吳 瓊，周永欣，趙澤林，張麗艷，李 軍，馬四補(bǔ)

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

藍(lán)布正為薔薇科水楊梅屬植物路邊青或柔毛路邊青的干燥全草。因形態(tài)、功效方面相似相同，又稱為頭暈藥，別名追風(fēng)七、水楊梅等[1-2]。貴州地區(qū)分布多為柔毛路邊青。

藍(lán)布正為我國民間傳統(tǒng)中藥材，在我國眾多少數(shù)民族中皆有廣泛使用，其中貴州苗族用來治療“眩暈病”效果明顯。除此之外還可用于小兒驚風(fēng)、高血壓、腰腿疼痛等癥狀?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗高血壓等藥理作用[3]。目前市場上藍(lán)布正已有相應(yīng)的民族藥或中藥等制劑如追風(fēng)七湯[4]、藍(lán)芷安腦膠囊[5]、云實(shí)感冒合劑[6]、感清糖漿[7]等。

1 材料

1.1 儀器與試劑

RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、UV2501PC紫外分光光度計(jì)(日本島津)、Tharmo ST16R臺式高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)、XS205電子分析天平(瑞士梅特公司)、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖(分析純，重慶川東化工有限公司)。

1.2 藥材來源

實(shí)驗(yàn)藥材藍(lán)布正產(chǎn)自貴州省安順市，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)王波教授鑒定為薔薇科水楊梅屬植物的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

供試品溶液：稱取藍(lán)布正樣品5 g，加入適量的水浸泡，加熱回流提取兩次，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至50 mL，取1 mL濃縮液加入4 mL無水乙醇沉淀，靜置12 h，4000 r/min離心5 min，加水至10 mL使沉淀完全溶解，即得。

對照品溶液：稱取無水葡萄糖50.30 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度定容，搖勻，再吸取5 mL稀釋定容至50 mL，制得0.1006 mg/mL的葡萄糖對照品溶液，備用。

5%苯酚溶液：稱取苯酚5.0021 g，加少量水定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻，冷藏儲存。

2.2 檢測波長的確定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液0.8 mL，加水至2 mL，滴加1 mL 5%苯酚、5 mL濃硫酸，于沸水浴20 min，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑作為空白，在波長350～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定483 nm為最大吸收波長。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，精密吸取對照品溶液0.2 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，加蒸餾水分別定容至2 mL，于483 nm吸收波長下進(jìn)行測定。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。得回歸方程y=53.9164x+0.0038(R2=0.9993)。由此得到葡萄糖溶液濃度在0.00252～0.01509 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1”項(xiàng)下1.0 mL葡萄糖對照品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，連續(xù)6次測定吸光度。結(jié)果表明，RSD為0.32%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取藍(lán)布正樣品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min時測定吸光度，計(jì)算吸光度RSD。結(jié)果表明，吸光度RSD為0.26%(n=6)，表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取藍(lán)布正樣品適量(n=6)，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定吸光度，結(jié)果表明，多糖含量RSD為0.47%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量樣品6份，精密稱定，加入適量的對照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，多糖平均加樣回收率為100.60%，RSD為1.02%(n=6)。

2.4 單因素考察

2.4.1 浸泡時間

精密稱取藍(lán)布正樣品5 g，各5份，加入10倍量的水，分別浸泡20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，加熱回流提取60 min，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，計(jì)算多糖含量。試驗(yàn)證明，浸泡60 min時多糖含量最高為10.22 mg/g，如圖2。

圖2 浸泡時間對黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖含量的影響Fig.2 Influence of soaking time on the content of water-soluble polysaccharide in Herba Gei

2.4.2 料液比

精密稱取藍(lán)布正樣5 g，各5份，分別加入10倍，15倍，20倍，25倍，30倍量的水，浸泡60 min，加熱回流提取60 min，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，計(jì)算多糖含量。試驗(yàn)證明，料液比為15倍量水時多糖含量最高為11.11 mg/g，如圖3。

圖3 料液比對黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖含量的影響Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on the content of water-soluble polysaccharide in Herba Gei

2.4.3 提取時間

精密稱取藍(lán)布正樣品5 g，各5份，加入15倍量水，浸泡60 min，分別加熱回流提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，按“2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，計(jì)算多糖含量。試驗(yàn)證明，提取60 min時多糖含量最高為12.70 mg/g，如圖4。

圖4 提取時間對黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖含量的影響Fig.4 Influence of extraction time on the content of water-soluble polysaccharide in Herba Gei

2.5 Box-Behnken法優(yōu)化藍(lán)布正多糖提取工藝研究

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以A、B、C3個影響因素為自變量，藍(lán)布正多糖含量為響應(yīng)值Y，采用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過17個實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝條件，Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Box-Behnken test factors and levels

2.5.2 響應(yīng)面方案與試驗(yàn)結(jié)果

利用響應(yīng)面軟件Design-Expert8.0.6設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，測定總多糖含量，得到回歸模型方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Box-Behnken test results and analysis

