舒潤國，周行，曹子雄，賀康，李飛*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院昆蟲科學(xué)研究所，浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2.Object Research Systems（ORS）公司，加拿大 蒙特利爾（魁北克）H3B 1A7）

微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（micro-computer tomography technology, Micro CT）是一種常用的非破壞性三維（three-dimensional, 3D）成像和分析技術(shù)[1]，其主要原理是由X 射線發(fā)生器發(fā)射X 射線穿透標(biāo)本，置于另一端的探測器記錄該過程，生成射線照片[2]。Micro CT 作為一種成熟的成像方案，已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的各個領(lǐng)域[3-5]。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是在維持物體原有形態(tài)的情況下，以低至幾百納米的分辨率對物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)測。樣品完成掃描后，包含樣品空間結(jié)構(gòu)的圖像數(shù)據(jù)集可以直接存儲，將樣品定格于掃描時(shí)的狀態(tài)。這種技術(shù)能以任何可能的角度研究樣品外部和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)[6]。昆蟲體積小、外骨骼和內(nèi)部結(jié)構(gòu)精細(xì)，對其內(nèi)部組織和器官進(jìn)行解剖觀察時(shí)難以維持形態(tài)完整性。Micro CT 掃描結(jié)果具有高分辨率和無損的特點(diǎn)，可以在不同尺度上對昆蟲內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維重建[7-9]，獲得傳統(tǒng)形態(tài)解剖或組織切片方法難以獲得的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)，以用于精細(xì)觀察昆蟲和比較分析昆蟲發(fā)育過程中內(nèi)部形態(tài)的結(jié)構(gòu)變化[10-11]。因此，Micro CT在昆蟲發(fā)育和內(nèi)部形態(tài)觀察等領(lǐng)域的研究中具有不可替代的優(yōu)勢。

褐飛虱（brown planthopper, BPH），拉丁名為Nilaparvata lugens，是一種重要的半翅目飛虱科水稻害蟲[12]。其在我國廣泛分布，北起吉林、南至廣東[13]。2017—2021年間，褐飛虱在我國南方地區(qū)總體偏重發(fā)生。2022年預(yù)測的我國褐飛虱發(fā)生面積為1.5億畝次（1畝=667.6 m2）[14]。每年我國有約2 667萬hm2水稻田遭受褐飛虱蟲害，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失超過百億元，對我國水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，也嚴(yán)重影響了我國水稻產(chǎn)量[15]。

了解昆蟲內(nèi)部組織和器官的結(jié)構(gòu)是昆蟲發(fā)育和基因功能研究的重要基礎(chǔ)。利用冷凍電鏡（cryoelectron microscopy, Cryo-EM）能夠獲得昆蟲內(nèi)部器官的立體模型，但樣本處理流程復(fù)雜、設(shè)備成本高昂。相較于冷凍電鏡，Micro CT 具有操作簡單、成本低的優(yōu)勢，能夠提供組織和器官水平的清晰成像?；诖?，本研究利用Micro CT觀察并重建了褐飛虱的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以期確定一種適用于昆蟲樣品的染色方法、樣本重建和建模流程，獲得褐飛虱消化、生殖、神經(jīng)以及肌肉等多個不同組織和器官的立體三維模型，為昆蟲形態(tài)學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的研究提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料與設(shè)備

1.1.1 供試蟲源

褐飛虱來源于浙江大學(xué)昆蟲基因組與生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室。用水稻幼苗飼喂。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±1）℃，相對濕度（60±10）%，光照周期16 h 光照/8 h 黑暗。羽化后3～5 d，挑取10 頭成蟲用于染色，根據(jù)預(yù)染結(jié)果選取染色效果最好的褐飛虱雌、雄蟲各1頭，用于后續(xù)掃描、3D重構(gòu)和建模。

1.1.2 試劑和儀器

布因氏固定液，購自上海吉至生化科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)魯格氏染色液，購自上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。RH-24 搖床，購自美國康寧儀器公司；SkyScan 1272 高分辨率三維X 射線顯微鏡，購自德國布魯克公司，詳細(xì)參數(shù)見表1。

