李明駿， 鐘源， 廖豪杰， 吳根土， 青玲

西南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/植物病害生物學(xué)高校市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400716

玉米(ZeamaysL.)是我國(guó)廣泛種植的糧飼作物,也是重要的生物能源和工業(yè)原料,在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[1].隨著我國(guó)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和氣候變暖導(dǎo)致的媒介昆蟲大面積遷飛和分布,玉米矮花葉病、 玉米粗縮病、 玉米致死性壞死病等病毒病害在我國(guó)一些玉米種植區(qū)間歇性大面積發(fā)生.目前在我國(guó)玉米上已檢測(cè)出甘蔗花葉病毒(sugarcane mosaic virus,SCMV)、 水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)、 玉米褪綠斑駁病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV)、 玉米黃花葉病毒(maize yellow mosaic virus,MaYMV)、 留尼旺玉米線條病毒(maize streak Reunion virus,MSRV)等12種病毒,嚴(yán)重威脅著我國(guó)玉米的生產(chǎn)[2].甘蔗(SaccharumofficinariumL.)在四川、 云南、 廣東和福建等地區(qū)廣泛種植,是我國(guó)最重要的糖料作物,也是生產(chǎn)葡萄糖、 乙醇等產(chǎn)品的重要原料.甘蔗上的常發(fā)病毒病主要包括SCMV、 高粱花葉病毒(sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗線條花葉病毒(sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)引起的甘蔗花葉病,甘蔗黃葉病毒(sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)引起的甘蔗黃葉病,以及甘蔗線條病毒(sugarcane streak virus,SSV)、 甘蔗斐濟(jì)病病毒(sugarcane Fiji disease virus,SFDV)和甘蔗桿狀病毒(sugarcane bacilliform virus,SCBV)等引起的病毒病[3]．

SCMV在我國(guó)廣泛分布,其引起的玉米矮花葉病和甘蔗花葉病是我國(guó)玉米和甘蔗上的兩種重要病毒病害[4-5].SCMV是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員,經(jīng)由玉米蚜、 麥二叉蚜等多種蚜蟲以非持久性方式進(jìn)行傳播,是侵染玉米、 高粱、 甘蔗等禾本科植物的重要病毒病原[6-8].SCMV侵染可誘導(dǎo)花葉、 褪綠和矮化等多種癥狀,最終造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[9-10].SCMV為線狀病毒粒體,包裹1條長(zhǎng)約10 000堿基且3′末端有poly(A)結(jié)構(gòu)的正單鏈RNA基因組[11].SCMV基因組編碼1個(gè)大的多聚蛋白,隨后被切割為10個(gè)成熟蛋白以及轉(zhuǎn)錄滑移所產(chǎn)生的P3N-PIPO蛋白[12].馬鈴薯Y病毒屬病毒編碼的外殼蛋白(CP)是一個(gè)多功能蛋白,參與病毒基因組的包被、 病毒移動(dòng)、 蚜蟲傳播等生物學(xué)過程[13-14].因?yàn)橥鈿さ鞍谆蚬δ芎托蛄械谋Ｊ匦?通常被用于病毒分類和病毒變異、 重組等遺傳進(jìn)化研究[8，15]．

病毒檢測(cè)和病毒群體的遺傳變異分析有利于了解病毒的地理分布和寄主適應(yīng)性,且有益于對(duì)病毒病流行趨勢(shì)進(jìn)行評(píng)估,是病毒病害防控的重要手段[16-18].玉米是我國(guó)西南地區(qū)廣泛種植的重要糧飼作物,甘蔗是四川和云南部分地區(qū)種植的重要經(jīng)濟(jì)作物,但病毒病的發(fā)生嚴(yán)重威脅著玉米和甘蔗的生產(chǎn).基于本課題組前期對(duì)四川玉米和甘蔗病毒病田間調(diào)查結(jié)果,本研究從四川攀枝花市采集共計(jì)54份表現(xiàn)花葉、 斑駁、 矮化等癥狀的玉米病葉和42份甘蔗病葉,以小RNA高通量測(cè)序結(jié)合反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法對(duì)玉米和甘蔗病樣中的病毒種類和發(fā)生率進(jìn)行檢測(cè)； 并擴(kuò)增獲得四川玉米上6個(gè)和甘蔗上5個(gè)SCMV分離物的CP基因序列,綜合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的SCMV所有中國(guó)分離物CP基因序列分析SCMV四川分離物群體的遺傳變異情況．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒源