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，Y對各因素的回歸方程為：

Y=+13.11+0.26A+0.20B+0.024C-0.46AB-0.44AC-0.10BC-1.36A2-2.75B2-2.99C2。

表3 響應(yīng)面二次模型總多糖含量的方差和回歸系數(shù)分析Tab.3 Analysis of variance and regression coefficient of total polysaccharide content in response surface quadratic model

顯著性結(jié)果顯示：A2、B2、C2項(xiàng)(P<0.01)對總多糖含量均有極顯著影響；AB項(xiàng)(P<0.05)對總多糖含量影響顯著；A、B、C項(xiàng)(P值分別為0.0857、0.1646、0.8616)對總多糖含量影響不顯著。

2.5.3 響應(yīng)面交互分析

響應(yīng)面曲面的陡峭程度反映兩因素間的交互作用；等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素的交互作用顯著，圓形則相反[8-9]。文獻(xiàn)研究表明[10-12]，在響應(yīng)面圖中，如果曲面呈現(xiàn)越陡峭的趨勢，則該因素對其的影響越大。

由圖5可知，浸泡時間(A)-料液比(B)、浸泡時間(A)-提取時間(C)、料液比(B)-提取時間(C)交互作用對黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖含量影響的響應(yīng)面均為一個向下的曲面。其中，交互項(xiàng)AB的響應(yīng)面坡度較為陡峭，等高線圖呈橢圓形，說明浸泡時間(A)與料液比(B)交互作用最強(qiáng)，影響顯著；而交互項(xiàng)AC、BC等高線圖呈現(xiàn)的橢圓形程度較小，特別是BC的交互作用等高線圖近乎呈圓形，說明浸泡時間(A)-提取時間(C)、液比(B)-提取時間(C)交互作用不顯著。

圖5 各因素交互作用對總多糖含量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour diagrams of interaction of various factors influencing the total polysaccharide content

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)條件：浸泡時間61.86 min、料液比1∶15.14(g/mL)、提取時間59.91 min，多糖含量為13.1178 mg/g。依據(jù)實(shí)際操作條件浸泡時間60 min、料液比15倍(g/mL)、提取時間60 min，多糖含量為13.10867(mg/g)。響應(yīng)面優(yōu)化后的條件與實(shí)際操作條件相差較小，實(shí)驗(yàn)所得實(shí)際值與預(yù)測值之間相差較小，驗(yàn)證了該響應(yīng)面模型的有效性。因此，響應(yīng)面法對黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖的最佳優(yōu)化工藝為浸泡時間60 min、料液比15倍(g/mL)、提取時間60 min。

分別稱取三批藍(lán)布正藥材5 g，根據(jù)優(yōu)化條件提取，按照“2.2”項(xiàng)下方法測定吸光度，總多糖平均含量分別為13.10 mg/g、13.08 mg/g、13.09 mg/g。

2.7 15批藍(lán)布正藥材多糖含量測定結(jié)果

根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下制備標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)：得回歸方程y=56.292x-0.0087(R2=0.9996)。在0.00252～0.01509 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。15批藍(lán)布正多糖含量范圍為6.08～13.05 mg/g，遵義1(8.18 mg/g)、遵義2(8.79 mg/g)、遵義3(9.54 mg/g)、貴陽1(7.28 mg/g)、貴陽2(6.08 mg/g)、貴陽3(6.53 mg/g)、畢節(jié)1(7.72 mg/g)、畢節(jié)2(8.47 mg/g)、畢節(jié)3(8.43 mg/g)、安順1(13.05 mg/g)、安順2(12.90 mg/g)、安順3(12.83 mg/g)、織金1(12.28 mg/g)、織金2(11.62 mg/g)、織金3(11.21 mg/g)。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Standard curve

3 總結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)以黔產(chǎn)藍(lán)布正藥材為原料，以水為溶劑提取黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖類成分，以浸泡時間、料液比和提取時間為考察因素，采用響應(yīng)面法對黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性總多糖的提取工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，得出最佳提取工藝為：浸泡時間60 min、料液比1∶15(g/mL)、提取時間60 min，總提取量達(dá)到13.12(mg/g)，該模型具有良好的顯著性。

測定多糖含量的有效方法是苯酚-硫酸法和紫外-可見分光光度法兩者結(jié)合，即多糖與濃硫酸反應(yīng)生成糠醛衍生物，再與苯酚生成有色物質(zhì)，測定其吸光度[13-14]。該實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法雖試驗(yàn)次數(shù)多，但從整體考慮三維圖分析更直觀，更加精確，克服了其他如正交試驗(yàn)預(yù)測性差、精度較低等缺點(diǎn)[15]。

實(shí)驗(yàn)中以黔產(chǎn)藍(lán)布正總多糖含量測定實(shí)測值的平均值作為參考值，再通過工藝驗(yàn)證黔產(chǎn)藍(lán)布正的總多糖含量，驗(yàn)證響應(yīng)面模型的有效性。

綜上所述，黔產(chǎn)藍(lán)布正水溶性多糖可通過水提方法優(yōu)化提取，該優(yōu)化方法提取含量高、工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。