陳勇，江唯健，王加俊，張帆，沈立榮*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2.杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司，杭州 311500）

蜂王漿是由5～15 日齡工蜂頭部營養(yǎng)腺（包括腦后腺、咽下腺和上顎腺等）分泌的特殊白色乳狀物質(zhì)，專供蜂王和3日齡內(nèi)工蜂幼蟲食用，是決定蜜蜂雌性幼蟲發(fā)育成為蜂王還是工蜂的關(guān)鍵食物因子[1]。作為一種營養(yǎng)保健品，蜂王漿含有的活性物質(zhì)很多，其功能與所含的生物活性成分有關(guān)，主要包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類和10-羥基-2-葵烯酸（10-hydroxydec-2-enoic acid,10-HDA）等[2]。在常溫下，蜂王漿的生物活性會隨貯存時(shí)間的延長而下降，導(dǎo)致其極易變質(zhì)而失去營養(yǎng)功能。目前，10-HDA 含量是我國國家標(biāo)準(zhǔn)中衡量蜂王漿品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)（GB 9697—2008）[3]，但在長期貯存過程中，蜂王漿中的10-HDA 含量非常穩(wěn)定，并不適合作為代表蜂王漿新鮮度的指標(biāo)[4]。

蛋白質(zhì)是蜂王漿的主要活性物質(zhì)，其含量約占蜂王漿干質(zhì)量的30%～50%，其中由9 個(gè)成員（MRJP1～9）組成的蛋白家族——王漿主蛋白（major royal jelly proteins, MRJPs）約占蜂王漿中可溶性蛋白含量的90%[5]。在常溫貯存條件下，由于蜂王漿中內(nèi)源性酶的作用，MRJPs 會隨著貯存時(shí)間的推移而降解，引起結(jié)構(gòu)改變和含量下降，喪失關(guān)鍵生物活性。因此，日本學(xué)者KAMAKURA等[6]提出以MRJPs 中含量最高的MRJP1 作為蜂王漿新鮮度的檢測指標(biāo)。BíLICOVá 等[7]和本團(tuán)隊(duì)[4]先后研發(fā)了MRJP1 含量的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）快速檢測法。近年來，胡菡等[8]制備和研發(fā)了以MRJP3為抗原的單克隆抗體和ELISA 檢測方法。但ELISA 是比較粗放的定性定量檢測方法，而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測方法是當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的技術(shù)手段之一，在食品特定蛋白質(zhì)定量檢測中已被廣泛應(yīng)用[9-10]，在現(xiàn)有條件下更適合用于MRJPs的檢測。

2018 年，LIN 等[11]報(bào)道了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以篩選出的單一MRJP1 特異性多肽“FFDYDFGSDER”為標(biāo)志物檢測MRJP1 含量的方法，用于判斷蜂王漿的真假和質(zhì)量優(yōu)劣。但MRJPs 是一組需要通過整體協(xié)同作用發(fā)揮生物活性的功能蛋白，特別是主蛋白MRJP1～5 均屬于糖基化蛋白，占MRJPs 總量的80%以上[5]。事實(shí)上，蜂王漿促進(jìn)生育和抗衰老功能是MRJPs 整體協(xié)同作用的結(jié)果[12]，而以往報(bào)道的檢測蜂王漿新鮮度的方法基本以某種單一MRJP 含量為主要目標(biāo)，缺乏多種蛋白組合的綜合性評價(jià)方法。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本研究探索了一種采用MRJP1～3 的3 種標(biāo)志多肽精準(zhǔn)檢測蜂王漿新鮮度的方法，以期為蜂王漿質(zhì)量評價(jià)提供一種具有高度特異性的新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮蜂王漿：從杭州碧于天保健品有限公司合作養(yǎng)蜂場采集，當(dāng)天將采集的蜂王漿在－20 ℃條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，并保存于－80 ℃冰箱中。

