王 陳，童 琪，2，周 艷，2，任少華，李 婧，2，胡 瑾，劉海燕▲

(1貴州省植物園，貴州 貴陽(yáng) 550004；2國(guó)家林業(yè)和草原局西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

0 引言

迷人杜鵑(RhododendronagastumBalf.)屬常綠灌木或小喬木，枝條粗壯，花大，呈粉紅色，產(chǎn)于云南、貴州等地，生于海拔1600～1900 m的山坡常綠闊葉林或山地灌叢中，高度可達(dá)到6.5 m，是重要的園藝觀賞花卉之一[1]。目前對(duì)迷人杜鵑的研究取得了一定的進(jìn)展，主要集中在形態(tài)分類[2]、種子萌發(fā)特性[3]、抗旱性能力[4]、化感作用[5-7]、光適應(yīng)性[8]等方面，然而對(duì)迷人杜鵑根際生態(tài)環(huán)境的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，導(dǎo)致對(duì)根系微生物的了解，知之甚少[9]。

根際是植物根系活動(dòng)對(duì)土壤影響最強(qiáng)烈、最直接的微域環(huán)境，其中土壤微生物在陸地生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用[10]。真菌是植物根際土壤中微生物的重要組成部分[11]，植物根系與土壤真菌形成的共生體被稱為菌根，既能促進(jìn)植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收及提高養(yǎng)分吸收的效率，還能保護(hù)植物免受土壤病原體入侵及增強(qiáng)抗逆性[12]。筆者以迷人杜鵑根內(nèi)與根際土壤的真菌宏基因組為研究對(duì)象，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，分析了黔中地區(qū)迷人杜鵑根內(nèi)生真菌與根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成的相似處及差異性，并初步探討了黔中地區(qū)迷人杜鵑根系真菌的多樣性，為優(yōu)化杜鵑的病害預(yù)防與生長(zhǎng)管理提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

采樣區(qū)位于貴州省貴陽(yáng)市云巖區(qū)貴州省植物園，地處東經(jīng)106 °42′、北緯36 °24′，年均溫15.2 ℃，年降水量為1200 mm，年平均相對(duì)濕度80%，海拔在1100～1200 m之間，園內(nèi)杜鵑以馬纓杜鵑與迷人杜鵑為主。在采集區(qū)內(nèi)隨機(jī)選擇相鄰3棵迷人杜鵑根系微生物，采集3個(gè)樣品間隔距離約為50 m。

首先將迷人杜鵑根系上方雜草及周圍土壤全部清開(kāi)，然后用土壤刀沿著植株基部慢慢挖出細(xì)根，用無(wú)菌土壤刷采集根圍的土壤(距離根圍 0～5 mm)作為根際土，將其裝入無(wú)菌采樣袋中。再剪去部分根部樣品放入另一個(gè)無(wú)菌采集袋中。4 ℃左右保存帶回實(shí)驗(yàn)室，樣品分別置于-80 ℃下凍存。其中根內(nèi)生真菌為TMA，根際土壤真菌為TMB。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 根樣中真菌基因組DNA提取

稱取采集的根際土壤0.5 g，參照Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明，提取樣品宏基因組；將迷人杜鵑根系表層剝離去除，留下根內(nèi)部分剪碎混合，運(yùn)用差速離心法收集菌群，再按Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明提取宏基因組。提取的DNA經(jīng)Bio-Tek微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)完整性、濃度和質(zhì)量，檢測(cè)合格后可以進(jìn)行真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增。

1.2.2 根系真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增測(cè)序

以提取的宏基因組為模板，擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)，將PCR產(chǎn)物送至生物技術(shù)公司(生工生物工程上海股份有限公司)，基于Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。根據(jù)測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)，進(jìn)行質(zhì)量控制分析，然后利用QIIME軟件去除低質(zhì)量及有嵌合體序列，獲得有效序列，并合并。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于Ucluster算法，以序列相似度≥97%為閾值，將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來(lái)對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為閾值分成操作分類單元(OTU)，并根據(jù)各樣本在OTU的分布情況繪制韋恩圖。計(jì)算Shannon/Simpson/Coverage等物種多樣性指數(shù)，并制作所有樣品Shannon/Simpson/Richness指數(shù)的稀釋性曲線。根據(jù)物種分類單元和樣本豐度矩陣，利用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)篩選樣本組間的差異物種分類單元，繪制誤差線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷人杜鵑根系樣品的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

