吳 勇 熊 芮 范昌發(fā)

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

人腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出來(lái)的一種新型腸道病毒，屬微RNA病毒科，是一種嗜神經(jīng)性病毒[1]。EV71主要感染5歲以下的兒童和幼兒，可以引起手足口病(hand foot mouth disease，HFMD)[2]。自1957年首次在加拿大發(fā)現(xiàn)HFMD后，在全球多地尤其是在環(huán)太平洋亞洲地區(qū)頻繁爆發(fā)[3]。我國(guó)從1981年在上海首次出現(xiàn)[4]，隨后迅速蔓延至全國(guó)大部分地區(qū)。其中，安徽省阜陽(yáng)市2008年大規(guī)模爆發(fā)HFMD，給社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)[5-6]。2008年我國(guó)正式將HFMD列為丙類傳染病至今，HFMD病例數(shù)一直居于丙類傳染病之首。

HFMD的發(fā)生與包括EV71在內(nèi)的20多種病毒有關(guān)，大多數(shù)HFMD患者為普通型病例，部分EV71和柯薩奇病毒A16 型(CoxA16)引起的病癥較重，可迅速引發(fā)嚴(yán)重的全身性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，引起后遺癥甚至死亡[7]。目在臨床上，手足口病尚無(wú)有效的預(yù)防和治療藥物，而疫苗則成為有效的防控手段。現(xiàn)階段，我國(guó)針對(duì)EV71的疫苗研究越來(lái)越多，篩選更合適的EV71毒株，更好的評(píng)價(jià)EV71疫苗，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)，而缺乏合適的動(dòng)物模型嚴(yán)重制約著EV71疫苗的研制[8-9]。

良好的動(dòng)物模型，需要滿足能夠支持病毒在體內(nèi)復(fù)制，有一段易感時(shí)期，能夠表現(xiàn)出與人類相似的發(fā)病癥狀。EV71感染致死病例的變化主要表現(xiàn)在種屬神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的炎癥病變，在非人靈長(zhǎng)類以及嚙齒類動(dòng)物的研究中，都發(fā)現(xiàn)了相同的變化[10]。

1 非人靈長(zhǎng)類模型

建立EV71非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物最常用的是恒河猴和食蟹猴。這兩種動(dòng)物通過(guò)灌胃、皮下注射、顱內(nèi)注射等攻毒方式，均可以感染EV71。

研究發(fā)現(xiàn)新生恒河猴在感染EV71后與人類有非常相似的癥狀表現(xiàn)[10]。采用不同的感染方式對(duì)恒河猴攻毒EV71，發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)攻毒可導(dǎo)致肺水腫和出血，靜脈和呼吸道攻毒可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和肺部組織炎癥[11-12]，同時(shí)，恒河猴在接受EV71疫苗免疫后，能夠出現(xiàn)與人類相似的免疫反應(yīng)[13]。有研究將不同種屬的EV71病毒通過(guò)靜脈滴注的方式感染4—6年齡的食蟹猴，食蟹猴能針對(duì)不同的病毒表現(xiàn)出不同的神經(jīng)性感染、短暫的淋巴細(xì)胞減少和炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)等[14]。

非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是比較理想的EV71動(dòng)物模型，但是由于價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)不易，該類模型的應(yīng)用受到限制。

2 嚙齒類動(dòng)物

嚙齒類動(dòng)物具有繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、容易飼養(yǎng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而小鼠模型最受關(guān)注[15]，小鼠模型主要有以下幾種。

2.1 乳鼠模型

此類模型利用近交系或封閉群乳鼠對(duì)EV71易感的特點(diǎn)來(lái)構(gòu)建。早在1979年，有研究發(fā)現(xiàn)EV71感染新生ICR乳鼠，可以引起ICR乳鼠四肢癱瘓和肌肉壞死等癥。至今有大量關(guān)于乳鼠模型的研究報(bào)道。有研究利用新生ICR乳鼠腹腔注射建立了EV71動(dòng)物模型，乳鼠在攻毒后10 d內(nèi)發(fā)病死亡。同時(shí)進(jìn)行了EV71中和抗體的保護(hù)試驗(yàn)，并證明了其保護(hù)能力，該研究建立了一種母?jìng)骺贵w的評(píng)價(jià)方法，彌補(bǔ)了乳鼠由于易感期短，在接種疫苗后無(wú)法產(chǎn)生抗體的不足[16]。

至今，乳鼠模型的研究已經(jīng)趨近成熟。乳鼠對(duì)EV71易感性與周齡有密切關(guān)系，日齡越小，感染后的表現(xiàn)癥狀越明顯。該類模型一般采用5日齡以內(nèi)的ICR或C57乳鼠[17]，而2周齡及以上的小鼠無(wú)論通過(guò)何種方式感染，均無(wú)法出現(xiàn)感染癥狀[18]。攻毒方式以腹腔、尾靜脈、顱內(nèi)注射為主。一般攻毒后3～5 d發(fā)病，可出現(xiàn)精神萎靡、后肢麻痹、癱瘓、甚至死亡[19-20]。然而該模型具有個(gè)體較小、操作不易等缺點(diǎn)。

2.2 病毒馴化小鼠適應(yīng)株模型

此類模型著眼于對(duì)分離的EV71毒株在實(shí)驗(yàn)小鼠身上多次傳代進(jìn)行訓(xùn)化，使其對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠更易感。有研究將阜陽(yáng)EV71毒株在1日齡的ICR小鼠連續(xù)傳代，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，傳代株感染小鼠后，小鼠的體重增長(zhǎng)緩慢且病毒組織分布、肌肉毒性、感染持續(xù)性高于出發(fā)株[21]。分析認(rèn)為，EV71在小鼠體內(nèi)或者細(xì)胞中經(jīng)過(guò)多次傳代發(fā)生適應(yīng)性突變，某些突變影響這病毒的嗜性和毒性，引起小鼠的適應(yīng)性和神經(jīng)毒性增強(qiáng)。