主要試劑：二硫蘇糖醇（dithiothreitol,DTT）、碘代乙酰胺（iodoacetamide,IAA）和碳酸氫銨，均購自美國Sigma 公司；純甲酸、乙腈和甲醇均為高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）級，購自德國Merck 公司；重組牛胰蛋白酶，購自杭州譜勝檢測科技有限責(zé)任公司；氧化銅、銅、氧化鉻、高氯酸鎂、銀棉和石英棉，均購自英國PDZ-Europa 公司；硫酸和二水合鎢酸鈉，購自北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司。

標(biāo)志多肽YNGVPSSLNVISK、TLQMIAGMK和LTVAGESFTVK以及它們的同位素標(biāo)志肽YNG VPSSL*NVISK、TL*QMIAGMK 和L*TVAGESFTVK由安徽省國平藥業(yè)有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity 超高效液相色譜儀、Synapt G2 HDMS飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和Xevo-TQD 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），SK30G 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），超低溫冰箱（日本Panasonic公司），BS124S 電子天平（德國Sartorius 公司），SAS-67120 純水儀（法國Millipore 公司），DKS-24電熱恒溫水浴鍋（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司），旋渦混合器（北京市長安儀器廠），Integra-CN 穩(wěn)定碳氮同位素分析儀（英國PDZ-Europa 公司），配備50 mL 離心管的Z320 離心機(jī)（德國Berthold Hermle公司）。

1.3 方法

1.3.1 王漿粗蛋白制備

將鮮蜂王漿溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），以1.2×104r/min 離心30 min，取上清液并置于透析袋（截留分子量8 000～1.4×104Da）中，在4 ℃條件下用雙蒸水透析24 h得到王漿粗蛋白，保存于－80 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 王漿主蛋白的提取及酶解方法

稱取0.1 g 蜂王漿樣品于8 mL 碳酸氫銨溶液（0.1 mol/L）中，充分溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容。取930 μL上述溶解液與10 μL DTT（100 mmol/L）于2 mL離心管中，振蕩混勻后，置于50 ℃恒溫水浴鍋中孵育30 min。將30 μL IAA（100 mmol/L）加入上述混合液，振蕩混勻，然后于黑暗環(huán)境、室溫條件下反應(yīng)30 min。隨后，加入10 μL 重組牛胰蛋白酶溶液（500 μg/mL）并振蕩混勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中酶解，2 h 后加入10 μL 10%甲酸終止酶解反應(yīng)。最后，加入10 μL同位素標(biāo)志肽YNGVPSSL*NVISK、TL*QMIAGMK 和L*TVAGESFTVK 的混合物（10 μg/mL），經(jīng)0.22 μm膜過濾后，上機(jī)分析。

1.3.3 標(biāo)志肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

取YNGVPSSLNVISK 標(biāo)準(zhǔn)品溶解于純水，配制成質(zhì)量濃度為10～1 600 ng/mL的溶液，其中包含100 ng/mL 同位素標(biāo)志肽YNGVPSSL*NVISK；取TLQMIAGMK標(biāo)準(zhǔn)品溶解于純水，配制成質(zhì)量濃度為10～600 ng/mL的溶液，其中包含100 ng/mL同位素標(biāo)志肽TL*QMIAGMK；同樣，取LTVAGESFTVK標(biāo)準(zhǔn)品溶解于純水，配制成質(zhì)量濃度為10～600 ng/mL 的溶液，其中包含100 ng/mL 同位素標(biāo)志肽L*TVAGESFTVK。上述3種加標(biāo)溶液經(jīng)0.22 μm膜過濾后，用于上機(jī)進(jìn)樣分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

MRJP1～3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和含量計(jì)算：在Masslynx v4.1 自帶定量軟件Targetlynx 中，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（x），以標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)際檢測峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所測多肽中實(shí)際檢測峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算多肽濃度。

