張麗娟 ，陳強(qiáng) ，楊金先 ，李英英 ，2，宋鐵英 ，葛均青 *

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福州350003；2.福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350300）

鰻鱺是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一，主要養(yǎng)殖區(qū)集中在福建省和廣東省，2021年產(chǎn)量達(dá)到255311t[1]。高密度集約化養(yǎng)殖模式導(dǎo)致病害發(fā)生越發(fā)頻繁。嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）是一種短桿狀的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，隸屬于氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是鰻鱺等經(jīng)濟(jì)魚(yú)類的重要致病病原。感染嗜水氣單胞菌后，病魚(yú)體表充血，腹腔積水并伴溶血，引發(fā)敗血癥，發(fā)病率及致死率極高，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，針對(duì)嗜水氣單胞菌病的防控主要是使用抗生素，迫切需要尋找抗生素替代藥物[3]。

卵黃抗體（Egg yolk antibody）是一種存在于免疫后母雞卵黃中的免疫球蛋白（Yolk Immunoglobu lin，IgY）。母雞經(jīng)免疫刺激后，產(chǎn)生的IgY會(huì)在卵黃成熟期從血液轉(zhuǎn)移并富集至卵黃中[4]。IgY具有特異性高、無(wú)毒性、產(chǎn)量高、成本低和理化性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[5]。研究表明，IgY能有效預(yù)防和控制細(xì)菌性疾病[6-8]。Cai Ruizhao等研究發(fā)現(xiàn)，特異性IgY可顯著降低小鼠感染創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）后腹腔和血液中TNFα的表達(dá)水平，降低炎癥反應(yīng)，提高小鼠存活率[9]。Qin Zhendong等研究發(fā)現(xiàn)，特異性IgY具有保護(hù)團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）免受嗜水氣單胞菌感染的潛力，并使腸道和脾臟免受細(xì)菌損傷[10]。

本研究將嗜水氣單胞菌免疫蛋雞，獲得含特異性抗體的卵黃漿，添加至鰻鱺飼料中，與添加對(duì)照卵黃漿的飼料及未添加卵黃漿的飼料分別飼喂美洲鰻鱺，并對(duì)美洲鰻鱺進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒，觀察攻毒后美洲鰻鱺組織的病理學(xué)變化情況，分析組織中細(xì)胞因子的表達(dá)情況，以評(píng)價(jià)卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺抵御嗜水氣單胞菌感染的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

嗜水氣單胞菌L316由本研究室分離并保存[11]；美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）購(gòu)自長(zhǎng)樂(lè)某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格為80～120 g/尾，常規(guī)飼料投喂，日常養(yǎng)殖水溫25℃；Trizol試劑（Invitrogen，Cat.No.15596026）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，試劑盒Prime-Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和 SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；MyD88、TGFβ、TNFα、IL-1β和18S引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌特異性卵黃抗體制備及效價(jià)測(cè)定

嗜水氣單胞菌L316滅活疫苗根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行制備，具體步驟如下：嗜水氣單胞菌L316在TSB培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)，以1%福爾馬林室溫滅活24 h，滅菌PBS清洗2次并將菌濃度調(diào)至1×109cfu/mL，再與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑以體積比1:1混勻、乳化。90日齡海蘭灰蛋雞80只隨機(jī)分成2組，試驗(yàn)組蛋雞注射制備好的滅活疫苗，免疫間隔2周，對(duì)照組蛋雞未注射疫苗。在試驗(yàn)組第3次免疫后，收集雞蛋，取蛋黃，氯仿抽提法提取卵黃抗體[13]；用間接ELISA檢測(cè)免疫后雞蛋卵黃中特異性抗體效價(jià)[14]，以嗜水氣單胞菌作為包被抗原，一抗為不同稀釋度的特異性卵黃抗體或?qū)φ章腰S抗體，二抗為1：5 000稀釋的羊抗雞IgY-HRP。酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處吸光度值，以A試驗(yàn)組/A對(duì)照組比值超過(guò)2.1為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 美洲鰻鱺的卵黃抗體飼喂及嗜水氣單胞菌攻毒

取嗜水氣單胞菌特異性卵黃抗體效價(jià)達(dá)到1：10 000以上的試驗(yàn)組雞蛋卵黃，以體積比1:1與生理鹽水（0.85%NaCl）混勻，制成特異性抗體卵黃漿（L316-IgY）。取對(duì)照組雞蛋卵黃按上述方法制成非特異性抗體卵黃漿（NS-IgY）。

取養(yǎng)殖的健康美洲鰻鱺，隨機(jī)分為3組，每組30尾。L316-IgY組飼喂的飼料添加5%L316-IgY，NS-IgY組飼喂的飼料添加5%NS-IgY，Ctr組飼喂的飼料為未添加卵黃漿的常規(guī)飼料。每日投餌率0.5%，持續(xù)喂食，第31天，3組美洲鰻鱺腹腔注射嗜水氣單胞菌L316，劑量為1×106cfu/尾。

