趙澤林，吳 瓊，張麗艷，李 軍，周 祥，馬四補

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

0 引言

參芪茯苓片由貴州中醫(yī)藥大學與貴州廣濟堂藥業(yè)有限公司聯(lián)合研制以增強免疫力功能為目的的保健食品，由黨參、黃芪、茯苓等中藥組成，可用于免疫力低下人群。黃芪的主要有效成分為黃芪皂苷。研究表明，黃芪的化學成分有多糖類、皂苷類、黃酮類、生物堿類等[1]。黃酮類大約40種，主要包括4大類[2-3]：黃酮、異黃烷、異黃酮、紫檀烷；多糖類的組成主要是葡聚糖和雜多糖[4]；皂苷類包括黃芪皂苷Ⅰ～Ⅷ、黃芪皂苷甲、黃芪皂苷乙、大豆皂苷等40多種[5]。馬曉豐[6]從蒙古黃芪中分離鑒定得到黃芪堿A～F。黃芪中還含有大量的微量元素，如Se、Cr、Cu、Zn、Mn、Co等[7]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪具有免疫調節(jié)[8-10]、抗腫瘤[11-12]、延緩衰老[13]、神經(jīng)保護以及其他[14-16]抗疲勞、抗病毒、肝臟保護等藥理作用。本實驗采用(UPLC-ELSD)法測定參芪茯苓片中黃芪甲苷的含量，為進一步研究提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

美國Water 2695液相色譜儀(四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進樣系統(tǒng)、柱溫箱、二極管陣列檢測器)，AL204-IC萬分之一分析天平(METTLE RTOLEDO儀器有限公司)，HH-4型四孔電熱恒溫水浴鍋(常州華普達教學儀器有限公司)；XS205型電子分析天平(瑞士梅特公司)；800C型粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)；80-2電動離心機(常州普天儀器制造公司)。

1.2 試劑與儀器

黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110781-201616，含量為97.4%)，甲醇為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)，氨水為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)，乙腈(美國TEDIA公司)，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent proshell C18色譜柱；流動相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0 min～20 min(95%A～23%A)；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；漂移管溫度：40 ℃；氣體壓力：30 psi；增益：30；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應不低于4000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對照品20.03 mg，加入80%甲醇溶液10 mL，定容至刻度，得黃芪甲苷對照品溶液，精密吸取1 mL的黃芪甲苷對照品溶液于10 mL容量瓶中，再加入80%甲醇溶液混勻，定容至刻度，即得濃度為0.2003 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶內(nèi)，加4%濃氨試液80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL，加80%甲醇至100 mL，搖勻，即得)50 mL，密塞，稱重，加熱回流1 h，放冷，補足重量，濾過，取濾液25 mL，蒸干，殘渣加80%甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測定法

精密吸取對照品溶液1 μL、4 μL，供試品溶液2 μL，注入超高效液相色譜儀，測定，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性

取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液、陰性空白樣品溶液各2 μL，分別注入超高效液相色譜儀進行測定。對照品溶液及供試品溶液結果如圖1～圖2：供試品溶液與對照品溶液保留時間相同，色譜峰相同，空白樣品溶液無干擾。

圖1 黃芪甲苷對照品溶液Fig.1 Astragaloside IV reference solution

圖2 供試品溶液Fig.2 Test sample solution

2.3.2 線性

精密吸取“2.2.1”項下的黃芪甲苷對照品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL，注入液相色譜儀，進行測定。質量對數(shù)(X)為橫坐標，峰面積對數(shù)(Y)為縱坐標進行線性回歸。

表1 黃芪甲苷標準曲線Tab.1 Standard curve of astragaloside IV

圖3 黃芪甲苷標準曲線圖Fig.3 Standard curve of astragaloside IV

結果表明，黃芪甲苷在0.2003～1.0015 μg范圍內(nèi)呈良好線性關系，線性回歸方程：Y=1.9225x+4.6687，R2=0.9998。

2.3.3 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下的黃芪甲苷對照品溶液2 μL，依次重復進樣6次，記錄其峰面積分別為5156、4887、5239、5130、5036、5293。RSD為2.85%，表明儀器精密度較好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

精密稱取供試品粉末約10 g，按“2.2.2”項下制備成供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進樣，峰面積分別為11301、11694、11633、11129、11584、11734。實驗結果RSD為2.10%，說明該樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.5 重復性試驗

稱取本品粉末(n=6)，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，進行測定，記錄峰面積。結果表明，6份樣品中黃芪甲苷含量均值為0.2493 mg/g，RSD為1.14%，表明重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

稱取本品粉末約5.0 g(含量：0.2493 mg/g)，精密稱定(n=6)，分別加入對照品(1.2018 mg)，按“2.2.2”項制備供試品試液，實驗結果見表2，回收率均值為103.18%，RSD為0.57%。

表2 加樣回收試驗結果Tab.2 Spiked recovery rate results

2.4 樣品含量測定

取三批參芪茯苓片樣品，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，進行測定，結果見表3。

表3 樣品含量測定Tab.3 Results of the content determination

由結果可知，3批參芪茯苓片中黃芪甲苷的平均含量為0.2435 mg/g(即24.35 mg/100 g)。

3 討論

3.1 儀器的選擇

UPLC法和HPLC法相比較有諸多優(yōu)點，如UPLC法體現(xiàn)出分離度高、結果準確、分析速度快等優(yōu)點，鑒于其優(yōu)點本研究采用超高效液相色譜法進行實驗。

3.2 流動相選擇

本實驗通過考察不同體系流動相(水-甲醇，水-乙腈，0.1%磷酸水-甲醇，0.1%磷酸水-乙腈)對參芪茯苓片中黃芪甲苷含量的影響，結果發(fā)現(xiàn)當流動相為水-乙腈時，黃芪甲苷分離度好且峰型對稱，因此確定水-乙腈為流動相。

3.3 等度與梯度選擇

考察了水-乙腈(61∶39)等度洗脫，水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0 min～20 min(95%A～23%A)，結果發(fā)現(xiàn)等度洗脫時，黃芪甲苷出峰時間雖較梯度洗脫早，但樣品的黃芪甲苷峰型不穩(wěn)定，故確定為梯度洗脫。

4 結論

近年來隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的工作與生活方式也逐漸趨于快節(jié)奏，各種各樣的壓力導致亞健康人群愈來愈龐大，機體免疫力呈現(xiàn)下降趨勢。參芪茯苓片的研發(fā)從營養(yǎng)科學方面著手，以改善亞健康，提升免疫力為目的，為亞健康人群提供選擇參考。參芪茯苓片的主成分之一黃芪含有黃酮、多糖等多種化學成分，對機體有補氣固表、利尿、斂瘡生肌、脫毒等功效[17]，文獻表明黃芪在調節(jié)機體免疫、促進機體代謝等方面有較強作用[18]。該實驗采用UPLC-ELSD法對參芪茯苓片中黃芪甲苷的含量進行測定，結果表明實驗方法精密度、穩(wěn)定性、重復性均符合要求，本實驗為后續(xù)研究黃芪甲苷相關功效及功能性食品開發(fā)奠定基礎。