甘菊文，謝保平，廖曉飛

（1.贛州市人民醫(yī)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，贛州 341000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）是危害中老年人特別是絕經(jīng)后婦女健康的常見病之一，其特征在于骨量、強度和微結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性損傷，從而增加了脆性骨折發(fā)生的傾向[1]。雌激素作用于破骨細(xì)胞雌激素受體（Estrogen Receptor,ER），通過ER直接或者通過FasL旁路機制誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，直接抑制破骨細(xì)胞的分化或者骨吸收活性[2]。淫羊藿具有補益腎陽、強筋健骨等功效，常用于骨質(zhì)酥松、骨折后期。淫羊藿苷（Icaritin,ICT）是淫羊藿最重要的單體有效成分[3]。目前研究指出ICT可以抑制破骨細(xì)胞（Osteoclast,OC）分化而發(fā)揮抗OP的作用[4-5]，但對其抑制破骨細(xì)胞分化機理的研究，特別是從雌激素受體水平角度探討ICT抑制破骨細(xì)胞分化的研究報道很少。

1 材料與方法

1.1 材料ICT（中國科學(xué)院成都生物研究所）；RAW264.7（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；胎牛血清（Gibco美國），高營養(yǎng)的營養(yǎng)劑（Gibco美國），TRAP染色試 劑 盒 （SIGMA美 國），小 鼠 重 組RANKL（Peprotech美國），甲苯胺藍(lán)zguo染色液（Solarbio美國），氟維司群（ICI182780，美侖生物 中國），4%多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物科技有限公司），17-β-雌 二 醇 （E2，SIGMA美 國），MPP（Cayman Chemical美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 為了檢測ICT是否通過ER抑制破骨細(xì)胞的分化，用ICI182780競爭性阻斷ER的功能，用TRAP染色方法檢測競爭性阻斷ER后ICT對破骨細(xì)胞分化的影響。分為：Control組、RANKL組、RANKL+ICI182780組、E2(1 μM)組、E2(1 μM)+ICI182780組、ICT(10 μM)組、ICT(10 μM)+ICI182780組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.2 TRAP染色 將狀態(tài)較好的RAW264.7細(xì)胞接種于48孔板上，每孔密度為5×103個，12 h后，含ICI182780的 實 驗 組 用 濃 度 為1 μM的ICI182780先處理1 h，然后按實驗分組換有或者沒有ICI180780且含RANKL(50 ng/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天換液1次。從第5天開始染色觀察細(xì)胞（注意破骨細(xì)胞成熟或者長大到一定大小時容易破裂），每2 h一次。在37℃條件下預(yù)熱足夠的PBS，用PBS洗滌兩次，4%多聚甲醛固定20 min，用預(yù)熱PBS徹底清洗3次。配制TRAP染液：取1.5 mL EP管，加50 μL氨偶氮苯和50 μL亞硝酸鈉混勻30 s，室溫靜置2 min，得GBC液，取15 mL離心管，加水4.5 mL，GBC液100 μL，萘酸AS-BI磷酸鈉液50 μL，醋酸鹽200 μL，避光加入酒石酸鹽100 μL，充分混勻，得TRAP染液。每孔加入上述染液300 μL，37℃水浴鍋中避光孵育1 h，隔30 min觀察一次染色情況，待細(xì)胞質(zhì)呈酒紅色，細(xì)胞核清晰可見時，用37℃PBS沖洗干凈(2~3次)，顯微鏡下觀察TRAP染色后的細(xì)胞，胞質(zhì)呈酒紅色，細(xì)胞核數(shù)目大于3的為成熟破骨細(xì)胞，將每孔破骨細(xì)胞按“井”字樣分成9個區(qū)域，并統(tǒng)計每孔破骨細(xì)胞數(shù)，用于統(tǒng)計分析。

1.2.3 骨吸收功能評價 （1）骨片前處理 取新鮮牛股骨骨干，手工制備厚度為100~200 μm的骨片，修剪成48孔板大小。雙蒸水超聲清洗3次，每次30 min。浸泡于75%酒精中，4℃保存?zhèn)溆谩o菌雙蒸水或者滅菌PBS清洗骨片3次，紫外照射骨片正反面各30 min。完全培養(yǎng)基浸泡過夜，第2天用于種板。（2）誘導(dǎo)及染色 將狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞接種于含有經(jīng)前處理的骨片的孔板中，使每孔含細(xì)胞5×103個。實驗組和對照組均每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后，換含藥物或者ICI182780和RANKL(50 ng/mL)的培養(yǎng)基，方法同1.2.2。前4天每2天換液1次，第5天開始每天換液，并在骨片的周圍可以看到破骨細(xì)胞，誘導(dǎo)8天后，用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，加0.25 mol/L氨水超聲清洗3次，每次15 min，依次用60%、70%、80%、90%和100%乙醇脫水，每次脫水5 min，自然晾干，后加入甲苯胺藍(lán)染液染色5 min，顯微鏡下觀察并拍照，用Image-Pro-Plus 6.0軟件計算骨吸收面積。