1.2.3 美洲鰻鱺組織的病理學(xué)觀察

攻毒后第7天，取L316-IgY組、NS-IgY組和Ctr組美洲鰻鱺，經(jīng)MS-222麻醉后，解剖取鰓、腸道、肝臟和腎臟等組織，以4%多聚甲醛固定液固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后浸蠟與包埋，切片機(jī)切片，石蠟切片脫蠟并水化，再依次經(jīng)蘇木素、伊紅（hematoxylin-eosin，H.E）染色后脫水封片[15]，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 美洲鰻鱺組織細(xì)胞因子的表達(dá)水平分析

攻毒后第3天和第7天，取L316-IgY組、NSIgY組和Ctr組美洲鰻鱺各4尾，經(jīng)MS-222麻醉后，采集鰓、腸道、肝臟和腎臟等組織，Trizol法提取組織總RNA，用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000測(cè)定RNA濃度。根據(jù)GeneBank上發(fā)表的鰻鱺基因序列設(shè)計(jì) MyD88、TGFβ、TNFα 和 IL-1β 引物。取 1μg RNA， 用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行MyD88、TGFβ、TNFα 和 IL-1β 的定量 PCR， 以 18S為內(nèi)參基因，2-△△ct法計(jì)算 MyD88、TGFβ、TNFα 和IL-1β的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性水平采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析（Two-Way ANOVA），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺的組織病理學(xué)影響

嗜水氣單胞菌攻毒L316-IgY組、NS-IgY組及Ctr組美洲鰻鱺后，第7天的組織病理學(xué)觀察顯示，3組鰓和腸道均無(wú)顯著病變；L316-IgY組的肝臟無(wú)明顯病變、細(xì)胞排列緊密，NS-IgY組的肝臟細(xì)胞間隙增大，Ctr組肝臟細(xì)胞間隙增大、肝索與肝組織分離；L316-IgY組和NS-IgY組的腎臟無(wú)顯著病變，細(xì)胞排列緊密，組織結(jié)構(gòu)完整，Ctr組的腎臟出血、空泡，腎小管腫脹等（圖1）。

圖1 嗜水氣單胞菌攻毒后美洲鰻鱺的組織病理變化

2.2 嗜水氣單胞菌卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺鰓細(xì)胞因子表達(dá)的影響

L316-IgY組、NS-IgY組及Ctr組美洲鰻鱺飼喂第31天進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒，定量PCR對(duì)鰓組織的細(xì)胞因子表達(dá)情況的分析結(jié)果顯示：攻毒后第3天，L316-IgY組和NS-IgY組MyD88表達(dá)顯著下調(diào)，但兩組之間差異不顯著；L316-IgY組TGFβ表達(dá)顯著上調(diào)，NS-IgY組的TGFβ表達(dá)量在L316-IgY組和Ctr組之間，但無(wú)顯著差異；L316-IgY組TNFα表達(dá)顯著上調(diào)，并且顯著高于NS-IgY組的表達(dá)，NS-IgY組TNFα表達(dá)與Ctr組相當(dāng)；攻毒后第7天，3組鰻鱺鰓中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平無(wú)顯著差異（圖 2）。

圖2 嗜水氣單胞菌攻毒后美洲鰻鱺鰓細(xì)胞因子的表達(dá)

2.3 嗜水氣單胞菌卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺腸道細(xì)胞因子表達(dá)的影響

美洲鰻鱺腸道細(xì)胞因子表達(dá)的定量PCR分析顯示：與Ctr組相比，攻毒后第3天，L316-IgY組和NS-IgY組MyD88表達(dá)顯著下調(diào)，兩組之間差異不顯著；攻毒后第7天，MyD88的表達(dá)無(wú)顯著差異，但L316-IgY組MyD88表達(dá)較NS-IgY組顯著降低；L316-IgY組和NS-IgY組IL-1β的表達(dá)均高于Ctr組，但L316-IgY組與Ctr組的差異不顯著，NS-IgY組較Ctr組相比差異顯著，而L316-IgY組和NS-I-gY組間差異不顯著（圖3）。

圖3 嗜水氣單胞菌攻毒后美洲鰻鱺腸道細(xì)胞因子的表達(dá)

2.4 嗜水氣單胞菌卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺肝臟細(xì)胞因子表達(dá)的影響