表1 SkyScan 1272 CMOS技術(shù)參數(shù)Table 1 SkyScan 1272 CMOS specifications

1.2 褐飛虱染色、掃描、重構(gòu)流程

染色流程：使用二氧化碳（CO2）麻醉褐飛虱成蟲后，將其轉(zhuǎn)移至含有1 mL 0.5%Triton X-100 PBS（0.5%PBST）的1.5 mL 離心管中。蓋上試管蓋，于試驗(yàn)臺上輕微敲打后孵育5 min，使褐飛虱成蟲下沉到離心管底部。采用1 mL 的布因氏溶液固定試蟲16～24 h，隨后在1 mL PBS 中清洗3 次，每次30 min。清洗完成后使用標(biāo)準(zhǔn)魯格氏染液染色，轉(zhuǎn)移到搖床上孵育5 d。然后將褐飛虱在PBS中清洗，并用PBS保存以供掃描分析。樣品制作完成后的1周內(nèi)進(jìn)行掃描[5]。

上樣裝置：將褐飛虱樣本置于PBS中掃描。將200 μL 黃槍頭尖端封口，注入PBS 后放入樣本，槍頭上部使用封口膜密封。以聚丙烯為原材料的槍頭壁?。ū诤?00～300 μm）且具有相對較低的X射線吸收，同時(shí)其錐形的設(shè)計(jì)使樣品能夠穩(wěn)定地保存。上樣裝置見圖1A。

掃描流程：使用安裝SkyScan 軟件（Micro CT，v1.2.0，德國布魯克公司）的戴爾工作站控制SkyScan 1272高分辨率三維X射線顯微鏡掃描樣品（圖1B～C）。X 射線源電壓和電流分別設(shè)置為50 kV、70 μA。用尺寸為1 632像素×1 092像素的傳感器，像素為7.4 μm、圖片分辨率為4.0 μm 的相機(jī)進(jìn)行掃描，掃描時(shí)長為1 h：43 min：42 s。隨機(jī)移動算法參數(shù)值設(shè)為30，以糾正樣品旋轉(zhuǎn)過程中可能出現(xiàn)的晃動導(dǎo)致的圖像模糊。平均幀數(shù)設(shè)置為6，以增加信噪比。

圖1 Micro CT內(nèi)、外部結(jié)構(gòu)Fig.1 Internal and external structures of Micro CT

重構(gòu)流程：重建數(shù)據(jù)借助NRecon 軟件（Micro CT，v1.2.0，德國布魯克公司）完成。Micro CT 數(shù)據(jù)的重建受采集圖像數(shù)據(jù)的影響，包括圖像亮度、對比度。在褐飛虱的重建過程中，使用默認(rèn)的移位校正來補(bǔ)償掃描過程中的樣品移動（即熱波動或緩慢的樣品運(yùn)動），環(huán)形偽影矯正和射線硬化補(bǔ)償設(shè)置為默認(rèn)值。輸出圖像的位深為16 Bit。重建后的圖像尺寸為620×620×912（像素×像素×切片數(shù)），每個體素大小為4.0 μm。

1.3 Micro CT 圖像分析

在技嘉工作站［i9-11900 英特爾酷睿處理器，3.00 GHz（16 核），128 GB 內(nèi)存，英偉達(dá)GeForce RTX 3070Ti 顯卡（8 GB 內(nèi)存）］上運(yùn)行Dragonfly 軟件［v2022.1，加拿大Object Research Systems（ORS）公司；http://www.theobjects.com/dragonfly］以進(jìn)行圖像分割。圖像分割的基礎(chǔ)方法是使用3D畫筆手動將需要提取的結(jié)構(gòu)標(biāo)記為感興趣區(qū)域（region of interest,ROI）。為了消除分割過程中的人為偏差，可以使用包含大津算法的畫筆快速提取高密度的區(qū)域。最后將ROI 轉(zhuǎn)換為三角片網(wǎng)格（mesh）模型以進(jìn)行定量分析和可視化。圖像分割過程中，可以適當(dāng)使用Dragonfly 軟件內(nèi)置的深度學(xué)習(xí)功能實(shí)現(xiàn)自動分割。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱內(nèi)部組織和器官的建模流程

