馬琪， 翁與競， 覃施媛， 曹立亭， 畢師誠

西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,重慶 榮昌 402460

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)是一種慢性、 非特異性、 炎癥性腸病,該病的病變區(qū)域位于結(jié)腸及直腸的黏膜及黏膜下層,其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、 腹瀉及便血等[1].UC在中醫(yī)學(xué)辯證立法中一般歸為 “瀉下” “痢疾”等范疇,認(rèn)為其病因為外感濕熱,飲食不節(jié),導(dǎo)致脾、 胃、 小腸、 大腸傳導(dǎo)失調(diào),水谷運行不暢,久而閉塞,傷及腸胃,氣血瘀滯,以致便血[2].平胃散出自《宋·太平惠民和劑局方》,由蒼術(shù)、 厚樸、 陳皮、 甘草4味藥組成,諸藥合用,共成燥濕運脾,行氣和胃之功.現(xiàn)代藥理研究表明,平胃散有明顯的調(diào)節(jié)胃腸運動,抗菌抗炎,抗?jié)兒驮鰪?qiáng)免疫等作用.平胃散治療UC可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群,恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡,促進(jìn)胃腸運動,抑制炎癥反應(yīng)等發(fā)揮作用．

中藥方劑是在中醫(yī)辨證立法的基礎(chǔ)上,按照一定的組織原則,選擇適當(dāng)?shù)乃幬锝M合運用達(dá)到預(yù)期的治療效果.近年來,隨著系統(tǒng)生物學(xué)與計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)的應(yīng)用,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也常被用于探究中藥方劑與相關(guān)疾病之間的關(guān)系,通過篩選藥物成分、 作用靶點、 疾病靶點、 作用通路等,模擬構(gòu)建生物網(wǎng)絡(luò)圖,多維度地探究藥物成分對疾病靶點的干預(yù)和影響,從而揭示藥物在治療疾病過程中發(fā)揮的多層次協(xié)同作用[3-8].本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法和分子對接驗證技術(shù),揭示平胃散在治療UC時的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),探究平胃散治療UC的關(guān)鍵靶點和作用通路,為后續(xù)的研究工作提供理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 篩選平胃散活性成分及相關(guān)靶點

為收集平胃散中蒼術(shù)、 厚樸、 陳皮、 甘草4味中藥的主要化學(xué)成分,通過檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)[9-10]篩選口服利用度(OB)大于(等于)30%且類藥屬性(DL)大于(等于)0.18[11]的活性成分,獲得平胃散活性成分及相關(guān)靶點.在Uniprot數(shù)據(jù)庫中對基因靶點信息及基因名稱進(jìn)行校對核實[12-13]．

1.2 篩選UC相關(guān)疾病作用靶點

為收集UC疾病作用的相關(guān)靶點,通過檢索疾病基因數(shù)據(jù)庫如GeneCards、 TTD(Therapeutic Target Database) 以及OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)[14],綜合篩選后將其與上述平胃散潛在藥物靶點進(jìn)行比對,篩選出167個共同基因,作為UC和平胃散的共同潛在靶點．

1.3 構(gòu)建平胃散活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)

將1.1項篩選的平胃散活性成分與1.2項篩選的共同潛在靶點,依照活性成分-靶點之間的對應(yīng)關(guān)系上傳至在線可視化軟件Cytoscape形成網(wǎng)絡(luò)圖[15](圖1),利用Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析,以自由度值的中位數(shù)來判定活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點．

1.4 分析平胃散治療UC的核心靶點

上傳167個潛在共同靶點至STRING數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行平胃散治療UC的靶點與靶點之間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,并導(dǎo)出分析數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape軟件繪制靶點與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),依據(jù)自由度值的中位數(shù)來判定平胃散治療UC靶點互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點．