稀釋性曲線采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目來(lái)構(gòu)建曲線[13]。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。結(jié)果表明(圖1)，在使用97%相似度的OTU水平上，斜率起先快速增加而后漸漸減慢，最終逐漸趨于平坦，說(shuō)明該測(cè)序數(shù)據(jù)量基本合理，能較準(zhǔn)確地反映樣品中真菌群落的豐富度與多樣性。

香濃指數(shù)利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，用以反映在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性[14]。曲線越平緩說(shuō)明測(cè)序數(shù)量足夠多，能有效反映樣本中大多數(shù)微生物信息。由圖2可知，在97%的相似度水平上，起初2個(gè)樣品曲線直線上升，隨著測(cè)序數(shù)量的增大，曲線直接進(jìn)入平緩，表明測(cè)序接近飽和，可以反映出2個(gè)樣品中絕大部分的真菌群落信息。

圖1 根系真菌的稀釋性曲線Fig.1 The dilution curve of root fungi

圖2 根系真菌的Shannon-Wiener曲線Fig.2 The Shannon-Wiener curve of root fungi

2.2 迷人杜鵑根系真菌的群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)高通量測(cè)序方法對(duì)黔中地區(qū)迷人杜鵑根內(nèi)與根外真菌群落組成進(jìn)行結(jié)果分析，共獲得有效序列116921條，按照97%的相似閾值對(duì)有效序列進(jìn)行聚類，得出迷人杜鵑根系共有775個(gè)真菌OTUs，韋恩圖(圖3)顯示，迷人杜鵑根內(nèi)生真菌OTU總數(shù)367個(gè)，根際土壤真菌OTU總數(shù)652個(gè)，共有真菌OTU數(shù)244個(gè)，表明根內(nèi)與根外真菌OTU值數(shù)量差異較大，根際土壤中單獨(dú)富集的真菌菌群數(shù)量最多。

圖3 共有分類單元(OTU)的Venn圖Fig.3 Venn diagram of OTU

經(jīng)聚類，根內(nèi)生真菌367個(gè)OTU分屬于8門、20綱、38目、71科、93屬(圖4)，優(yōu)勢(shì)菌群分屬于8門真菌：Ascomycota(93.29%)、Basidiomycota(3.28%)、unclassified(2.49%)、Mortierellomycota(0.72%)、unclassified-Fungi(0.17%)、Chytridiomy cota(0.02%)、Rozellomycota(0.01%)、Mucoromycota(0.01%)。根際土壤真菌652個(gè)OTU分屬于11門、25綱、50目、85科、114屬(圖5)，優(yōu)勢(shì)菌群分屬于11門真菌：Ascomycota(84.60%)、Basidiomycota(9.32%)、unclassified(3.69%)、Mortierellomycota(1.71%)、unclassified-Fungi(0.29%)、Glomeromycota(0.19%)、Rozellomycota(0.09%)、Chytridiomycota(0.06%)、Mucoromycota(0.04%)、Cercozoa(0.01%)、Zoopagomycota(0.01%)。根系真菌中Ascomycota均占比最高，其中根內(nèi)真菌豐度比例較根外真菌更高。

圖4 迷人杜鵑根內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 The community structure of endophytic fungi in the root of Rhododendron agastum

根內(nèi)生真菌8個(gè)菌門分類鑒定得到20綱，其中鑒別出豐度較高的8個(gè)綱分別為：Archaeorhizomycetes(61.96%)、Leotiomycetes(14.98%)、Eurotiomycetes(7.57%)、Sordariomycetes(5.57%)、Agaricomycetes(2.80%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Dothideomycetes(1.12%)。根際土壤真菌11個(gè)菌門分類鑒定得到25綱，其中豐度較高的8個(gè)綱分別為：Archaeorhizomycetes(75.52%)、Agaricomycetes(7.99%)、unclassified(3.69%)、Leotiomycetes(2.98%)、Sordariomycetes(2.41%)、Dothideomycetes(1.90%)、Mortierellomycetes(1.71%)、Tremellomycetes(1.08%)。根系真菌中Archaeorhizomycetes均占比最高，其中根外真菌豐度比例較根內(nèi)真菌更高。

圖5 迷人杜鵑根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 The community structure of fungi in rhizosphere soil of Rhododendron agastum