褐飛虱Micro CT圖像建模的流程見圖2。使用SkyScan 1272軟件控制儀器進(jìn)行測量規(guī)劃和數(shù)據(jù)采集，以得到褐飛虱投影圖。利用NRecon軟件將褐飛虱投影圖重建成切片圖像序列組成的數(shù)據(jù)體，隨后將褐飛虱數(shù)據(jù)體導(dǎo)入Dragonfly 軟件進(jìn)行姿態(tài)矯正和有效信號放大。手動繪制部分目標(biāo)區(qū)域，供軟件進(jìn)行深度學(xué)習(xí)，通過分割預(yù)覽圖和Dice函數(shù)評估深度學(xué)習(xí)分割的準(zhǔn)確度。依據(jù)深度學(xué)習(xí)分割的效果決定選擇深度學(xué)習(xí)分割還是手動分割，分割完成后進(jìn)行手工修復(fù)以糾正深度學(xué)習(xí)分割或手動分割的錯誤，最終得到褐飛虱內(nèi)部組織和器官的精確模型。

圖2 原始Micro CT圖像的三維建模流程Fig.2 3D reconstruction procedures of the original Micro CT images

2.1.1 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理

受樣品自身姿態(tài)和上樣裝置的影響，樣品的XY平面與樣品Z軸會存在一定的傾斜，使得組織特征無法被明顯識別，影響后續(xù)分割的精準(zhǔn)性。所以，對采集到的Micro CT原始數(shù)據(jù)進(jìn)行姿態(tài)矯正是建模前原始數(shù)據(jù)預(yù)處理中不可或缺的一步。圖3A1～A3是未進(jìn)行姿態(tài)矯正的原始Micro CT圖像，圖3B1～B3是進(jìn)行姿態(tài)矯正后的Micro CT圖像，可以看出校正后的圖像中褐飛虱內(nèi)部組織呈對稱分布，組織特征更為明顯。

圖3 樣本姿態(tài)矯正前（A1～A3）和姿態(tài)矯正后（B1～B3）的Micro CT圖像Fig.3 Micro CT images before sample position correction(A1-A3)and after sample position correction(B1-B3)

Micro CT利用不同組織對X射線吸收的差異，將組織的密度進(jìn)行量化處理后轉(zhuǎn)化為閾值，并直接作為圖像灰度密度值輸出。切片圖像序列組成的數(shù)據(jù)體位深通常為8 Bit（256 個灰度級數(shù)）或者16 Bit（65 536個灰度級數(shù)）。位深越高，圖像所記錄的灰度級數(shù)就越高，包含的密度信息也就越多，更有利于圖像分割，因此本研究使用16 Bit 來保存重建后的切片圖像。在Dragonfly 軟件中進(jìn)行深度學(xué)習(xí)圖像分割時(shí)，基于分割區(qū)域的有效灰度密度值通常僅占總灰度級數(shù)的一小部分，為充分利用灰度密度的動態(tài)范圍和提高深度學(xué)習(xí)模型對灰度數(shù)據(jù)的識別能力，需要對原始輸出圖像的灰度密度值采取進(jìn)一步的歸一化處理。具體來說，本研究發(fā)現(xiàn)包含有褐飛虱組織的灰度密度值主要位于［0，20 000］這一灰度區(qū)間，因此先將數(shù)據(jù)體中灰度密度值超出20 000的值替換為20 000，再將替換后的數(shù)據(jù)體灰度密度值通過線性轉(zhuǎn)換使其范圍拉伸至［0，65 536］。從圖4 中可以看出，有效信號放大后的數(shù)據(jù)灰度密度直方圖（圖4B）相對于此前（圖4A）明顯向右拉伸，表明實(shí)際有效的數(shù)據(jù)所占據(jù)灰度密度更多。

圖4 有效信號放大前（A）和有效信號放大后（B）的灰度密度直方圖Fig.4 Gray density histograms before effective signal amplification(A)and after effective signal amplification(B)

2.1.2 深度學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練和評估運(yùn)用

深度學(xué)習(xí)是以不少于2個隱含層的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對輸入進(jìn)行非線性變換或表示學(xué)習(xí)的技術(shù)。該技術(shù)通過構(gòu)建深層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行各項(xiàng)分析活動，被廣泛應(yīng)用在圖像識別和語音識別中[16]。褐飛虱肌肉組織具有較好的對稱性，是較為合適的深度學(xué)習(xí)樣本。因此，以褐飛虱肌肉組織為例，使用Dragonfly 軟件進(jìn)行深度學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練，以通過少量切片上的標(biāo)記得到一個可以自動分割本數(shù)據(jù)體中所有其他切片圖像的模型。使用畫筆創(chuàng)建繪制不同Z軸位置的X-Y平面褐飛虱肌肉組織的ROI，盡可能選取差異較大的圖片繪制ROI以作為輸入數(shù)據(jù)，為深度學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練提供更多的信息。輸入的訓(xùn)練數(shù)據(jù)如圖5 和表2所示，沿Z軸方向選取5張代表性切片，目標(biāo)ROI使用綠色標(biāo)記，剩余區(qū)域?yàn)楸尘癛OI，使用紫色標(biāo)記。