1.5 分子對接驗證

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索獲得藥物活性成分的3D結(jié)構(gòu),RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫尋找核心靶點的3D結(jié)構(gòu)PDB格式文件,運用PyMOL2.4.1對靶點蛋白進(jìn)行預(yù)處理,利用AutoDock_Vina分子對接模擬軟件,對自由度值排名前10的藥物活性成分與STRING互作網(wǎng)絡(luò)篩選得到的核心靶點進(jìn)行受體與配體對接.全部分子對接完成后,將藥物活性成分和核心靶點最低結(jié)合能(Binding Energy)數(shù)據(jù)作熱圖(圖3),并選取其中兩個對接結(jié)果進(jìn)行 PyMOL 2. 4. 1 軟件可視化處理(圖4)．

1.6 靶點通路富集分析

利用STRING在線蛋白質(zhì)分析軟件對167個共同靶點進(jìn)行GO(Gene Ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析(圖5、 圖6),設(shè)定閾值p<0.05[14],結(jié)合文獻(xiàn)資料和生信分析篩選與UC有關(guān)的通路導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建平胃散治療UC的活性成分-核心靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖[16](圖7)．

2 結(jié)果

2.1 平胃散活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心活性成分篩選

將閾值設(shè)定為OB大于(等于)30%、DL大于(等于)0.18,結(jié)合數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)資料最終整合得到平胃散92個活性成分,包括蒼術(shù)2個、 厚樸2個、 陳皮3個、 甘草83個,甘草與陳皮共有2個.將平胃散92個活性成分及相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò),如圖1所示.該網(wǎng)絡(luò)圖主要由節(jié)點和邊構(gòu)成,不同顏色的節(jié)點代表不同的含義,甘草成分用藍(lán)色、 蒼術(shù)成分用黃色、 厚樸成分用紅色、 陳皮成分用紫色、 陳皮和蒼術(shù)共有成分用粉色、 靶點用綠色.圖1中共有節(jié)點259個,包括92個成分節(jié)點和167個靶點節(jié)點,邊1 330條．

CZ： 蒼術(shù)； HP： 厚樸； CP： 陳皮； GC： 甘草．圖1 平胃散活性成分靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)Cytoscape-Tool-NetworkAnalyzer分析得出活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中,自由度值中位數(shù)為3(核心節(jié)點需滿足自由度值中位數(shù)的2倍作為參考值).從表1可見,自由度值由高到低排名前10的活性成分依次為槲皮素(quercetin,115)、 山奈酚(kaempferol,38)、 漢黃芩素(wogonin,37)、 柚皮素(naringenin,31)、 川陳皮素(nobiletin,27)、 異鼠李素(isorhamnetin,25)、 芒柄花黃素(formononetin,23)、 7-甲氧基-2甲基異黃酮(7-methoxy-2-methyl isoflavone,22)、 甘草酮a(licochalcone a,22)、 鱗葉甘草素A(glepidotin A,20),推測以上較高自由度值的活性成分是平胃散主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),能夠發(fā)揮重要的藥理作用．

表1 平胃散活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)核心化學(xué)成分拓?fù)浞治鰯?shù)據(jù)

2.2 平胃散治療UC的核心靶點分析

利用STRING在線數(shù)據(jù)庫分析平胃散治療UC靶點之間的交互作用,將167個共同靶點相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫阶杂啥戎荡笥?6的靶點(中位數(shù)的2倍),共篩選到16個核心靶點.如圖2所示,自由度值與節(jié)點顏色呈正相關(guān),自由度值越大,顏色越深,表明靶點在活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中越重要[14].從表2可見,16個核心靶點的自由度值從大到小依次為RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、 白細(xì)胞介素-6(IL6)、 細(xì)胞腫瘤抗原p53(TP53)、 腫瘤壞死因子(TNF)、 絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、 絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、 前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、 轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、 半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、 基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、 絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、 過氧化氫酶(CAT)、 白細(xì)胞介素-8(CXCL8)、 雌激素受體1(ESR1)、 內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)和絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14),且在平胃散治療UC的直接作用靶點中處于核心位置,推測這些靶點可能在平胃散發(fā)揮療效的過程中,對于治療UC起到了較為重要的作用．

圖2 平胃散治療UC核心靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 平胃散治療UC核心靶點拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析