根內(nèi)生真菌38目中豐度較高的10個(gè)目依次為：Archaeorhizomycetales(61.96%)、Helotiales(14.47%)、Chaetothyriales(7.56%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Sordar-iomycetes(1.74%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Hypocreales(1.55%)、Sebacinales(1.32%)、Sordariales(1.21%)、Auriculariales(1.08%)。根際土壤真菌50目中豐度較高的10個(gè)目依次為：Archaeorhizomycetales(75.52%)、Sebacinales(5.98%)、unclassified(3.69%)、Helotiales(2.35%)、Mortierellales(1.71%)、Hypocreales(1.56%)、Pleosporales(1.53%)、Agaricales(1.52%)、unclassified-Ascomycota(0.95%)、Tremellales(0.63%)。根系真菌中Archaeorhizomycetales均占比最高，其中根外真菌豐度比例較根內(nèi)真菌更高。

根內(nèi)生真菌71科中豐度較高的10個(gè)科：Archaeorhizomycetaceae(61.96%)、Leotiaceae(7.10%)、unclassified-Helotiales(5.84%)、unclassified-Chaetothyriales(4.19%)、Herpotrichie-llaceae(3.36%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Sordariomycetes(1.74%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Hyaloscyphaceae(1.35%)、unclassified-Auriculariales(1.08)。根際土壤真菌85科中豐度較高的10個(gè)科：Archaeorhizomycetaceae(75.52%)、Serendipitaceae(3.83%)、unclassified(3.69%)、unclassified-Sebacinales(2.15%)、Mortierellaceae(1.68%)、Leotiaceae(1.23%)、Massarinaceae(1.14%)、unclassified-Helotiales(0.98%)、unclassified-Ascomycota(0.95%)、Clavariaceae(0.86%)。根系真菌中Archaeorhizomycetaceae均占比最高，其中根外真菌豐度比例較根內(nèi)真菌更高。

根內(nèi)生真菌93屬中豐度較高的10個(gè)屬：Archaeorhizomyces(61.96%)、Pezoloma(7.10%)、unclassified-Helotiales(5.84%)、unclassified-Chaetothyriales(4.19%)、Cladophialophora(3.12%)、unclassified(2.49%)、unclassified-Sordariomycetes(1.74%)、unclassified-Ascomycota(1.68%)、Hyaloscypha(1.35%)、unclassified-Auriculariales(1.08)。根際土壤真菌114屬中豐度較高的10個(gè)屬：Archaeorhizomyces(75.52%)、unclassified(3.69%)、unclassified-Serendipitaceae(3.43%)、unclassified-Sebacinales(2.15%)、Mortierella(1.68%)、Pezoloma(1.23%)、Massarina(1.14%)、unclassified-Helotiales(0.98%)、unclassified-Ascomycota(0.95%)、Clavaria(0.86%)。根系真菌中Archaeorhizomyces均占比最高，其中根外真菌豐度比例較根內(nèi)真菌更高。

2.3 迷人杜鵑根系菌群差異性分析

由圖6、圖7可知，迷人杜鵑根系真菌菌門與菌屬豐度比例存在顯著差異(P<0.05)。9個(gè)門的真菌從根際進(jìn)入根內(nèi)時(shí)，8個(gè)豐度比例出現(xiàn)顯著下降，1個(gè)豐度比例出現(xiàn)顯著上升，且Ascomycota豐度比例差異最大。其中Basidiomycota、Mortierellomycota、unclassified、Glomeromycota、Rozellomycota、unclassified-Fungi、Chytridiomycota、Mucoromycota富集于根際，通過(guò)根表到根內(nèi)后出現(xiàn)顯著下降；Ascomycota富集于根內(nèi)，通過(guò)根表到根內(nèi)后出現(xiàn)顯著上升。同時(shí)，25個(gè)屬的真菌從根際進(jìn)入根內(nèi)時(shí)11個(gè)屬豐度比例出現(xiàn)顯著下降，14個(gè)屬豐度比例出現(xiàn)顯著上升，且Archaeorhizomyces豐度比例差異最大。其中Archaeorhizomyces、unclassified-Serendipitaceae、unclassified-Sebacinales、Massarina、Clavaria、Saitozyma、unclassified-Ceratobasidiaceae、Mortierella、Delicatula、unclassified-Hypocreales、unclassified富集于根際，通過(guò)根表到根內(nèi)后出現(xiàn)顯著下降；Pezoloma、unclassified-Helotiales、unclassified-Chaetothyriales、Cladophialophora、unclassified-Auriculariales、Hyaloscypha、unclassified-Sordariomycetes、unclassified-Sordariales、unclassified-Lecanorales、Cephalotheca、unclassified-Basidiomycota、Atractospora、Clonostachys、Serendipita富集于根內(nèi)，通過(guò)根表到根內(nèi)后出現(xiàn)顯著上升。