表2 訓(xùn)練數(shù)據(jù)相關(guān)的體素信息Table 2 Voxel information related to training data

圖5 訓(xùn)練數(shù)據(jù)的相關(guān)位置信息Fig.5 Related position information of training data

利用模型生成器生成深度學(xué)習(xí)模型，模型架構(gòu)為U-N，把同一數(shù)據(jù)體中與標(biāo)記切片相鄰的若干張切片同時(shí)作為模型輸入（即Dragonfly 軟件中的2.5D 維度），相鄰切片圖像設(shè)置為3，深度學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練參數(shù)設(shè)置見表3。使用Dragonfly 軟件的智能分割向?qū)Чぞ撸⊿egmentation Wizard）時(shí)，所有手動標(biāo)記的訓(xùn)練數(shù)據(jù)會被分為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集、測試集3個部分，訓(xùn)練集用于深度學(xué)習(xí)模型的直接訓(xùn)練，驗(yàn)證集用于對模型進(jìn)行調(diào)控以減少過擬合[17]，測試集用于對訓(xùn)練完的模型進(jìn)行評分（測試集數(shù)據(jù)完全不參與模型訓(xùn)練）。輸入的5 個樣本被軟件劃分為41個可用圖像塊（Patch），其中32 個用于訓(xùn)練，7 個用于驗(yàn)證，2個用于測試。為了增加訓(xùn)練數(shù)據(jù)量，軟件使用數(shù)據(jù)增強(qiáng)功能對原始訓(xùn)練集進(jìn)行翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)和扭曲等變形處理以擴(kuò)充Patch數(shù)和提高模型的泛化性。在執(zhí)行移動步長（stride ratio）=0.25以及圖像個數(shù)增加20 倍之后，實(shí)際用于訓(xùn)練模型的訓(xùn)練集Patch數(shù)目達(dá)到6 321個。

表3 深度學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練參數(shù)Table 3 Training parameters of deep learning model

用訓(xùn)練集損失值和驗(yàn)證集損失值繪制損失函數(shù)曲線以評估深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)趨勢，結(jié)果如圖6 所示。當(dāng)循環(huán)次數(shù)為1～20 時(shí)，隨著訓(xùn)練循環(huán)次數(shù)的增加，訓(xùn)練集損失值和驗(yàn)證集損失值整體呈下降趨勢，表明深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)正常。在循環(huán)次數(shù)達(dá)到20以后，訓(xùn)練集損失值和驗(yàn)證集損失值趨于穩(wěn)定，代表深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)達(dá)到優(yōu)化瓶頸（圖6A）。為了得到直觀的訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)展示效果，可在Dragonfly軟件中選取一張圖片作為“視覺監(jiān)控”（監(jiān)控圖片無需手工標(biāo)記），每次循環(huán)后深度學(xué)習(xí)模型會基于訓(xùn)練結(jié)果對該圖片進(jìn)行預(yù)測，直接展現(xiàn)深度學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練后的分割效果。監(jiān)控圖結(jié)果如圖6B 所示，C0 圖中紅色標(biāo)注為人工繪制的目標(biāo)區(qū)域，C1～C30代表循環(huán)第1—30次后深度學(xué)習(xí)模型識別目標(biāo)區(qū)域的效果。