肝臟細(xì)胞因子表達(dá)的定量PCR分析顯示，攻毒后第3天，飼喂卵黃組TGFβ表達(dá)顯著下調(diào)，但兩組之間差異不顯著；L316-IgY組TNFα表達(dá)顯著上調(diào)，但與NS-IgY組無(wú)顯著差異；攻毒后第7天，L316-IgY組TGFβ表達(dá)顯著上調(diào)，而NS-IgY組的表達(dá)與Ctr組無(wú)顯著差異；L316-IgY組TNFα表達(dá)與Ctr組相比無(wú)顯著差異，但顯著高于NS-IgY組，而NS-IgY組的表達(dá)與Ctr組相比無(wú)顯著差異（圖4）。

圖4 嗜水氣單胞菌攻毒后美洲鰻鱺肝臟細(xì)胞因子的表達(dá)

2.5 嗜水氣單胞菌卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺腎臟細(xì)胞因子表達(dá)的影響

腎臟細(xì)胞因子表達(dá)的定量PCR分析顯示：與Ctr組相比，攻毒后第3天，L316-IgY組MyD88表達(dá)顯著下調(diào)；NS-IgY組TNFα表達(dá)顯著上調(diào)；飼喂卵黃組IL-1β的表達(dá)顯著上調(diào)，但兩組間差異不顯著；攻毒后第7天，L316-IgY組和 NS-IgY組MyD88、TGFβ和TNFα的表達(dá)均顯著上調(diào)，但兩組間差異不顯著（圖5）。

圖5 嗜水氣單胞菌攻毒后美洲鰻鱺腎臟細(xì)胞因子的表達(dá)

3 討論

卵黃抗體由于其理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全、產(chǎn)量大且特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在防治畜禽及水產(chǎn)疾病的應(yīng)用中受到越來(lái)越多的關(guān)注[16]。卵黃抗體可特異性結(jié)合抗原從而達(dá)到治療疾病的效果；馬有智等發(fā)現(xiàn)，注射嗜水氣單胞菌卵黃抗體可提高棘胸蛙感染嗜水氣單胞菌的存活率，保護(hù)率可達(dá)到100%，并且可加快感染損傷的恢復(fù)[17]。本研究的組織病理學(xué)觀察顯示，飼喂含特異性抗體的卵黃漿后，降低了嗜水氣單胞菌攻毒造成的美洲鰻鱺肝臟和腎臟損傷。

王仁寶等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)口服特異性卵黃抗體，能夠顯著提升對(duì)蝦的免疫酶活力和免疫基因表達(dá)水平，提高了對(duì)蝦抗病毒和細(xì)菌感染的能力[18]。MyD88表達(dá)下調(diào)，可保護(hù)機(jī)體免受內(nèi)毒素休克的影響[19]。吳家玉等研究發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽下調(diào)機(jī)體MyD88、NF-κB等細(xì)胞因子的表達(dá)，可降低感染嗜水氣單胞菌組織的損傷[20]。嗜水氣單胞菌可造成機(jī)體急性炎癥反應(yīng)[21]，組織中MyD88下調(diào)表達(dá)，可抑制美洲鰻鱺急性炎癥反應(yīng)。TGFβ具有調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生和降低炎癥的作用[22]；TNFα在炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡中都發(fā)揮了重要作用[23]；IL-1β是一種多效的促炎細(xì)胞因子，參與機(jī)體多種生理和病理過(guò)程，可引發(fā)炎癥反應(yīng)[24]。TGFβ、TNFα、IL-1β 上調(diào)表達(dá)，可促使機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而清除病原菌。本研究中飼喂含特異性抗體的卵黃漿后，顯著提高了組織中TGFβ、TNFα、IL-1β的表達(dá)，攻毒后第3天顯著降低了組織中MyD88的表達(dá)水平，而在攻毒后第7天上調(diào)了腎臟中MyD88的表達(dá)水平。組織中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平改變，提升了攻毒美洲鰻鱺的免疫保護(hù)力，增強(qiáng)了其抵御嗜水氣單胞菌感染的能力。

本研究顯示，飼喂非特異性卵黃漿也能有效降低美洲鰻鱺感染嗜水氣單胞菌造成的腎臟損傷；飼喂非特異性卵黃漿顯著上調(diào)組織中TGFβ、TNFα、IL-1β的表達(dá)，顯著下調(diào)MyD88的表達(dá)。卵黃中含有的卵磷脂、膽固醇、葉黃素、可溶性蛋白等可影響促炎和抗炎途徑[25]。 IgY、α-、β-、γ-livetin 等可促進(jìn)機(jī)體對(duì)多種病原體的被動(dòng)免疫[26]，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[27]。

本研究表明，飼喂嗜水氣單胞菌特異性抗體卵黃漿或非特異性卵黃漿均可減輕美洲鰻鱺對(duì)嗜水氣單胞菌攻毒的組織病變程度，增強(qiáng)美洲鰻鱺抵御嗜水氣單胞菌感染的能力，并調(diào)節(jié)美洲鰻鱺組織中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，其中特異性卵黃抗體對(duì)美洲鰻鱺抵御感染能力的提升作用更顯著。