1.3.4 超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS）定性分析

使用C18 蛋白分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），A相為0.1%甲酸溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈溶液，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為40 ℃，樣品室溫度為10 ℃。洗脫條件：0～20 min 3%～40% B，20～20.1 min 40%～100% B，20.1～22.1 min 保持100%B，22.1～22.2 min 100%～3%B，最后平衡2.8 min。采用配備電噴霧離子源（electron spray ionization,ESI）的Synapt G2 HDMS 高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。具體檢測條件如下：采用ESI+模式，毛細(xì)管電壓為3 kV，樣品錐孔電壓為25 V，萃取錐孔電壓為4 V，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑溫度為350 ℃，錐孔反吹氣流為50 L/h，脫溶劑氣流為650 L/h，循環(huán)碰撞能量為15～35 V，參比物質(zhì)為亮氨酸-腦啡肽（leucine-enkephalin）。使用ProteinLynx全球服務(wù)器（ProteinLynx Global Server,PLGS）v2.5 軟件（美國Waters公司）對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：采用電噴霧模式，水解酶為胰蛋白酶，鎖定質(zhì)量為1 556.277 1 Da，允許漏切數(shù)為1，每個(gè)肽的最小片段離子匹配數(shù)為2，每個(gè)蛋白質(zhì)的最小片段離子匹配數(shù)為5，固定修飾為氨基甲酰胺C（carbamdomethyl C），采用UniProtKB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/blast），其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3.5 超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, UPLC-TQMS）定量分析

使用C18 蛋白分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），A相為0.1%甲酸溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈溶液，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40 ℃，樣品室溫度為10 ℃。洗脫條件：0～1 min 3%B，1～1.5 min 3%～20%B，1.5～3.5 min 20%～60%B，3.5～3.6 min 60%～100%B，3.6～4.1 min保持100% B，4.1～4.2 min 100%～3% B，最后平衡1 min。采用配備電噴霧離子源的Xevo-TQD 三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。具體檢測條件如下：采用ESI+模式，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為350 ℃，錐孔反吹氣流為50 L/h，脫溶劑氣流為650 L/h，氬氣碰撞壓為0.35 Pa。

1.3.6 標(biāo)志多肽篩選

基于UPLC-TQMS分析，對候選多肽作重復(fù)檢測，初步剔除峰面積小于2 000的低含量多肽，建立MRJPs候選多肽酶解時(shí)間與酶解程度的熱圖，進(jìn)一步篩選出同時(shí)具備高易酶解性與酶解后高穩(wěn)定性的候選MRJPs 多肽。高易酶解性多肽的篩選標(biāo)準(zhǔn)是候選多肽的相對峰面積比值在酶解2 h 內(nèi)達(dá)到90%以上，酶解后高穩(wěn)定性多肽的篩選標(biāo)準(zhǔn)是候選多肽的相對峰面積比值在酶解24 h 后不小于70%。剔除候選多肽中的非特異性多肽。

1.3.7 候選多肽的定量質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測分析

使用PLGS 蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺，將經(jīng)UPLCTQMS檢測出的MRJPs多肽序列信息輸入U(xiǎn)niProtKB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/blast），與獲取的MRJPs多肽序列進(jìn)行比對，得到王漿粗蛋白酶解產(chǎn)物中MRJPs多肽的鑒別結(jié)果。將經(jīng)UPLC-QTOF/MS 分析得到的MRJPs 多肽參數(shù)導(dǎo)入U(xiǎn)PLCTQMS 儀器，建立候選多肽的定量質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring,MRM）分析方法。

1.3.8 基于MRJP1～3 含量的蜂王漿新鮮度檢測

蜂王漿樣品模擬加溫老化處理：將蜂王漿樣品置于40 ℃條件下恒溫貯存，每隔7 d 取出部分于－80 ℃冰箱中冷藏，分別編號為A～F，即編號A～F的樣品分別是在40 ℃條件下恒溫貯存第0、7、14、21、28、35 天的蜂王漿。每個(gè)處理重復(fù)3 次。按照前述UPLC-TQMS 方法，通過檢測樣品中的MRJP1～3含量來判定蜂王漿的新鮮度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0 軟件中的新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRJPs 酶解多肽分析