圖6 迷人杜鵑在門水平上根系真菌差異比較圖(P<0.05)Fig.6 Comparison of root fungi in Rhododendron agastum at phylum level

圖7 迷人杜鵑在屬水平上根系真菌差異比較圖(P<0.05)Fig.7 Comparison of root fungi in Rhododendron agastum at genus level

3 結(jié)論與討論

根系真菌的多樣性對(duì)于植物的多樣性、生態(tài)系統(tǒng)的變異性和生產(chǎn)量起到了決定性的作用[15]。通過(guò)高通量測(cè)序分析取得迷人杜鵑根系真菌DNA序列116921條，聚類后得出迷人杜鵑根系共有775個(gè)真菌OTUs，其中根內(nèi)生真菌367個(gè)OTU分屬于8門、20綱、38目、71科、93屬，根際土壤真菌652個(gè)OTU分屬于11門、25綱、50目、85科、114屬。根際土壤菌群OTU數(shù)量最大，說(shuō)明受外界環(huán)境因子的影響，根際土壤真菌菌群多樣性最為豐富。迷人杜鵑根系真菌優(yōu)勢(shì)菌群主要為Ascomycota(子囊菌門)和Basidiomycota(擔(dān)子菌門)，其中子囊菌門有Archaeorhizomycetes(古生菌綱)、Leotiomycetes(錘舌菌綱)、Eurotiomycetes(散囊菌綱)、Sordariomycetes(糞殼菌綱)等；擔(dān)子菌門有Agaricomycetes(傘菌綱)、Mortierellomycetes(被孢霉綱)等，與熊丹等[16]研究結(jié)果大致相同。Ascomycota(子囊菌門)和Basidiomycota(擔(dān)子菌門)為迷人杜鵑根系真菌中的優(yōu)勢(shì)群類，研究表明在韭菜[17]、竹葉蘭[18]、枸杞[19]等植物根系真菌中子囊菌門均為優(yōu)勢(shì)菌群，這與迷人杜鵑根系真菌群落能分離具有的菌根關(guān)系密切。

根系微生物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)于植物的健康起到了決定性的作用，植物抗逆性與根系微生物群落的集體基因組聯(lián)系緊密[20]。在此生境場(chǎng)所中微生物易受到土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、植物種類、氧氣等多種外部環(huán)境因子的影響，且該區(qū)域的微生物種類豐富，會(huì)產(chǎn)生明顯的根際效應(yīng)[21]。通過(guò)根系分泌物，不同種類的植物會(huì)對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)以及土壤微生物多樣性產(chǎn)生不同的影響[22]。本研究對(duì)迷人杜鵑根系真菌群落進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：迷人杜鵑根系分泌物對(duì)真菌群落的多樣性存在著一定的抑制作用，根內(nèi)與根外真菌OTU值數(shù)量差異較大。同時(shí)根際與根內(nèi)不同的生態(tài)位決定了菌群結(jié)構(gòu)的差異，在門水平上，豐度比例最高的Ascomycota(子囊菌門)通過(guò)根表到根內(nèi)后出現(xiàn)顯著上升，其余均出現(xiàn)顯著下降。在屬水平上，豐度比例最大的Archaeorhizomyces通過(guò)根表到根內(nèi)后出現(xiàn)顯著下降，其余從根表進(jìn)入根內(nèi)時(shí)10個(gè)屬出現(xiàn)顯著下降，14個(gè)屬豐度比例出現(xiàn)顯著上升，說(shuō)明生態(tài)位對(duì)真菌群落差異的影響是顯著性的[23]，生態(tài)位的差異促進(jìn)了菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)的多樣化。然而迷人杜鵑根系分泌物的成分、種源的差異以及生長(zhǎng)地的不同氣候因子都會(huì)對(duì)杜鵑根系微生物的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[24]，深入分析杜鵑根系微生物群落與外部因子的相關(guān)性也是今后研究工作的方向之一。

黔中地區(qū)迷人杜鵑根系土壤真菌多樣性較豐富，根內(nèi)生真菌與根際土壤真菌OTU值數(shù)量差異較大，且根際土壤真菌菌群多樣性更為豐富。Ascomycota(子囊菌門)和Basidiomycota(擔(dān)子菌門)為根系真菌中的優(yōu)勢(shì)群類，與其他植物根系真菌優(yōu)勢(shì)菌群一致。同時(shí)受不同生態(tài)位的影響，根內(nèi)與根外真菌群落間存在顯著性差異。