深度學(xué)習(xí)模型最初完全無法識別出目標(biāo)ROI（綠色），隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，識別的精度逐步提高。當(dāng)循環(huán)次數(shù)達(dá)到25時(shí)，通過監(jiān)控圖可以看出深度學(xué)習(xí)的結(jié)果和手動分割的結(jié)果相當(dāng)接近，代表此時(shí)的模型已經(jīng)可以用于下一步的分割（圖6B）。終止學(xué)習(xí)后，軟件會自動對訓(xùn)練后的深度學(xué)習(xí)模型在測試集上計(jì)算Dice分?jǐn)?shù)作為評分，此模型評分結(jié)果為0.96（滿分為1）。將該模型應(yīng)用于褐飛虱數(shù)據(jù)體輸出深度學(xué)習(xí)提取的褐飛虱肌肉ROI（圖7）。需要注意的是，本案例中深度學(xué)習(xí)模型只在這一個數(shù)據(jù)體的少量切片上進(jìn)行訓(xùn)練從而提取這一個組織結(jié)構(gòu)，因此該模型只能用于本數(shù)據(jù)體對應(yīng)組織的分割，不具有更高的泛化性。更改輸入數(shù)據(jù)（如其他昆蟲的數(shù)據(jù)體）或更改分割組織（例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)），都需要重新進(jìn)行深度學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練。此外，利用深度學(xué)習(xí)分割的方法并不一定適用于所有組織，對于某些組織來說，花費(fèi)在訓(xùn)練高性能模型所需的時(shí)間成本可能超過直接對完整數(shù)據(jù)體進(jìn)行人工分割。因此，在深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練分割不能快速達(dá)到理想效果時(shí)，我們轉(zhuǎn)為基于畫筆、輪廓線、插值等傳統(tǒng)方法的手動分割。

圖6 深度學(xué)習(xí)模型對應(yīng)的損失函數(shù)曲線（A）和監(jiān)控圖（B）Fig.6 Loss function curve(A)and monitoring pictures(B)of deep learning model

2.1.3 手工修復(fù)與立體模型優(yōu)化

深度學(xué)習(xí)的運(yùn)用簡化了煩瑣耗時(shí)的ROI提取過程，但其最終的輸出結(jié)果仍會存在部分偏差，例如缺失標(biāo)記和多余標(biāo)記。人工分割也會存在繪制時(shí)的筆誤。因此，為進(jìn)一步提高ROI模型的精確性，深度學(xué)習(xí)分割或人工分割的結(jié)果都需要進(jìn)行手工修復(fù)，即使用3D 畫筆填補(bǔ)ROI 缺失部分，擦除多余部分；使用Dragonfly 軟件中的ROI 修復(fù)程序過濾掉小體積的孤島ROI，利用平滑算法優(yōu)化ROI，最后將ROI導(dǎo)出為網(wǎng)格（mesh）。各個階段產(chǎn)生的結(jié)果如圖7所示，從左到右依次為深度學(xué)習(xí)模型分割的肌肉ROI（綠色）、經(jīng)過手工修復(fù)的ROI（紫色）、平滑后的ROI（橙色）和最終的肌肉網(wǎng)格（mesh）模型（黃褐色）。

圖7 手工修復(fù)與立體模型優(yōu)化階段的肌肉模型輸出結(jié)果Fig.7 Muscle model output results from manual repair and stereological model optimizing stages

2.2 褐飛虱三維模型

依據(jù)上述分割流程，重建了褐飛虱體內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)（圖8）。其中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化道和生殖系統(tǒng)利用深度學(xué)習(xí)模型未能得到很好的分割效果，故以人工方式進(jìn)行分割。肌肉組織則采用訓(xùn)練好的深度學(xué)習(xí)模型進(jìn)行分割。將深度學(xué)習(xí)分割和人工分割的結(jié)果經(jīng)人工矯正和立體模型優(yōu)化后，得到了褐飛虱的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)的網(wǎng)格模型，并制作展示視頻（圖8中二維碼）。

在褐飛虱中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其頭部復(fù)眼視葉、大腦的立體結(jié)構(gòu)層次分明，咽腹側(cè)感覺中樞通過凸緣與大腦相連。前胸神經(jīng)節(jié)、中胸神經(jīng)節(jié)和后胸神經(jīng)節(jié)組成的胸神經(jīng)節(jié)凸起明顯。肌肉組織占據(jù)了胸節(jié)的主要空間，是褐飛虱運(yùn)動和飛行的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。不同肌肉的形態(tài)以及在體內(nèi)的傾斜角度差異明顯，以特定的模式排列于胸節(jié)內(nèi)。食道、中腸和后腸依次相接，馬氏管以一定角度環(huán)繞于中腸后端，組成消化道。褐飛虱雄性生殖系統(tǒng)模型內(nèi)，精巢和輸精管堆疊于附腺上方，射精管從中伸出。褐飛虱雌性生殖系統(tǒng)模型內(nèi)，卵巢中可見發(fā)育時(shí)期不同的卵，側(cè)輸卵管位于卵巢的下方，向前匯聚與中輸卵管相連（圖8）。在得到不同組織和器官的三維模型后，利用Dragonfly軟件的測量功能統(tǒng)計(jì)模型對應(yīng)的體積，結(jié)果見表4。需要指出的是，本測量結(jié)果僅反映單個褐飛虱樣本的情況，不具有普遍性。