采用PLGS 蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺，將經(jīng)UPLCQ-TOF/MS 檢測出的MRJPs 多肽序列信息與從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProtKB 中獲取的MRJPs 多肽序列理論信息作對比分析，得到王漿粗蛋白中MRJPs的鑒別結(jié)果。如將序列LTVAGESFTVK 提交到UniProtKB 進(jìn)行比對，獲得的3 條信息與序列號為Q17060 的意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）源MRJP3同源性最高，匹配率達(dá)到100%（附圖1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.272）。通過UPLC-Q-TOF/MS檢測出的108 條酶解多肽分別屬于MRJP1～7 和MRJP9（表1），未得到MRJP8 的酶解多肽。在檢測出的MRJPs多肽中，肽段覆蓋率最低的是MRJP9（1.7%），最高的是MRJP1（76.6%），其中MRJP1～3的肽段覆蓋率顯著高于其余王漿主蛋白，即它們在蜂王漿MRJPs 中含量最高，可作為高含量、高穩(wěn)定MRJPs標(biāo)志肽的潛在選擇。

鑒于三重四極桿質(zhì)譜對痕量樣品的定量分析具有高靈敏度和良好的定量重現(xiàn)性特點(diǎn)，將經(jīng)UPLC-Q-TOF/MS 分析得到的多肽參數(shù)（包括電荷、分子量和保留時(shí)間等）導(dǎo)入U(xiǎn)PLC-TQMS儀器，對候選多肽進(jìn)行定量質(zhì)譜MRM分析。利用該方法得到的蜂王漿中MRJPs 多肽的檢測結(jié)果如表1 所示，在108 條候選多肽中只有69 條能在UPLCTQMS中被檢測出，其余39條未能被檢測出。究其原因，除了儀器誤差外，還可能與蜂王漿中某些MRJPs 成員含量較低、酶解多肽響應(yīng)值不足有關(guān)。根據(jù)上述結(jié)果，剔除不符合標(biāo)志多肽含量穩(wěn)定性要求的這39條多肽。

2.2 候選多肽篩選

為了對69 條候選多肽進(jìn)行初步篩選，通過UPLC-TQMS對它們進(jìn)行10次連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣分析。從整體結(jié)果（圖1）看，每條多肽的峰面積與10次重復(fù)檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation,RSD）間有緊密關(guān)聯(lián)。其中，峰面積小于2 000的35條多肽的重復(fù)檢測結(jié)果的RSD 較高（＞15%）。這些多肽峰面積較小的原因主要是：1）多肽的電離效率較低，不能被充分離子化，導(dǎo)致被UPLC-TQMS系統(tǒng)檢測出的響應(yīng)值較低；2）多肽難以被酶解或者酶解后容易降解，導(dǎo)致其在待測溶液中的濃度較低。這些多肽的峰面積檢測結(jié)果的RSD 較高，反映出它們在質(zhì)譜定量分析中的高不穩(wěn)定性，無法滿足準(zhǔn)確定量的要求。因此，剔除35 條峰面積小于2 000 的多肽，選擇剩下的34 條多肽作為候選標(biāo)志多肽進(jìn)一步予以篩選。在34 條多肽中，有10 條屬于MRJP1，8條屬于MRJP2，7條屬于MRJP3，2條屬于MRJP4，4條屬于MRJP5，1條屬于MRJP6，2條屬于MRJP7（表1）。這34 條候選多肽的總離子流見附圖2（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.272）。

表1 MRJPs及其酶解多肽鑒定分析結(jié)果Table 1 Identification and analysis results of MRJPs and their enzymolytic polypeptides

圖1 基于UPLC-TQMS的MRJPs候選多肽的穩(wěn)定性分析Fig.1 Stability analysis of candidate polypeptides of MRJPs by UPLC-TQMS

