方小梅， 楊文娟，2， 王于棟， 唐恬， 吳銀環(huán)， 陶建波， 王藝鋼， 王俊珍， 朱劍鋒， 張建， 易澤林

1. 西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/重慶市蕎麥產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),重慶 400715； 2. 青島市即墨區(qū)金口鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心,山東 青島 266000； 3. 涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,四川 西昌 615000

苦蕎又稱韃靼蕎麥,生育期短,適應(yīng)性廣,抗逆性強(qiáng),自花授粉率高,是很好的填閑補(bǔ)荒作物,社會效益顯著[1].苦蕎營養(yǎng)價(jià)值很高,富含蛋白質(zhì)、 維生素B和膳食纖維以及黃酮類生物活性成分,是一種潛在的“功能性食品”[2].苦蕎獨(dú)特的藥食兩用特性,使其具有重要的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力,市場需求不斷擴(kuò)大.然而,由于苦蕎的產(chǎn)量不穩(wěn),品種退化較嚴(yán)重、 更新速度慢和品種間品質(zhì)參差不齊等問題,嚴(yán)重阻礙了苦蕎的生產(chǎn)及發(fā)展[3].苦蕎屬于小宗作物,基礎(chǔ)研究開始較晚,遺傳育種研究也相對滯后[4].因此,加快苦蕎種質(zhì)資源創(chuàng)新,挖掘與利用優(yōu)良基因已經(jīng)成為我國苦蕎產(chǎn)業(yè)研究和發(fā)展的重點(diǎn)[5-9]．

植物的自然突變頻率很低,要想獲得足夠多有價(jià)值的突變材料,可通過人工誘變的方法來提高突變頻率,創(chuàng)制篩選出更多、 更有價(jià)值的突變體[10].突變體庫主要的構(gòu)建方法有插入誘變、 物理誘變、 化學(xué)誘變等.化學(xué)誘變相較于其他誘變有著簡單、 經(jīng)濟(jì)、 易突變、 無需遺傳轉(zhuǎn)化的特點(diǎn),已成為突變體庫創(chuàng)建的一種重要技術(shù)手段[11].其中甲基磺酸乙酯(EMS)誘變因其誘變范圍廣、 效率高、 操作簡便、 成本低廉、 產(chǎn)生的染色體畸變很少、 對處理材料生物損傷小、 主要發(fā)生DNA分子上的點(diǎn)突變(且大多是顯性突變)、 利于篩選工作的進(jìn)行等優(yōu)勢而被認(rèn)為是使用最廣、 效果最明顯的誘變劑[12],已在玉米[13]、 高粱[14]、 黃瓜[15]、 番茄[16]等植物上成功構(gòu)建了EMS突變體庫,獲得了不同的新種質(zhì)資源,大大加快了育種進(jìn)程,并有助于新的等位基因鑒定和功能基因組學(xué)研究.在苦蕎育種研究方面,利用化學(xué)方法對苦蕎的誘變研究陸續(xù)有相關(guān)報(bào)道出現(xiàn).溫日宇等[17]研究了不同濃度EMS對晉蕎麥4號種子發(fā)芽的影響,認(rèn)為其EMS誘變的半致死百分比為1.7%,處理時(shí)間為12 h.鄧琳瓊等[18]利用EMS對貴州地方栽培苦蕎品種進(jìn)行處理,對其突變體進(jìn)行篩選和鑒定,獲得了葉片肥大、 早熟、 晚熟、 小粒、 矮稈和黃化6種穩(wěn)定遺傳的突變體.馬名川等[19]利用EMS對苦蕎地方資源材料刺蕎進(jìn)行處理,對其M2代突變體進(jìn)行篩選和鑒定,獲得了抗倒、 矮稈、 籽粒多棱、 大粒等突變體,初步創(chuàng)建了刺蕎突變體庫.孫朝霞等[20]利用EMS誘變苦蕎品種“黑豐1號”,獲得了矮桿、 種殼開裂、 叢生枝等突變株系,并篩選出高低蘆丁突變體株系,對蘆丁合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了表達(dá)分析．

