)患者預(yù)后的影響，一項(xiàng)2000—2017年期間接受APL治療的所有患者臨床記錄的回顧性研究顯示，早期運(yùn)用ATRA治療降低了APL患者的早期不良事件，ATO的加入有助于進(jìn)一步改善APL的早期和晚期預(yù)后，結(jié)果顯示ATRA和As2O3之間可能存在著協(xié)同作用[36]。Leung等[37]研究表明，ATRA預(yù)處理髓系白血病細(xì)胞株HL-60后，可上調(diào)AQP9，顯著增加砷吸收。但也有研究發(fā)現(xiàn)AQP1和AQP5是一些腫瘤增殖的參與蛋白，會(huì)減少砷類化合物在腫瘤灶內(nèi)的積蓄程度[38]。

除了治療白血病，三氧化二砷也可以聯(lián)合其他化療藥物、激素類藥物等治療其他腫瘤疾病。一項(xiàng)研究哺乳動(dòng)物砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AQPs和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)在1型糖尿病(T1DM)小鼠中的表達(dá)研究表明，AQPs的表達(dá)受胰島素水平的調(diào)節(jié)，在糖尿病模型中，胰島素降低了肝臟和大腦中AQP9基因的表達(dá)，T1DM可能增加了三價(jià)無機(jī)砷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而增加了特定組織對(duì)砷的攝取[39]。因此，了解含砷藥物的作用機(jī)制及與各類藥物的聯(lián)合作用機(jī)制，闡明藥物輸導(dǎo)的途徑及其調(diào)節(jié)因子非常重要。

4 小結(jié)

目前，大量研究均表明砷劑能夠應(yīng)用于臨床治療多種疾病，且具有較好的療效。AQPs的功能與砷在人體的代謝過程密切相關(guān)，了解AQPs與砷之間的作用機(jī)制對(duì)研究如何使用砷劑對(duì)疾病進(jìn)行靶向治療具有重要意義。然而同砷既具毒性又具藥性的性質(zhì)類似，在一定的條件下，AQPs協(xié)助砷出入細(xì)胞，既可以發(fā)揮砷治療疾病的特性，也可能會(huì)增加砷毒性在機(jī)體的累積而引起砷相關(guān)疾病。AQP在饑餓狀態(tài)下與肝細(xì)胞的糖異生水平有關(guān)，在饑餓狀態(tài)下，AQP9的表達(dá)會(huì)增加[40]，因此，在營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)攝入砷會(huì)增加發(fā)生肝砷中毒的可能[41]。Sumi等[7]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔注射As(Ⅲ)后，食道是砷高度積累的器官，其中AQP3高表達(dá)、mrp2抗體低表達(dá)、谷胱甘肽合成能力低和Nrf2通路激活少都可能增加了砷暴露對(duì)食道功能產(chǎn)生不利影響的可能性[7]。p38 MAPK信號(hào)通路等調(diào)節(jié)因子對(duì)AQPs的表達(dá)和砷對(duì)機(jī)體作用之間的相關(guān)機(jī)制也還具有爭(zhēng)議。因此，研究在砷轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用的AQPs以及多種信號(hào)通路和調(diào)節(jié)因子的相互作用機(jī)制，對(duì)研究砷的毒作用機(jī)制及藥用機(jī)制可以提供重要的依據(jù)，AQPs與p38 MAPK信號(hào)通路和砷之間的相互作用的研究也是我們繼續(xù)深入研究的方向。