由圖2 可見，不同候選多肽的酶解效率差異很大。有些多肽能在2～3 h內(nèi)完全酶解，而有些多肽如EALPHVPIFDR、IAIDK 和GVPSSLNVISEK 在24 h內(nèi)仍未完全酶解。經(jīng)過24 h酶解后，各肽段的相對峰面積比值為16%～100%，表明不同候選多肽酶解后的穩(wěn)定性存在很大差異。因此，可以根據(jù)候選多肽的易酶解性與酶解后穩(wěn)定性的差異進(jìn)行篩選。

2.3 候選多肽分類

基于候選多肽的易酶解性與酶解后穩(wěn)定性的差異，將34 條候選多肽分為5 類（表2）。根據(jù)高易酶解性和酶解后高穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)，A 類中的5 條候選多肽同時(shí)具備高易酶解性與酶解后高穩(wěn)定性的特征，是標(biāo)志多肽的最佳選擇。B 類中的5 條候選多肽是次優(yōu)選擇，雖然它們具有較高的易酶解性，但酶解后穩(wěn)定性較差，因而在較短的酶解時(shí)間內(nèi)可用作標(biāo)志多肽。C類中的8條候選多肽雖然酶解后穩(wěn)定性高，但易酶解性差，因此也不屬于最佳選擇，需要在較長的酶解時(shí)間下才可用作標(biāo)志多肽。D、E類中的候選多肽的易酶解性低，且酶解后穩(wěn)定性差或未知，因此不適合選作標(biāo)志多肽。候選多肽的易酶解性理論示意圖見附圖3（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.272）。

結(jié)合圖2和表2可知：候選多肽EALPHVPIFDR、IAIDK和GVPSSLNVISEK無法被選作標(biāo)志多肽，因?yàn)榧词乖诿附?4 h后它們?nèi)晕催_(dá)到最大酶解程度；由于MRJP4和MRJP6的酶解多肽均不屬于A、B或C類，因而缺乏用于定量分析的標(biāo)志多肽，不考慮用作內(nèi)源性標(biāo)志蛋白；LTSNTFDYDPR、LTSNTFDYDPK和NYPFDVDQWR均同時(shí)存在于2個(gè)以上的MRJPs蛋白中，為非特異性多肽，因而不能選作特異性標(biāo)志多肽；MRJP5 和MRJP7 也缺乏用于定量分析的標(biāo)志多肽，不考慮用作內(nèi)源性標(biāo)志蛋白。因此，僅從A～C類的MRJP1～3中選擇出15條候選多肽。

表2 MRJPs候選多肽分類Table 2 Classifications of candidate polypeptides of MRJPs

圖2 候選多肽的酶解性與酶解后穩(wěn)定性熱圖Fig.2 Heatmap for enzymolysis and stability of candidate polypeptides

2.4 特異性標(biāo)志多肽的確定

在候選多肽中，所需酶解時(shí)間較短的A 類和B類中的多肽組合屬于首選（表3）。由于B 類中的YNGVPSSLNVISK 和A 類 中 的LTVAGESFTVK 的質(zhì)譜檢測響應(yīng)值較高，因此更適合被分別選作MRJP1 和MRJP3 的特異性標(biāo)志多肽。唯一屬于A類的MRJP2多肽TLQMIAGMK被選為其特異性標(biāo)志多肽，其最佳酶解時(shí)間為2 h。為了減少UPLCTQMS定量分析中的基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測的準(zhǔn)確度，將上述3 條特異性標(biāo)志多肽分別合成同位素標(biāo)志肽，即YNGVPSSL*NVISK（MRJP1）、TL*QMIAGMK（MRJP2）和L*TVAGESFTVK（MRJP3），建立了可對MRJP1～3進(jìn)行定量分析的UPLC-TQMS法，這3條合成的特異性標(biāo)志多肽的二級質(zhì)譜如圖3所示。