2.3 分子對接驗證

利用分子對接軟件將16個核心靶點和10個核心活性成分進(jìn)行對接模擬計算,得到對接最低結(jié)合能數(shù)據(jù)結(jié)果并作熱圖.由圖3可知,結(jié)合能越小分子對接得越好,所有小分子化合物與標(biāo)靶蛋白的最低結(jié)合能都小于-5.0 kJ/mol,說明靶標(biāo)蛋白配體與活性成分受體可以自發(fā)結(jié)合,最低結(jié)合能越小表明藥物活性成分與靶點蛋白結(jié)合越好[9].對接結(jié)果顯示,10個活性成分與蛋白靶點MMP9，CAT，PTGS2，MAPK3，MAPK8，AKT1，MAPK14的最低結(jié)合能均小于-7 kJ/mol,說明這些活性成分與上述靶點蛋白結(jié)合較好．

圖3 平胃散活性成分與核心靶點蛋白分子對接結(jié)合能熱圖

其中,MMP9與漢黃芩素(wogonin)、 芒柄花黃素(formononetin)結(jié)合活性良好,繪制分子對接細(xì)節(jié)如圖4所示．

圖4 MMP9分子對接圖

藥物小分子結(jié)合在蛋白的活性口袋,并且與活性口袋有較好的匹配[6].wogonin與MMP9活性位點的LYS745，THR854，ASP855形成3個氫鍵相互作用,formononetin也與MMP9活性位點的LYS745，THR854，ASP855形成3個氫鍵相互作用.表3列出參與分子對接的16個靶點蛋白的基本信息,包括靶點、 Uniprot編號及PDB編號.柳氮磺胺吡啶(SASP)與靶點蛋白對接的最低結(jié)合能和平胃散核心活性成分與靶點蛋白的最低結(jié)合能相差不大,驗證了靶點蛋白晶體及配體選擇的合理性．

表3 參與分子對接的16個靶點蛋白

2.4 靶點生物功能及靶點通路分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫共獲得GO生物過程條目2 183條,p值從小到大排序取前20條作圖.由圖5可知,富集氣泡大小代表富集的基因數(shù)量,氣泡越大,表明富集的基因數(shù)目越多[17]； 氣泡顏色代表p值,其值由大到小從紅色向藍(lán)色變化.在基因本體富集的生物過程中,細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、 細(xì)胞的正向調(diào)節(jié)、 生物過程的正向調(diào)節(jié)、 細(xì)胞對刺激的反應(yīng)等排名靠前．

圖5 GO功能富集分析

通過STING數(shù)據(jù)庫共篩選出35條與UC有關(guān)的KEGG通路(圖6),主要包括PI3K-AKT信號通路、 MAPK信號通路、 IL-17信號通路、 TNF信號通路、 Th17細(xì)胞分化等,表明平胃散在發(fā)揮治療UC作用時,可能主要是依靠調(diào)節(jié)平胃散的活性成分來實現(xiàn)上述信號通路．

采用Cytoscape可視化軟件繪制活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(圖7),綠色節(jié)點表示作用通路,橙色節(jié)點表示核心靶點,藍(lán)色節(jié)點表示活性成分.平胃散中40個活性成分作用于16個UC相關(guān)核心靶點,進(jìn)而調(diào)節(jié)35條不同的代謝通路,維持機(jī)體平衡,充分展現(xiàn)了中藥方劑多維度治療UC的目標(biāo)．

圖6 KEGG通路富集氣泡圖

圖7 平胃散活性成分核心靶點通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

參苓白術(shù)散對潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠具有治療效果[18]； 而平胃散有燥濕運脾、 行氣和胃的功效,是治療UC的有效方劑,臨床上已有多例報道證實平胃散治療UC具有較好的療效.本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,應(yīng)用中藥方劑以多種藥物成分,通過多種途徑來協(xié)同作用于多個靶點及多條通路,構(gòu)建藥物活性成分-靶點-通路的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò),探究平胃散治療UC的作用機(jī)制,為平胃散臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)．