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)分子標(biāo)記是2009年由Collard等[21]新開發(fā)的一種基于翻譯起始位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的新型單引物擴(kuò)增反應(yīng)目的基因分子標(biāo)記.有研究表明,SCoT分子標(biāo)記可以根據(jù)植物的性狀突變進(jìn)行初步鑒定.岳慶春等[22]利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對經(jīng)137Cs-γ射線處理“醉金香”葡萄種子得到的變異單株進(jìn)行遺傳變異及多樣性分析,實(shí)現(xiàn)了葡萄變異材料的早期鑒定； 王俏君等[23]對經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察篩選到的彩葉芋表型突變體進(jìn)行SCoT分子標(biāo)記分析檢測,發(fā)現(xiàn)在DNA分子水平上發(fā)生了變異的4株表型突變體； 白邦琴等[24]將3種草坪草作為試驗(yàn)材料進(jìn)行EMS誘變后,對誘變M2代植株進(jìn)行了SCoT分子標(biāo)記分析,在SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳條帶中出現(xiàn)了較豐富的多態(tài)性條帶,表明篩選的突變體發(fā)生了分子水平的遺傳變異．

本研究利用EMS誘變劑對苦蕎測序品種“品苦1號”進(jìn)行浸種誘變處理,創(chuàng)建一個(gè)表型變異豐富的苦蕎突變體庫,并對M2進(jìn)行形態(tài)學(xué)和SCoT分子標(biāo)記的篩選和鑒定,以期豐富苦蕎基因資源,加快苦蕎遺傳育種進(jìn)程,并為苦蕎品種選育及功能基因組學(xué)的研究提供優(yōu)良的基礎(chǔ)材料．

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為已完成測序的苦蕎品種“品苦1號”[25],由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供．

1.2 苦蕎EMS誘變百分比的篩選

選取籽粒飽滿均勻的“品苦1號”種子2 400粒,每200粒種子為一組,設(shè)0，0.2%，0.6%，1.0%,共4個(gè)百分比梯度處理,每個(gè)處理3次重復(fù).將種子清水浸種12 h后,用pH=7.0的磷酸緩沖液作為溶劑,配制百分比為0(磷酸鈉緩沖液作為對照)，0.2%，0.6%，1.0%的EMS誘變液(上海麥克林生化有限公司)處理“品苦1號”苦蕎種子,并置于搖床上在通風(fēng)櫥中避光處理12 h,然后以濃度為0.1 mol/L的硫代硫酸鈉為終止劑,終止誘變反應(yīng),然后用流水持續(xù)沖1 h.吸干水分晾干后,于田間進(jìn)行種植.每個(gè)百分比處理種植1個(gè)小區(qū)(行長2 m,行距0.33 m),設(shè)3次重復(fù),播種后記錄各小區(qū)播種量(S),并對田間出苗和成苗情況進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì).于苦蕎的2葉期,調(diào)查出苗數(shù)(E),計(jì)算各小區(qū)出苗率(X)：X=E/S×100%.于苦蕎的4葉期,調(diào)查成苗數(shù)(F),計(jì)算各小區(qū)成苗率(Y)：Y=F/S×100%．

1.3 M2突變體庫的構(gòu)建

選取飽滿均勻的“品苦1號”種子4 000粒,先在清水中浸種12 h,然后用篩選出的適宜百分比的EMS溶液對浸泡好的4 000粒種子進(jìn)行誘變處理,以未處理的“品苦1號”為對照,于2019年3月將其播種在西南大學(xué)科研基地實(shí)驗(yàn)田,每個(gè)小區(qū)(行長2 m,行距0.33 m)種200粒籽粒,對M1代植株做好田間管理,進(jìn)行田間突變體及農(nóng)藝性狀的調(diào)查統(tǒng)計(jì),成熟后按單株收獲籽粒.于2019年9月種成M2代株行(每株行種10粒籽粒),并對定植的M2代單株進(jìn)行田間突變體及農(nóng)藝性狀調(diào)查統(tǒng)計(jì),成熟后將定植的M2代植株按單株收獲,其余單株按株行收獲作為株系對照.誘變材料各世代田間管理均采用常規(guī)育種方式．