分別于2019年7月和2020年8月從四川攀枝花田間采集表現(xiàn)花葉、 褪綠、 斑駁、 矮化等癥狀的玉米病葉樣品54份和甘蔗病葉42份,保存于-80 ℃冰箱中．

1.1.2 載體和菌株

克隆載體pMDTM19-T,日本TaKaRa公司； 大腸桿菌EscherichiacoliTrans5α,北京全式金生物技術(shù)有限公司．

1.1.3 主要試劑

Ex Taq?DNA聚合酶,RNAiso Plus總RNA提取試劑,M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒,T4 DNA連接酶,日本TaKaRa公司； 通用型DNA純化回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司．

1.1.4 引物

本研究中所用引物序列信息見表1,SCMV檢測(cè)引物引自文獻(xiàn)[19],其他檢測(cè)引物和SCMVCP基因擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中多個(gè)病毒分離物基因組序列多重比對(duì)分析后在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)．

表1 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及RT-PCR

取玉米或甘蔗病葉約0.1 g,充分研磨后用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑參照說明書流程提取總RNA,-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

以提取的總RNA為模板,用TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.反應(yīng)體系(10 μL)： 總RNA 1 μg,Oligo(dT) Primer (50 μmol/L) 1 μL,Random Primers (25 μmol/L) 1 μL,RNase-free ddH2O補(bǔ)至6 μL； 于70 ℃水浴孵育10 min后冰上冷卻2 min； 向上述溶液中依次加入5×M-MLV buffer 2 μL,10 mmol/L dNTP混合物0.5 μL,40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL,200 U/μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL,RNase-free ddH2O補(bǔ)至10 μL； 42 ℃保溫1 h.反應(yīng)獲得cDNA產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增或于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,病毒檢測(cè)PCR反應(yīng)體系(25 μL)： ddH2O 11.0 μL,cDNA 0.5 μL,10 μmol/L上下游引物各0.5 μL,PCR mix 12.5 μL.SCMVCP基因克隆的PCR反應(yīng)體系(50 μL)： ddH2O 37.5 μL,10×Ex Taq buffer(Mg2+plus)5.0 μL,dNTPs 4.0 μL,cDNA 1.0 μL,10 μmol/L上下游引物各1.0 μL,Ex Taq 0.5 μL.PCR反應(yīng)程序設(shè)定： 94 ℃預(yù)變性 5 min； 94 ℃變性30 s后退火30 s(退火溫度根據(jù)引物熔解溫度確定),72 ℃延伸 30～60 s(根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度確定),34次循環(huán)； 最后72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析．

1.2.2 DNA純化回收、 連接T載體及轉(zhuǎn)化大腸桿菌

PCR產(chǎn)物用天根通用型DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit,TIANGEN)參照說明書流程純化回收.回收產(chǎn)物連入pMDTM19-T 載體,連接反應(yīng)體系(10 μL)： 10×T4 DNA Ligase buffer 1 μL,回收產(chǎn)物5 μL,pMDTM19-T 0.5 μL,T4 DNA Ligase 0.5 μL,ddH2O補(bǔ)至10 μL,置于16 ℃過夜反應(yīng).將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài),37 ℃培養(yǎng)后挑取單菌落在含抗生素(100 mg/L氨芐青霉素)LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h,菌液經(jīng)PCR檢測(cè)后選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析．

1.2.3 序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析

經(jīng)PCR檢測(cè)呈陽性的菌液委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)用BLAST進(jìn)行序列相似性檢索.用本研究中克隆獲得SCMV四川分離物CP基因和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已上傳的所有SCMV中國(guó)分離物CP基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,以玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus,MDMV)CP基因?yàn)橥饨M,用MEGA4軟件的鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,重復(fù)取樣1 000次[20].SCMV核苷酸變異、 群體分化和基因流、 群體中性測(cè)試均用DNaSP軟件進(jìn)行分析[21]．

2 結(jié)果與分析

2.1 四川玉米和甘蔗病樣中的病毒檢測(cè)

從四川攀枝花田間采集表現(xiàn)病毒病癥狀的玉米和甘蔗植株病葉,玉米葉片主要表現(xiàn)褪綠、 斑駁和花葉癥狀,甘蔗葉片主要表現(xiàn)褪綠、 黃化、 壞死和葉卷曲癥狀(圖1)．