在平胃散活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)分析可得,自由度值排名前10的化學(xué)成分分別為槲皮素、 山奈酚、 漢黃芩素、 柚皮素、 川陳皮素、 異鼠李素、 芒柄花黃素、 7-甲氧基-2-甲基異黃酮、 甘草查爾酮a、 鱗葉甘草素A,均屬于黃酮類化合物,說明平胃散治療UC與黃酮類化合物的抑制酶活性、 抗癌、 抗菌、 抗病毒、 抗炎癥、 抗過敏等功能[19]具有密切聯(lián)系．

通過STRING數(shù)據(jù)庫在平胃散治療UC的靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中篩選出16個核心靶點,結(jié)合分子對接結(jié)果,發(fā)現(xiàn)10個活性成分與16個核心靶點蛋白對接結(jié)合能均小于-5.0 kJ/mol.其中,分子對接結(jié)合能都小于-7.0 kJ/mol的靶點蛋白有MMP9，CAT，PTGS2，MAPK3，MAPK8，AKT1，MAPK14,說明這7個靶點可能是平胃散治療UC的關(guān)鍵作用靶點.選取MMP9與漢黃芩素、 芒柄花黃素分子對接細(xì)節(jié)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可以與MMP9蛋白活性口袋較好地匹配,其活性位點是MMP9的LYS745，THR854，ASP855這3個氫鍵.芒柄花黃素也可與MMP9的LYS745，THR854，ASP855這3個氫鍵進(jìn)行匹配,說明MMP9確為平胃散治療UC的一個核心靶點．

MMP-9是MMP家族成員,由成纖維細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌而成,廣泛存在于萎縮性胃炎、 胃潰瘍、 體表潰瘍等多種炎癥性疾病中,是細(xì)胞外基質(zhì)的重要降解酶[20].MMP-9在癌癥相關(guān)疾病中均呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài),腫瘤細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移能力與MMP-9的過表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)[21].研究表明,葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠MMP-9在mRNA和蛋白水平上均升高[22],且在平胃散治療UC的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中MMP9處于核心地位,結(jié)合分子對接結(jié)果顯示MMP9與平胃散中多種關(guān)鍵活性成分結(jié)合能低于-7 kJ/mol.KEGG通路富集分析顯示,MMP9與UC有關(guān)炎癥通路IL-17，TNF和MAPK信號通路密切相關(guān),因此平胃散可能通過調(diào)節(jié)MMP9的表達(dá),影響UC有關(guān)炎癥信號通路．

PTGS2是正常組織中起到維持穩(wěn)態(tài)和炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)作用的重要應(yīng)答基因[23],因此PTGS2可通過調(diào)節(jié)UC在不同信號通路中相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮作用.PTGS2與細(xì)胞因子IL-1、 TNF-α、 IL-6、 血小板活化因子等調(diào)節(jié)因子密切相關(guān),其局部表達(dá)增加可引發(fā)炎癥和缺血[24].PTGS2在各種異常內(nèi)外環(huán)境的刺激下會呈現(xiàn)出病理性過度表達(dá),顯著區(qū)別于正常的生理情況.仇雅嵐等[25]研究發(fā)現(xiàn)抑制PTGS2在結(jié)直腸癌組織中過度表達(dá)有利于減少結(jié)直腸癌風(fēng)險,PTGS2在結(jié)直腸癌發(fā)生、 發(fā)展、 轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用.洪寅雯等[26]研究發(fā)現(xiàn)PTGS2是調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化相關(guān)蛋白的靶基因,且抑制腸黏膜細(xì)胞脂質(zhì)過氧化在治療UC相關(guān)疾病中起到重要作用.分子對接結(jié)果顯示,平胃散中10個活性化學(xué)成分與PTGS2結(jié)合能均低于-7.0 kJ/mol,顯示平胃散與PTGS2活性位點結(jié)合能力強(qiáng),亦可推測出平胃散作用于PTGS2時,通過不同的炎癥信號通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),從而達(dá)到減緩UC炎癥反應(yīng)的作用．