1.2.4 ICT通過ERα抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能 為了進(jìn)一步驗證ICT是通過ERα/β抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能，用ERα特異性的阻斷劑MPP阻斷ERα，用TRAP染色考察ICT對破骨細(xì)胞分化的影響，實驗分組：Control組、RANKL組、E2組、E2+MPP組、OA(5 μM)組、OA(5 μM)+MPP組、OA(10 μM)組、OA(10 μM)+MPP組，實驗方法同1.2.2。用甲苯胺藍(lán)染色評價骨吸收功能，實驗分組同上，實驗方法同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 ICT通過雌激素受體抑制破骨細(xì)胞分化 用TRAP染色檢測ICI182780競爭性阻斷ER后ICT對破骨細(xì)胞分化的影響。與RANKL組相比，ICT(10 μM)和E2(1 μM)顯著抑制破骨細(xì)胞分化(P＜0.01)；與ICT(10 μM)和E2(1 μM)單獨處理組相比，加入ICI182780處理后，抑制破骨細(xì)胞分化的作用減弱；在沒有ICT或者E2存在的情況下，單獨用ICI182780處理不影響破骨細(xì)胞的分化(P＞0.05)。以上說明ICT可能是通過ER抑制破骨細(xì)胞的分化(圖1)。

圖1 TRAP染色結(jié)果與統(tǒng)計結(jié)果圖

2.2 ICT通過雌激素受體抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能 為了判斷ICT是否通過ER抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能，用ICI182780與ICT共同處理RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，用甲苯胺藍(lán)染色法評價骨吸收功能。結(jié)果如圖2所示，與RANKL組相比，ICT和E2顯著地抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能(P＜0.01)，ICI182780單獨處理組沒有抑制效應(yīng)或者上調(diào)破骨細(xì)胞的骨吸收功能，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與ICT或者E2單獨處理組相比，ICT或E2與ICI182780共同處理組的RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收功能更強(P＜0.05)，提示ICT是通過ER抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能。

圖2 甲苯胺藍(lán)染色法評價骨吸收功能的結(jié)果圖

2.3 ICT通過ERα抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能 為了進(jìn)一步驗證ICT通過ERα抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能，用ERα特異性阻斷劑MPP阻斷ERα，用甲苯胺藍(lán)染色考察ICT對骨吸收功能的影響。與RANKL組相比，各濃度的ICT顯著抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能，且MPP單獨處理組上調(diào)骨吸收功能，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。與ICT或者E2單獨處理組相比，加入MPP后，ICT抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能的作用減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 ICT通過ERα抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能

3 討論

OP癥主要由于骨組織內(nèi)的破骨細(xì)胞（OC）和成骨細(xì)胞(OB)的功能活動平衡被破壞所致[6]。機體內(nèi)所有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化或者抑制成骨細(xì)胞生成的因素都能導(dǎo)致OP的發(fā)生。OC是機體中唯一具有骨吸收作用的細(xì)胞，目前調(diào)節(jié)OC活性被認(rèn)為是治療OP較為直接且有效的方式。雌激素是甾體類化合物，雌激素分泌不足是導(dǎo)致絕經(jīng)后婦女患OP癥的重要原因。雌激素可提高1a-羥化酶活性，促進(jìn)1,25二羥維生素D3產(chǎn)生，可促進(jìn)降鈣素的分泌和抑制甲狀旁腺素的骨吸收[7]。

雌二醇是天然雌激素，通過ER直接抑制破骨細(xì)胞功能。RANKL是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和成熟的必需因子，RANK是破骨細(xì)胞膜上RANKL唯一的信號受體，RANKL與破骨細(xì)胞膜上受體RANK結(jié)合，激活下游信號分子調(diào)控破骨細(xì)胞的分化[2]。本研究提示ICT具有雌激素樣作用，可能通過ER/RANK信號通路抑制破骨細(xì)胞分化。

本研究用ICI182780拮抗ER功能后，ICT抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的效應(yīng)減弱，但沒有完全抑制，可能的原因有兩個，一是ICI182780是雌激素受體的競爭性阻斷劑，與ICT競爭雌激素受體作用位點，沒有完全阻斷雌激素受體；二是ICT可能有其他途徑抑制破骨細(xì)胞分化，如RANKL信號通路。為了進(jìn)一步研究ICT通過ERα抑制RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，本研究用ERα特異性阻斷劑MPP阻斷ERα，用TRAP染色和甲苯胺藍(lán)染色評價阻斷ERα后ICT對破骨細(xì)胞分化和功能的影響，結(jié)果提示ICT可能是通過ERα抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收功能。

ICT目前主要是作為肝病治療的輔助藥物，本研究旨在闡明ICT的抗OP機制，為ICT抗OP研究提供新的作用靶點，也為開發(fā)ICT臨床用于抗OP提供理論支持。