為綜合分析所采集樣品中存在的病毒種類,各樣品均取0.1 g混合研磨制備混樣并提取總RNA,委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行小RNA高通量測(cè)序.測(cè)序共獲得13 868 023個(gè)reads,去除接頭以及長(zhǎng)度小于18或大于32個(gè)核苷酸的reads,獲得9 505 185個(gè)Clean reads.將Clean reads通過從頭組裝產(chǎn)生重疊群后與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank Virus RefSeq進(jìn)行比對(duì)并注釋得到的病毒序列.所有重疊群共比對(duì)到5種病毒： SrMV,MaYMV,SCMV,SCBGAV和MSRV(表2)．

PZH1,PZH2,PZH7,PZH8為本研究中樣品編號(hào)．圖1 四川攀枝花田間部分玉米和甘蔗病樣癥狀

表2 小RNA高通量測(cè)序鑒定玉米和甘蔗樣品中的病毒種類

為驗(yàn)證玉米和甘蔗樣品中存在的病毒種類,分別提取本研究中采集的54份玉米和42份甘蔗樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以表1中引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明： 四川攀枝花玉米病樣中可檢出SCMV,MaYMV和MSRV 3種病毒,檢出率分別為66.7%,59.3%和3.7%； 甘蔗病樣中可檢出SCBGAV,SCMV和SrMV 3種病毒,檢出率分別為76.2%,52.4%和28.6%(表3).從每種病毒的陽性樣品中隨機(jī)選取2個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后連入pMDTM19-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài),挑取陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定,序列分析顯示擴(kuò)增產(chǎn)物均為對(duì)應(yīng)病毒基因組序列,表明擴(kuò)增出目標(biāo)片段的玉米或甘蔗樣品被該病毒侵染．

表3 四川攀枝花玉米和甘蔗樣品中病毒種類和侵染率的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 SCMV四川分離物CP基因克隆及遺傳變異分析

目前GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無SCMV四川分離物的基因序列,本研究隨機(jī)選取6個(gè)檢出SCMV的玉米和5個(gè)檢出SCMV的甘蔗樣品cDNA為模板,以引物對(duì)SCMV-CP-F/SCMV-CP-R擴(kuò)增CP基因全序列.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后連入pMDTM19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài),每個(gè)轉(zhuǎn)化子挑取3個(gè)陽性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定SCMVCP基因序列(表4)．

表4 克隆CP基因序列的SCMV分離物

為綜合分析SCMV四川分離物群體在SCMV中國(guó)分離物群體中的遺傳進(jìn)化,利用從四川玉米和甘蔗上擴(kuò)增獲得的SCMV分離物CP基因序列,并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載獲得所有來源于我國(guó)不同地區(qū)及寄主的SCMVCP基因序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析其遺傳變異情況.序列比對(duì)結(jié)果顯示,120個(gè)SCMV中國(guó)分離物的CP基因序列的核苷酸同源性為73.8%～100.0%.以MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,所有SCMV中國(guó)分離物聚為5個(gè)進(jìn)化組分支(圖2)．

圖2 基于SCMV中國(guó)分離物CP基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

A組和C組中SCMV分離物主要來自玉米,而B組和D組分離物則主要來自甘蔗.來自于玉米的SCMV四川分離物PZH1,PZH3,PZH4和PZH6位于C組,而來自于甘蔗的SCMV四川分離物PZH7,PZH8,PZH9,PZH10和PZH11均位于E組,表明SCMV的遺傳進(jìn)化具有明顯的寄主特異性.進(jìn)化樹聚類結(jié)果還表明,來自于四川和云南甘蔗上的SCMV分離物主要聚于E組,來自于福建和浙江甘蔗上的SCMV分離物分別聚于D組和B組,來自于四川、 山西、 陜西、 河北和山東幾個(gè)地域依次毗鄰省份玉米上的SCMV分離物同聚于C組,即來自于同種寄主、 同一省份或鄰近省份的SCMV分離物可聚為同一組,這說明地理起源對(duì)于SCMV的遺傳進(jìn)化也具有重要作用．

以DnaSP5軟件計(jì)算SCMV中國(guó)分離物群體的核苷酸多樣性為0.129 88,表明SCMV中國(guó)分離物群體的總體變異度較低.對(duì)SCMV分離物序列信息超過10個(gè)的四川、 云南、 河北、 山西、 陜西、 山東等地的SCMV分離物CP基因的核苷酸多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,來源于河北、 山西和陜西3省的SCMV分離物核苷酸變異度更低,且均來自于各省相同的宿主.而來源于四川、 云南和山東的SCMV分離物來自于至少兩種以上的宿主,且各省SCMV群體的核酸變異度也相對(duì)更高(表5).該結(jié)果與對(duì)SCMV系統(tǒng)進(jìn)化的分析一致,均可表明宿主在SCMV中國(guó)分離物的遺傳分化過程中發(fā)揮著重要的作用．