1.4 田間突變體性狀調(diào)查

突變體統(tǒng)計(jì)： 對M2代植株全生育期調(diào)查,每3～5 d進(jìn)行1次田間調(diào)查,根據(jù)《蕎麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》,觀察記載植株的葉片、 莖稈、 株高、 分枝、 株型、 籽粒、 育性、 生育期等表型性狀,篩選出各種表型突變體.在形態(tài)學(xué)調(diào)查過程中篩選出各種表型性狀變異材料,同時(shí)分類記錄各種表型變異性狀,對變異性狀進(jìn)行拍照留存,并進(jìn)行單株編號.于成熟期,收獲種子前測量株高(cm)： 用直尺測量從地面至主莖花序頂端的距離； 一級分枝數(shù)(個(gè))： 主莖上從基部至頂端的有效分枝數(shù)； 主莖節(jié)數(shù)(個(gè))： 主莖基部至頂端的總節(jié)數(shù).籽粒成熟單株脫粒收獲后,將籽粒置于37 ℃烘箱烘干,并去除空癟籽粒,采用萬深SC-G型種子數(shù)粒儀及千分之一天平測量單株粒數(shù)(粒)、 單株粒質(zhì)量(g)、 千粒質(zhì)量(g)、 籽粒面積(mm2)、 籽粒周長(mm)、 籽粒長(mm)、 籽粒寬(mm)及籽粒長寬比.最后,取3 個(gè)單株的性狀平均值作為該品種的表型值．

1.5 基因組DNA的提取

待M2代幼苗正常生長后,分別采集每株定植植株0.1 g新鮮葉片于離心管,經(jīng)液氮速凍后,放入磁力打樣機(jī)(LC-DMS-H 型)(30 s,50 Hz)粉碎至粉末.參照改良后的 CTAB 法提取苦蕎種質(zhì)資源的 DNA[26],采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測,并利用Nano Drop 2000儀器檢測樣本的DNA質(zhì)量濃度,用已滅菌的ddH2O將DNA稀釋到50 ng/μL,-20 ℃低溫保存待用．

1.6 SCoT分子標(biāo)記分析

參考Collard等[21]的方法設(shè)計(jì)并合成了36條SCoT引物,以野生型“品苦1號”DNA為模板,對36條引物進(jìn)行篩選,其中26條引物可擴(kuò)展出穩(wěn)定性好,可重復(fù)的清晰條帶(表1)．

表1 SCoT分子標(biāo)記引物信息

PCR總反應(yīng)體系為20 μL,其中苦蕎基因組DNA 1.0 μL,引物各1.0 μL,buffer 1.0 μL,2×Taq PCR Master Mix 10 μL,ddH2O 6 μL.2×Taq PCR Master Mix購自諾唯贊生物科技有限公司.SCoT-PCR初始基本擴(kuò)增程序?yàn)椋?先94 ℃下預(yù)變性4 min,然后進(jìn)行94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán)程序,最后在72 ℃下進(jìn)行7 min延伸.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,于凝膠成像系統(tǒng)拍照保存,并根據(jù)電泳圖像讀取條帶數(shù)據(jù),分析誘變材料與野生型之間的差異．

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016統(tǒng)計(jì)各突變類型的突變數(shù)目及突變率,計(jì)算苦蕎植株和籽粒各主要農(nóng)藝性的平均值、 最小值、 最大值、 極差、 標(biāo)準(zhǔn)差,進(jìn)而計(jì)算各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)、 遺傳多樣性指數(shù),同時(shí)繪制相應(yīng)圖表.利用SPSS 24軟件對誘變M2代的各主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析、 主成分分析、 聚類分析,并利用DPS軟件處理體系優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)的方差分析及多重比較．

電泳結(jié)果采用0/1賦值,強(qiáng)帶記1,弱帶反復(fù)出現(xiàn)記1,弱帶出現(xiàn)但不重復(fù)記0,無帶記0,建立引物擴(kuò)增的“0/1”分子數(shù)據(jù)矩陣,利用Power Marker軟件[27]計(jì)算遺傳距離,并利用MEGA 7.0軟件[28]進(jìn)行UPGMA聚類分析,利用Fig Tree軟件對聚類圖進(jìn)行美化編輯．