表4 褐飛虱三維模型結(jié)構(gòu)的體積Table 4 Volumes of structures of 3D model of BPH

圖8 褐飛虱內(nèi)部結(jié)構(gòu)三維模型Fig.8 3D model of internal structures of BPH

2.3 三維重構(gòu)系統(tǒng)的成本與參數(shù)比較

利用德國布魯克公司的商業(yè)SkyScan 1272 Micro CT系統(tǒng)以及加拿大ORS公司的Dragonfly軟件，能夠?qū)崿F(xiàn)以最低4.0 μm的像素分辨率對褐飛虱昆蟲內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。對其相關(guān)成本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)估算，并基于冷凍電鏡構(gòu)建褐飛虱模型的成本[18]，對不同重構(gòu)系統(tǒng)的成本進(jìn)行比較，結(jié)果如表5 所示。從中可知：基于Micro CT的三維重構(gòu)系統(tǒng)的搭建費(fèi)用為300 多萬元，遠(yuǎn)低于基于冷凍電鏡的三維重構(gòu)系統(tǒng)所需的1 000 多萬元。此外，由于冷凍電鏡對樣品的處理有著特殊要求，還需要采購特殊的樣品處理裝置（如臨界點(diǎn)干燥儀和超薄冷凍切片機(jī)）來處理樣本，這進(jìn)一步增加了使用成本。但是，基于Micro CT 的褐飛虱三維重構(gòu)系統(tǒng)在精度上最高僅能達(dá)到4.0 μm，與冷凍電鏡的50 nm有著較大差距。以浙江大學(xué)儀器共享服務(wù)平臺公布的信息為參考，兩者使用過程中均按照掃描時(shí)間計(jì)費(fèi)，使用Micro CT 為600 元/h，冷凍電鏡為900 元/h。本研究掃描的褐飛虱，其單個樣品掃描成本約為1 000 元。因此，基于冷凍電鏡的褐飛虱三維重構(gòu)的單個樣本實(shí)際掃描成本為10萬～20萬元（表5）。由此可得，當(dāng)研究的尺度位于微米水平時(shí)，Micro CT是更為經(jīng)濟(jì)便利的成像方案。

3 討論

作為一種非侵入性成像技術(shù)，Micro CT 在材料、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。褐飛虱是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，其內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)與之危害性密切相關(guān)。因此，系統(tǒng)揭示褐飛虱內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)將有助于揭示該物種深層次的危害機(jī)制。但采用傳統(tǒng)的解剖學(xué)方法將組織從昆蟲體內(nèi)分離的同時(shí)，也破壞了組織在個體背景下的分布情況。2021 年，WANG 等[18]利用大尺度三維電鏡技術(shù)重構(gòu)出稻飛虱納米級分辨率的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)布了首個納米級的褐飛虱三維結(jié)構(gòu)模型，為褐飛虱形態(tài)觀察提供了新的方式。但冷凍電鏡設(shè)備高昂的成本和樣品處理的復(fù)雜性，使得研究者很難將該技術(shù)廣泛用于褐飛虱研究結(jié)果的展示。由此，本研究以Micro CT為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一套適用于褐飛虱的三維模型重構(gòu)流程，以相對較低的成本完成了包括褐飛虱中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)在內(nèi)的立體模型構(gòu)建。同時(shí)，該研究也為利用Micro CT構(gòu)建其他昆蟲立體模型提供了參考。