表5 SCMV群體CP基因核苷酸多樣性分析

基于上述結(jié)果分析,宿主和地理分布在SCMV中國(guó)分離物的遺傳進(jìn)化過程中作用明顯,且SCMV在田間主要由蚜蟲進(jìn)行傳播,暗示著鄰近地理區(qū)域的SCMV群體可能因蚜蟲的交叉?zhèn)鞑コ霈F(xiàn)趨同進(jìn)化.本研究以DnaSP5軟件分析了四川與云南、 山西、 陜西、 河北和山東等省SCMV分離物群體間的遺傳分化和基因流,種群間的遺傳分化程度采用Ks*,Z和Snn 3個(gè)參數(shù)來反映,種群間的基因流采用FST值來反映[16,21-22].FST測(cè)試結(jié)果表明,SCMV四川和云南分離物之間的FST值(表示不同群體間的遺傳多樣性,反映基因流遷移率)為0.011 23,而四川與其他省份分離物群體間的FST值均大于0.33,表明四川和云南的SCMV分離物群體間基因流更為頻繁(表6).本研究中的SCMV四川分離物來源于四川最南端川滇結(jié)合部的攀枝花市,與云南相鄰,這表明更近的地理分布更易導(dǎo)致相鄰地區(qū)SCMV 群體的頻繁基因流．

表6 四川與其他地理區(qū)域SCMV群體的遺傳差異和基因流

SCMV四川和云南分離物間的頻繁基因流暗示這兩個(gè)區(qū)域間的SCMV可能以某種方式(如蚜蟲的田間傳播)進(jìn)行著交叉?zhèn)鞑?根據(jù)SCMV中國(guó)分離物CP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分組結(jié)果,SCMV四川和云南分離物均主要聚于C組和E組.為分析C組和E組的SCMV四川和云南分離物種群(分別表示為SC-YN-GpC和SC-YN-GpE)的擴(kuò)展態(tài)勢(shì),本研究通過Tajima’sD,Fu and Li’sD和Fu and Li’sF等方法進(jìn)行中性測(cè)試[23-24].結(jié)果顯示,來自于C組和E組的四川和云南分離物群體的Tajima’sD,Fu and Li’sD和Fu and Li’sF值均為負(fù)值,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明SC-YN-GpC和SC-YN-GpE兩個(gè)種群在四川和云南可能存在擴(kuò)張趨勢(shì)(表7)．

表7 SCMV四川和云南分離物群體變異中性測(cè)試

3 結(jié)論與討論

本研究是對(duì)四川攀枝花玉米和甘蔗中病毒病原種類和侵染率的綜合分析,也是對(duì)SCMV四川分離物群體遺傳變異情況的首次報(bào)道.我國(guó)玉米和甘蔗上的病毒病害長(zhǎng)期發(fā)生,隨著病毒鑒定技術(shù)的發(fā)展,目前我國(guó)已在田間玉米和甘蔗上鑒定到多種病毒[2-3，25-26].本研究從四川攀枝花市玉米上檢出SCMV,MaYMV和MSRV 3種病毒,從甘蔗上檢出SCBGAV,SCMV和SrMV 3種病毒,其中SCMV是引起該地區(qū)玉米和甘蔗病毒病的重要病原．

前期研究對(duì)世界上某些地區(qū)SCMV分離物的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果暗示宿主和地理因素對(duì)SCMV進(jìn)化的重要性[16，27].本研究對(duì)中國(guó)不同省區(qū)SCMV分離物群體的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,SCMV中國(guó)分離物可聚為5個(gè)進(jìn)化分支,且其系統(tǒng)進(jìn)化和核苷酸多樣性分析結(jié)果均表明,宿主和地理起源在SCMV的遺傳進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要的作用.FST測(cè)試表明來源于川滇交界處的四川攀枝花SCMV分離物和云南分離物間存在頻繁基因流,這也表明地理因素在SCMV遺傳進(jìn)化過程中同樣作用明顯,這可能與蚜蟲在較近的地理距離內(nèi)頻繁交叉?zhèn)鞑CMV有關(guān).本研究中兩個(gè)來源于玉米的分離物PZH2,PZH5和來源于四川甘蔗的5個(gè)分離物聚入同一組,這可能也是由于蚜蟲在玉米和甘蔗間交叉?zhèn)鞑CMV所導(dǎo)致．