2 結(jié)果分析

2.1 EMS誘變百分比的篩選

本研究將0，0.2%，0.6%，1.0%共4種EMS百分比梯度處理后的種子于田間播種,播種后于2葉期統(tǒng)計(jì)出苗率及相對出苗率,于4葉期統(tǒng)計(jì)成苗率及相對成苗率(表2).研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)EMS處理的苦蕎品種“品苦1號”種子的田間出苗率和成苗率均隨著EMS百分比的增加而逐漸下降.其中0.6% EMS處理的“品苦1號”種子,與對照相比其相對出苗率為51.92%,相對成苗率為46.19%.在EMS誘變的研究中,一般以半致死劑量LD50作為EMS誘變處理的適宜百分比標(biāo)準(zhǔn),半致死劑量即相對出苗率為50%時(shí)的EMS劑量,此時(shí)誘變處理產(chǎn)生的材料,其單堿基突變的頻率最高.經(jīng)綜合分析后,本研究最終選定0.6% EMS為適宜“品苦1號”批量誘變的誘變劑量．

表2 EMS百分比對“品苦1號”苦蕎種子出苗的影響 %

2.2 M2代植株表型性狀變異分析

田間播種經(jīng)0.6% EMS處理12 h的“品苦1號”苦蕎種子4 000粒,2葉期出苗數(shù)為1 076株,出苗率為26.90%； 4葉期成苗數(shù)為991株,成苗率為24.78%； 同年5月底收獲M1代植株971株.M1自交后單株收獲M2代965份材料.對野生型“品苦1號”和965個(gè)M2代株行進(jìn)行突變調(diào)查(圖1),結(jié)果表明苦蕎品種“品苦1號”經(jīng)過EMS誘變后,在M2代觀察到了豐富的表型變異突變體,且在所調(diào)查的葉片性狀、 莖稈性狀、 籽粒性狀及生育期等表型性狀中均發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn).其中,部分植株表現(xiàn)出兩種或兩種以上表型性狀的復(fù)合突變.共計(jì)發(fā)現(xiàn)486個(gè)突變位點(diǎn)在M2代272個(gè)單株上(366個(gè)突變植株中,復(fù)合突變植株僅計(jì)數(shù)1次),M2代表型突變頻率為28.19%.各類型突變率為葉片8.60%,莖稈11.50%,籽粒14.20%,其他類型為4.56%(表3)．

圖1 M2代部分突變體

表3 誘變M2代群體各突變類型突變情況統(tǒng)計(jì)表

續(xù)表3

2.3 M2代主要農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性分析

本研究對“品苦1號”苦蕎誘變M2代材料和野生型對照的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了調(diào)查測量及統(tǒng)計(jì)分析(表4).11個(gè)主要農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)變化范圍介于4.12%～53.88%之間,遺傳多樣性指數(shù)在1.46～2.02之間,平均值為1.87,各性狀的遺傳多樣性指數(shù)從大到小依次為單株粒質(zhì)量(單株粒數(shù))、 株高(籽粒周長)、 籽粒面積、 籽粒長、 千粒質(zhì)量、 籽粒寬、 籽粒長/寬、 主莖節(jié)數(shù)、 一級分枝數(shù),表明“品苦1號”誘變M2代苦蕎材料各主要農(nóng)藝性狀之間存在較大的差異,產(chǎn)生了較豐富的性狀變異．

表4 誘變M2代材料主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

將誘變M2代材料的11個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析,結(jié)果表明所有主成分構(gòu)成中特征值大于1的有4個(gè)主成分(表5).其中,第1主成分的的特征值為3.433,貢獻(xiàn)率為31.209%； 第2主成分的特征值為3.109,貢獻(xiàn)率為28.262%； 第3主成分的特征值為1.935,貢獻(xiàn)率為17.587%； 第4主成分的特征值為1.027,貢獻(xiàn)率為9.333%； 前4個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)86.391%.根據(jù)累積貢獻(xiàn)率大于(等于)85.00%的標(biāo)準(zhǔn),表明本研究提取的4個(gè)主成分基本可以反映誘變M2代的11個(gè)主要農(nóng)藝性狀的因子信息,可以很好地解釋表型的變異．