傳代株雖然有高度的神經(jīng)感染能力，能夠增強(qiáng)小鼠在感染病毒后的發(fā)病癥狀，但是對(duì)延長(zhǎng)小鼠對(duì)病毒易感周齡的作用不大[22]。

2.3 免疫缺陷鼠模型

有研究將EV71病毒在3周齡非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷轉(zhuǎn)基因小鼠(NOD/SCID)中顱內(nèi)多次傳代并感染NOD小鼠模型，該模型對(duì)傳代株表現(xiàn)出較明顯的感染癥狀，且易感期延長(zhǎng)到6周齡[23]。有研究通過(guò)多次傳代獲得了干擾素受體α/β/γ缺失小鼠(AG129)和干擾素受體α/β缺失小鼠(A129)的EV71傳代株。使用該毒株腹腔注射攻毒AG129和A129小鼠，小鼠的易感期達(dá)到10周齡，表現(xiàn)出較高的致死率。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多一個(gè)干擾素因子敲除的AG129小鼠對(duì)馴化毒株更為敏感[24-25]。

免疫缺陷鼠模型雖然延長(zhǎng)了小鼠對(duì)EV71的易感周期，但是由于其缺乏免疫細(xì)胞，無(wú)法用于相關(guān)疫苗的評(píng)價(jià)，也無(wú)法模擬神經(jīng)和心肺癥狀[24]，限制了其應(yīng)用。

2.4 受體基因修飾小鼠模型

近交系小鼠中轉(zhuǎn)入EV71進(jìn)入人體細(xì)胞的受體基因，以期獲得與人類更加相似的感染癥狀，是EV71小鼠模型研究的新突破。相關(guān)受體基因也一直在研究[26]。目前發(fā)現(xiàn)的受體主要有：清道夫受體B2(SCARB2)[27-29]，P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)[29]，樹(shù)突細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子-3捕獲非整合組(DC-SIGN)[30]、膜聯(lián)蛋白A2(Anx2)[31]等。

有研究建立了表達(dá)人PSGL-1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，但是該品系只對(duì)小鼠肌肉適應(yīng)的EV71易感，對(duì)臨床分離株的易感性較差[32]。研究發(fā)現(xiàn)，PSGL-1只是部分EV71毒株感染人T細(xì)胞的受體，在細(xì)胞水平有一定的作用，在動(dòng)物水平的作用則不明顯[33-34]。

SCARB2存在于人上皮細(xì)胞，屬于CD36類溶酶體膜蛋白，在人腸道和呼吸道都有大量表達(dá)[27-28]。目前已經(jīng)有大量的研究確認(rèn)SCARB2是所有EV71毒株感染人的早期受體[35]，在EV71感染過(guò)程中，可與SCARB2結(jié)合并促使EV71完成感染過(guò)程[36]。由此，基于人SCARB2受體的基因修飾小鼠研究比較多，有研究構(gòu)建了SCARB2基因轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)能夠在3周齡通過(guò)顱內(nèi)或尾靜脈感染EV71的Isehara 毒株[37]。另一SCARB2轉(zhuǎn)基因小鼠中，小鼠對(duì)多株EV71病毒易感，但是肢體癱瘓的發(fā)生率卻沒(méi)有明顯的提高[38]。有研究為了增強(qiáng)小鼠的易感性能，將SCARB2受體轉(zhuǎn)入小鼠和STAT-1基因缺失小鼠交配，得到SCARB2(+/+)STAT-1(-/-)雜交小鼠，該小鼠對(duì)EV71更加易感[39]。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因定點(diǎn)敲入的方式構(gòu)建了SCARB2基因敲入小鼠[40]，能夠穩(wěn)定的遺傳插入的人SCARB2基因。該小鼠對(duì)EV71多種毒株易感，能夠呈現(xiàn)最長(zhǎng)6周齡的易感期。通過(guò)顱內(nèi)和尾靜脈注射攻毒后，小鼠模型能夠呈現(xiàn)四肢麻痹、毛發(fā)褶皺、弓背等感染癥狀[41-42]。利用該小鼠模型較長(zhǎng)的易感期，在評(píng)價(jià)EV71疫苗的體內(nèi)保護(hù)力時(shí)，可以采用小鼠自身抗體代替以往母?jìng)骺贵w的方法。

3 小結(jié)和展望

對(duì)于傳染病的研究，不可或缺的就是一個(gè)良好、穩(wěn)定的動(dòng)物模型。就目前的研究，乳鼠模型研究較多，積累的經(jīng)驗(yàn)也比較豐富，但也有本身不可避免的缺點(diǎn)。受體轉(zhuǎn)入小鼠動(dòng)物模型是近幾年伴隨著遺傳修飾技術(shù)而發(fā)展的新型模型，其操作更為方便，更有研究前景。目前，人類SCARB2受體轉(zhuǎn)入模型的構(gòu)建較為成功，隨著人類對(duì)EV71感染過(guò)程的深入了解，更多影響病毒感染以及傳播的受體、免疫因素被發(fā)現(xiàn)，不同種類的受體轉(zhuǎn)入、免疫缺失等遺傳修飾動(dòng)物模型將會(huì)被構(gòu)建。

有學(xué)者認(rèn)為，手足口病動(dòng)物模型的發(fā)病情況取決于病毒、宿主和環(huán)境等因素的共同作用[43]。目前建立的EV71動(dòng)物模型在應(yīng)用上還有很多方面值得進(jìn)行深入研究。