圖3 MRJP1～3同位素標(biāo)志肽的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectrograms of MRJP1-3 isotopic marker peptides

表3 MRJP1～3的候選標(biāo)志多肽Table 3 Candidate marker polypeptides of MRJP1-3

2.5 蜂王漿中MRJP1～3 含量檢測方法的建立

按1.3.5 節(jié)的條件進(jìn)樣，在蜂王漿中能檢測出3條完好且能夠被區(qū)分的MRJP1～3 特征峰（附圖4，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.272），說明該檢測條件可行。

對標(biāo)志多肽標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的結(jié)果（圖4）表明，YNGVPSSLNVISK在10～1 600 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，TLQMIAGMK和LTVAGESFTVK在10～600 ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)（R2）均大于0.99，滿足定量檢測要求。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的方法能準(zhǔn)確地定量檢測出蜂王漿樣品中MRJP1～3的含量。

圖4 3條標(biāo)志多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of three marker polypeptides

2.6 以MRJP1～3 為檢測目標(biāo)的蜂王漿新鮮度檢測結(jié)果

對蜂王漿樣品進(jìn)行模擬加溫老化處理，結(jié)果（表4）顯示：0 d時(shí)，冷凍保存的鮮蜂王漿中MRJP1、MRJP2、MRJP3 的 質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為（56.9±6.1）、（16.0±0.6）、（26.8±0.5）mg/g，按含量排序?yàn)镸RJP1＞MRJP3＞MRJP2；在40 ℃條件下貯存35 d后，MRJP1、MRJP2、MRJP3 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（27.1±0.7）、（2.0±0.1）、（5.1±0.1）mg/g，三者的降解率分別為52.4%、87.8%、81.1%，按降解率排序?yàn)镸RJP2＞MRJP3＞MRJP1。

表4 鮮蜂王漿在40 ℃貯存過程中MRJP1～3含量變化Table 4 Changes of MRJP1-3 contents in fresh royal jelly during storage at 40 ℃ mg/g

模擬加溫老化實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性分析結(jié)果（圖5）顯示，MRJP1～3 的降解率均與老化時(shí)間（40 ℃）呈正相關(guān)（R2＞0.9），即MRJP1～3 的含量均隨著老化時(shí)間的延長呈下降趨勢。上述結(jié)果顯示，本研究建立的檢測方法對MRJP1～3 具有很高的靈敏度，是一種精準(zhǔn)檢測蜂王漿新鮮度的新技術(shù)。

圖5 MRJP1、MRJP2和MRJP3降解率與老化時(shí)間（40 ℃）的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationships between degradation rates of MRJP1,MRJP2 and MRJP3 and aging time at 40 ℃

3 討論

蜂王漿具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、抗衰老等多種功能，對糖尿病、心血管病、失眠都有很好的保健作用。但是，鮮蜂王漿不穩(wěn)定，怕熱、怕光、怕酸堿、怕污染，需要保存在－18 ℃的冷凍環(huán)境中。新鮮蜂王漿中能夠促使雌性蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王的某種關(guān)鍵活性成分對溫度非常敏感，受溫度影響很大，并且在常溫條件下保存時(shí)會損失或失去活性[13]。

近20年來，采用MRJP1含量作為蜂王漿新鮮度檢測指標(biāo)的觀點(diǎn)得到廣泛認(rèn)可。如KAMAKURA等[14-15]發(fā)現(xiàn)鮮蜂王漿對運(yùn)動后小鼠具有改善生理疲勞的功能，進(jìn)一步通過功能組分分析發(fā)現(xiàn)，在40 ℃條件下貯存7 d 的蜂王漿已失去抗疲勞功能，原因是MRJP1已被降解。他們還發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中補(bǔ)充MRJP1能刺激大鼠肝細(xì)胞的DNA合成和白蛋白產(chǎn)生[16-17]。MAJTáN 等[18]發(fā)現(xiàn)，MRJPl 可促進(jìn)大鼠吞噬細(xì)胞釋放腫瘤細(xì)胞壞死因子TNFα，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，且其在有充足血清的媒介中能刺激人淋巴細(xì)胞的生長。日本學(xué)者YAMAGUCHI 等[19]通過觀察喂食王漿酸、粗蛋白、MRJP1 與蜜蜂幼蟲生長的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，MRJP1 是促進(jìn)幼蟲生長的關(guān)鍵蛋白，且兩者呈劑量依賴關(guān)系，因此，他們在2008年第九屆亞洲養(yǎng)蜂大會上建議將MRJP1 含量作為蜂王漿質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。