CAT是一類主要起催化底物氧化還原反應(yīng)的酶,在平胃散治療UC的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中處于核心地位.DSS會破壞腸道上皮細(xì)胞的完整性,擊破腸道的機(jī)械屏障,誘發(fā)急性 UC[18],而研究表明CAT能有效地清除各種活性氧基團(tuán),從而防止細(xì)胞膜系統(tǒng)的損壞[27].同時,CAT可以通過抑制炎癥、 提高機(jī)體免疫力、 增強(qiáng)機(jī)體對羥基自由基及超氧陰離子的抑制能力等,有效緩解由于氧化應(yīng)激所造成的機(jī)體或功能損傷[28].KEGG富集結(jié)果顯示,NF-κB信號通路具有較高的富集性,研究發(fā)現(xiàn)CAT可以通過降低致炎因子IL-1β，IL-8，TNF-α和PTGS2的信使RNA及蛋白表達(dá),降低NF-κB激活水平,從而達(dá)到抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用[29].Kobayashi等[30]的研究表明,CAT具有抑制金屬蛋白酶(MMPs)和NF-κB表達(dá)的功能,可以起到抑制腫瘤細(xì)胞對上皮細(xì)胞的黏附、 減少腫瘤細(xì)胞數(shù)目、 抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用.分子對接結(jié)果顯示,平胃散中10個活性化合物分子與CAT的結(jié)合能均低于-7.0 kJ/mol,表明平胃散與CAT活性位點結(jié)合能力較強(qiáng).因此,本文推測平胃散作用于CAT,通過其強(qiáng)抗氧化性及調(diào)節(jié)致炎因子表達(dá)的功能,發(fā)揮抑制NF-κB等信號通路的作用,從而在平胃散治療UC的關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用．

MAPK級聯(lián)反應(yīng)存在于所有生物體的大多數(shù)細(xì)胞內(nèi),是真核生物細(xì)胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與多種細(xì)胞功能[31],其中MAPK14信號級聯(lián)的激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、 凋亡、 衰老和炎癥等生物過程,其影響具有多效性和多樣性[32].MAPK14是促炎基因程序的關(guān)鍵激活因子,在UC中可調(diào)節(jié)TNF-α，IL-1，IL-6，IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[33].MAPK14可通過增強(qiáng)TNF-α表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞生理功能紊亂和細(xì)胞凋亡,另有研究表明MAPK信號通路與氧化應(yīng)激性腸上皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[34].因此,平胃散藥物活性成分可能通過MAPK14級聯(lián)反應(yīng)來抑制IL-6,IL-1β，TNF-α的表達(dá),從而達(dá)到對UC的治療效果．

KEGG富集結(jié)果顯示,在UC相關(guān)通路中MAPK，TNF，IL-17等具有較高的富集性.研究表明IL-17家族細(xì)胞因子可以通過活化NF-κB來介導(dǎo)信號傳送及轉(zhuǎn)錄激活因子的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)大腸癌的發(fā)生發(fā)展[35].在炎癥反應(yīng)過程中,NF-κB通過提高IL-1β，IL-6等炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄來增加IL-1β，IL-6的表達(dá),因此調(diào)控NF-κB在平胃散治療UC中起到關(guān)鍵作用[36]．

本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對平胃散治療UC的分子機(jī)制進(jìn)行探討,平胃散中不同藥物的活性成分通過調(diào)控不同的靶蛋白作用于不同的通路,對UC起到治療作用,體現(xiàn)了中藥方劑整體性、 系統(tǒng)性的特點.結(jié)果發(fā)現(xiàn),平胃散可能從以下幾個方面發(fā)揮治療作用： ① 作用于MMP9靶點,控制其mRNA和蛋白水平的表達(dá)量,起到穩(wěn)定腸道黏膜環(huán)境的作用,從而發(fā)揮治療效果； ② 作用于CAT和PTGS2,調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子IL-1β，IL-8，TNF-α及相關(guān)蛋白基因的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用； ③ 抑制 NF-κB，MAPK和IL-17等信號通路的活化及相關(guān)炎癥因子的表達(dá),起到治療UC的作用.本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究了平胃散治療UC的作用機(jī)制,為后續(xù)實驗驗證提供依據(jù)．