表5 誘變M2代材料主要農(nóng)藝性狀主成分特征值與貢獻(xiàn)率

2.4 M2代的SCoT分子標(biāo)記分析

利用26條SCoT引物對“品苦1號”誘變M2代群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共得到263條清晰穩(wěn)定的條帶,各SCoT引物擴(kuò)增出的條帶在4～16條之間,平均為每條引物擴(kuò)增出10.12條電泳條帶.對比野生型“品苦1號”和誘變M2代材料SCoT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶,發(fā)現(xiàn)誘變M2代與野生型之間存在較豐富的條帶差異,包括條帶增加和條帶缺失,這些條帶差異證明EMS誘變方法導(dǎo)致苦蕎在DNA分子水平上發(fā)生了變異(圖2)．

CK： 野生型“品苦1號”； 1～23： 23份M2代材料； M： 代表2 000 bp的DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．圖2 部分誘變M2代材料SCoT-PCR電泳條帶

基于SCoT分子標(biāo)記電泳條帶數(shù)據(jù),將對照的野生型“品苦1號”在內(nèi)的966份材料兩兩組合進(jìn)行分析,共得到466 095個(gè)遺傳距離,分布在0.003 8～0.324 5之間,平均值為0.093 5,其中PKM2-148和PKM2-566間的遺傳距離最大,為0.324 5； CK和PKM2-097間的遺傳距離最小,為0.003 8.以0.015為組間距進(jìn)行頻數(shù)分布分析,96.23%的遺傳距離分布在0.045～0.180之間(圖3a).965個(gè)誘變材料與對照材料“品苦1號”間的遺傳距離平均為0.056 2.其中CK和PKM2-803間的遺傳距離最大,為0.203 8； CK和PKM2-097間的遺傳距離最小,為0.003 8．

根據(jù)SCoT分子標(biāo)記數(shù)據(jù),利用非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建聚類圖(圖3b),結(jié)果966個(gè)材料被分為4類(CI-CIV).對4個(gè)類群的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表6)發(fā)現(xiàn)： CI由256個(gè)材料組成,包括對照在內(nèi)的256個(gè)材料間的遺傳距離在0.003 8～0.271 7之間,平均遺傳距離為0.066 9,顯著小于其他類群,植株與籽粒的主要農(nóng)藝性狀均適中.CII由145個(gè)材料組成,145個(gè)材料間的遺傳距離在0.015 1～0.230 2之間,平均遺傳距離為0.088 7,主要農(nóng)藝性狀中株高偏低、 單株產(chǎn)量較高,千粒質(zhì)量偏小、 籽粒偏大偏長.CIII由210個(gè)材料組成,210個(gè)突變材料的遺傳距離在0.007 5～0.249 1之間,平均遺傳距離為0.106 7,顯著大于其他類群,主要農(nóng)藝性狀中主莖節(jié)數(shù)和分枝較少、 單株產(chǎn)量低.CⅣ由355個(gè)突變材料組成,355個(gè)突變材料間的遺傳距離在0.007 5～0.222 6之間,平均遺傳距離為0.094 2,主要農(nóng)藝性狀中株高偏高,主莖節(jié)數(shù)偏多,千粒質(zhì)量偏大,籽粒較小．

圖3 誘變M2代材料間遺傳距離的頻數(shù)(a)和聚類圖(b)