相較于傳統(tǒng)的解剖學(xué)，Micro CT的主要優(yōu)勢是能夠獲得精確的形態(tài)信息，進(jìn)而方便研究者了解昆蟲內(nèi)部組織和器官的正確分布位置和不同組織之間的相對位置關(guān)系。結(jié)果表明，通過合適的染色方法和組織建模流程，無需花費(fèi)大量的時(shí)間和精力對昆蟲進(jìn)行解剖，就可以獲得清晰的昆蟲組織結(jié)構(gòu)，并從中獲得組織和器官的形態(tài)學(xué)信息。

本研究中的建模流程包括原始數(shù)據(jù)預(yù)處理，深度學(xué)習(xí)模型的訓(xùn)練和評估運(yùn)用，人工分割、矯正與立體模型優(yōu)化三大部分。經(jīng)過處理后的原始數(shù)據(jù)，其信息準(zhǔn)確度和豐度明顯提升，預(yù)處理后的圖像不僅有助于人工識別目標(biāo)組織，也有助于深度學(xué)習(xí)模型提高識別的精確性。傳統(tǒng)的Micro CT模型構(gòu)建，需要手工繪制幾百張平面圖堆疊得到三維模型，而深度學(xué)習(xí)只需要輸入幾張人工繪制的樣本，經(jīng)過模型訓(xùn)練和應(yīng)用之后就能得到近似人工分割的結(jié)果。在訓(xùn)練維度的選擇上，使用了2.5D 維度，將當(dāng)前圖像的前后相鄰圖像也納入訓(xùn)練范圍，增加了立體維度的數(shù)據(jù)，為深度學(xué)習(xí)增加了更多的樣本量。當(dāng)訓(xùn)練的結(jié)果達(dá)到預(yù)期時(shí)，即可終止訓(xùn)練。深度學(xué)習(xí)雖然能實(shí)現(xiàn)自動化的分割，但受圖片質(zhì)量、訓(xùn)練次數(shù)和訓(xùn)練樣本量等多種因素的影響，很難達(dá)到100%的精確度，因此本研究加入了人工糾錯的環(huán)節(jié)，對深度學(xué)習(xí)分割的ROI 進(jìn)行最后校正。需要指出的是，以目前的技術(shù)水平，深度學(xué)習(xí)分割并不能完全適用于所有的組織。對于一些不規(guī)則或者無明顯特征的組織，有時(shí)經(jīng)過長時(shí)間的深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練也很難達(dá)到可用的分割效果。以消化道為例，其在褐飛虱體內(nèi)并不如肌肉一樣呈對稱分布，而是盤曲環(huán)繞在腹部，對此深度學(xué)習(xí)分割難以取得較好的分割效果。相較于花費(fèi)較長時(shí)間去調(diào)整參數(shù)訓(xùn)練深度學(xué)習(xí)模型，采用傳統(tǒng)的人工分割時(shí)間成本更低。但進(jìn)行分割時(shí)，推薦先使用深度學(xué)習(xí)進(jìn)行嘗試，最后考慮人工分割方案。

依據(jù)此建模流程，重構(gòu)了褐飛虱中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)的立體模型。與常規(guī)解剖相比，本研究建立的模型更為精確地展現(xiàn)了褐飛虱體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，也保留了這些組織和器官的原始狀態(tài)。同時(shí)，這些模型還可用于空間體積和長度的定量分析，精準(zhǔn)記錄褐飛虱生長發(fā)育中組織和器官的變化過程。

4 結(jié)論

本研究提出了一種基于Micro CT 的褐飛虱內(nèi)部模型重構(gòu)流程。基于該流程完成了褐飛虱體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織、消化道和生殖系統(tǒng)立體模型的構(gòu)建。研究結(jié)果表明，Micro CT可用于褐飛虱組織和器官級別的全背景成像，提供精確的三維形態(tài)分析，為褐飛虱的表型研究提供了一種行之有效的新方法。此方法還可以與基因突變研究結(jié)合，進(jìn)行精準(zhǔn)的形態(tài)變化的定量分析，為褐飛虱的發(fā)育提供更為豐富的信息。此外，基于全背景成像的特點(diǎn)，首先可以用該方法系統(tǒng)評估發(fā)育缺陷，然后使用高分辨率顯微鏡顯示特定發(fā)育缺陷，實(shí)現(xiàn)類似光電聯(lián)用顯微技術(shù)的效果。

致謝浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測試中心理化分析室的杏朝剛老師在樣本掃描方面給予了寶貴的協(xié)助和指導(dǎo)，特此感謝！