表6 誘變M2代材料基于SCoT分子標(biāo)記聚類的4大類群主要農(nóng)藝性狀差異

3 討論

3.1 EMS誘變百分比的篩選

EMS誘變結(jié)果具有不確定性,誘變對象不同,EMS的誘變效率也不同,而且前人研究結(jié)果表明,最佳EMS處理?xiàng)l件通常是接近半致死劑量的處理?xiàng)l件,原因是半致死劑量下的突變效率較高,獲得的突變體較多,待選群體基數(shù)適中[24].影響EMS誘變效果的主要因素是EMS百分比和誘變處理時(shí)間長短[29].溫日宇等[17]對苦蕎種子EMS誘變效應(yīng)的研究結(jié)果表明,不同誘變時(shí)間的處理結(jié)果差異不顯著,且處理8 h以上才會對種子發(fā)芽率產(chǎn)生明顯的影響,苦蕎EMS誘變的半致死百分比為1.7%.孫朝霞等[20]的研究結(jié)果顯示,“黑豐1號”苦蕎種子的EMS誘變半致死劑量為1.2%.本研究對測序品種“品苦1號”采用0，0.2%，0.6%，1.0%共4種EMS誘變百分比對苦蕎種子進(jìn)行浸種誘變處理12 h,最終選定0.6% EMS誘變百分比為最適宜的誘變劑量.本研究結(jié)果與前人研究最適誘變劑量的結(jié)論存在差異,可能是不同品種對誘變劑的敏感程度不同,亦有可能是處理后環(huán)境條件(播種地土壤、 大氣溫度和濕度等)差異所致．

3.2 EMS突變體庫的構(gòu)建

誘變M2群體是突變體表型調(diào)查最為關(guān)鍵的時(shí)期[30].本研究通過對966個(gè)M2代單株進(jìn)行田間突變表型調(diào)查發(fā)現(xiàn),苦蕎品種“品苦1號”經(jīng)過EMS誘變的M2代產(chǎn)生了豐富的表型變異突變體,共發(fā)現(xiàn)486個(gè)突變位點(diǎn)在M2代272個(gè)單株上,M2代表型突變頻率為28.19%.在所調(diào)查的M2代葉片性狀、 莖稈性狀、 株型及生育期等表型中均發(fā)現(xiàn)了突變,比馬名川等[19]、 孫朝霞等[20]在EMS誘變苦蕎研究中的突變率要高,可能原因在于： 與其他研究相比,本研究采用的苦蕎品種不同,不同品種的材料對EMS的適應(yīng)程度不同,因此可能造成的突變率不同； EMS誘變百分比及誘變劑品牌不同,產(chǎn)生的誘變效率會有所差異； 植株生長環(huán)境不同也會導(dǎo)致田間表型調(diào)查的突變率不同.本研究對突變?nèi)后w田間表型調(diào)查采取的是單株逐一調(diào)查的方式,單株收獲籽粒后進(jìn)行了單株烤種,對籽粒表型進(jìn)行了細(xì)致的鑒定,初步篩選的突變數(shù)量較多,因此突變比例也相對較高,但是在突變的穩(wěn)定性上實(shí)驗(yàn)室后續(xù)還會進(jìn)一步地篩選和鑒定．

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),在M2代苦蕎突變體庫中產(chǎn)生最多的突變性狀包括黃化葉片、 矮化植株、 緊湊株型、 籽粒表型等,此外還有一些突變單株存在多個(gè)變異性狀一起出現(xiàn)的現(xiàn)象,如矮化的植株節(jié)間短,株型緊湊的植株分枝多,叢生植株籽粒會比較早熟等等,這些現(xiàn)象的出現(xiàn)應(yīng)證了前人提出的EMS誘變會導(dǎo)致基因點(diǎn)突變率增加,且突變的基因之間可能會存在連鎖表達(dá)效應(yīng)的說法[31-32]．

3.3 M2代主要農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性指數(shù)是反映性狀遺傳多樣性的一個(gè)重要指標(biāo),遺傳多樣性指數(shù)越高,表明農(nóng)藝性狀的多樣性越豐富.近年來,已有文獻(xiàn)報(bào)道了較多苦蕎株高、 分枝數(shù)、 節(jié)數(shù)、 單株產(chǎn)量、 籽粒表型等主要農(nóng)藝性狀的遺傳變異研究[33-35].而本研究的M2代突變體主要農(nóng)藝性狀遺傳多樣性指數(shù)在1.46～2.02之間,平均值為1.87,其中最高的是單株粒質(zhì)量和單株粒數(shù),說明經(jīng)EMS誘變后的M2代群體間主要農(nóng)藝性狀的多樣性變異豐富,包含的變異類型多,具有很高的研究價(jià)值．

聚類分析已廣泛應(yīng)用于苦蕎的遺傳多樣性分析,呂丹等[36]基于農(nóng)藝性狀對苦蕎資源材料進(jìn)行聚類分析,將213個(gè)苦蕎種質(zhì)資源分為6類,其中的高產(chǎn)類群可以作為苦蕎品種選育的親本材料.本研究基于11個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行聚類,將誘變M2代材料分為4大類群,方便對優(yōu)良性狀進(jìn)行篩選和鑒定,為苦蕎育種工作提供豐富的基礎(chǔ)材料,加快育種進(jìn)程．

3.4 M2代的SCoT分子標(biāo)記分析

SCoT分子標(biāo)記與傳統(tǒng)DNA分子標(biāo)記相比具有靈敏度高、 穩(wěn)定性好、 引物設(shè)計(jì)簡單、 通用性強(qiáng)； DNA用量少且質(zhì)量要求低、 操作簡單、 成本低廉、 遺傳信息豐富、 條帶的多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[37].本研究以誘變M2代與野生型“品苦1號”為PCR擴(kuò)增的DNA模板,進(jìn)行SCoT-PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)誘變M2代與野生型之間存在條帶差異,包括條帶增加和條帶缺失,這些條帶差異證明EMS誘變方法導(dǎo)致苦蕎在DNA分子水平上發(fā)生了變異,與王俏君[23]的研究結(jié)論相似,但各突變株變異位點(diǎn)的堿基序列信息、 突變性狀能否穩(wěn)定遺傳等問題還需后續(xù)進(jìn)一步地研究．

將基于M2代農(nóng)藝性狀的聚類結(jié)果與基于M2代SCoT分子標(biāo)記的聚類結(jié)果進(jìn)行對比分析,發(fā)現(xiàn)誘變苦蕎品種“品苦1號”的誘變M2代在兩種不同方式下的聚類結(jié)果有所不同,雖然兩種方式都聚成了4個(gè)類群,但每個(gè)類群在綜合農(nóng)藝性狀變現(xiàn)過程中有所不同,且每個(gè)類群的材料分布也不盡相同.兩種聚類方式結(jié)果有所差異的現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他許多植物的研究中[38-40],造成這些差異的主要原因是農(nóng)藝性狀聚類的作用是揭示植株表型性狀的差異,而基于SCoT分子標(biāo)記的聚類結(jié)果揭示的主要是M2代材料在DNA分子水平上的差異.同時(shí),兩種聚類方式無論是性狀測量,還是電泳條帶讀取在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)都存在統(tǒng)計(jì)人員主觀因素及儀器設(shè)備誤差的影響.因此,將農(nóng)藝性狀分析與分子標(biāo)記分析結(jié)果相結(jié)合,在突變體研究工作中可以根據(jù)既定目標(biāo)進(jìn)行綜合篩選和分析,有利于提高突變體鑒定和篩選的效率和準(zhǔn)確性,同時(shí)也說明將分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種手段有機(jī)地結(jié)合起來,能有效縮短育種年限,加快作物育種進(jìn)程．

4 結(jié)論

EMS誘變百分比梯度試驗(yàn)結(jié)果表明“品苦1號”在重慶最適宜的EMS誘變百分比為0.6%； M2代966個(gè)株系產(chǎn)生了豐富的表型變異突變體； 主成分分析得到包括籽粒大小因子、 籽粒形狀因子、 植株產(chǎn)量因子、 植株表型因子的4大主成分因子； 基于SCoT分子標(biāo)記的UPGMA聚類分析將966個(gè)材料分為4大類,SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明EMS誘變導(dǎo)致苦蕎在DNA分子水平上發(fā)生了變異.該突變體庫的構(gòu)建及初步篩選分析,將為苦蕎功能基因組學(xué)研究和分子育種提供表型多樣的種質(zhì)資源．