2011 年，KAMAKURA[20]分別以鮮蜂王漿和在40 ℃條件下貯存7、14、21、30 d 的老化蜂王漿喂養(yǎng)蜜蜂雌性幼蟲，結(jié)果只有喂養(yǎng)鮮蜂王漿的幼蟲能夠發(fā)育成為蜂王，而用40 ℃條件下貯存30 d的蜂王漿飼養(yǎng)的幼蟲都發(fā)育成了工蜂；通過高效液相色譜和非變性丙烯酰胺凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，MRJP1在40 ℃貯存過程中逐步被降解，且在貯存30 d時(shí)全部被降解，因此認(rèn)為MRJP1是蜂王漿中誘導(dǎo)蜜蜂發(fā)生級型分化的主要功能因子。但德國學(xué)者BUTTSTEDT等[21]對單一MRJP成員如MRJP1是蜂王漿中促使蜜蜂級型分化的關(guān)鍵因子及其含量可代表蜂王漿新鮮度的觀點(diǎn)提出了質(zhì)疑，他們通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不能得到相同結(jié)果。

事實(shí)上，MRJPs 是由不同蛋白組成的家族，各蛋白成員具有不同的功能，例如MRJP1 具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)功能，MRJP2 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗腫瘤功能，MRJP3 具有抗過敏、加速免疫反應(yīng)、抗炎功能，發(fā)揮主蛋白的營養(yǎng)健康功能需要各蛋白成員的協(xié)同作用[12]。近10 年來，本團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)了超濾分離高純度MRJPs 凍干粉的技術(shù)[22]，以果蠅、小鼠為模式生物進(jìn)行MRJPs 喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示MRJPs 能夠促進(jìn)卵巢發(fā)育和排卵，提高雌激素水平[23-25]；通過果蠅和人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，MRJPs 具有抗衰老功能[23,26]。這一系列研究結(jié)果證明，MRJPs是蜂王漿中促進(jìn)機(jī)體生殖和發(fā)育的關(guān)鍵活性成分。而MRJP1～3 是MRJPs 家族中含量較高、營養(yǎng)功能最有代表性的3個(gè)成員。因此，本研究基于UPLC-TQMS 方法篩選出3 個(gè)MRJP1～3 特異性標(biāo)志多肽，建立了蜂王漿中MRJP1～3 組合的UPLC-TQMS 定量檢測方法，這是一種比檢測單一蛋白更為全面且能夠反映蜂王漿新鮮度的鑒定方法，可為今后蜂王漿質(zhì)量評價(jià)、新標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究篩選出3個(gè)特異性標(biāo)志多肽YNGVPSS LNVISK（MRJP1）、TLQMIAGMK（MRJP2）、LTVAG ESFTVK（MRJP3），并合成了MRJP1～3的3條特異性標(biāo)志多肽標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素標(biāo)志肽，建立了蜂王漿中MRJP1～3的UPLC-TQMS定量檢測方法。通過對加溫老化處理的蜂王漿進(jìn)行檢測，證實(shí)了MRJP1～3的降解率均與老化時(shí)間（40 ℃）呈正相關(guān)（R2＞0.9）。本研究所建立的方法是一種精確檢測蜂王漿新鮮度的新技術(shù)。

致敬謹(jǐn)以此文緬懷我的導(dǎo)師——大先生程家安教授，感謝他對教育事業(yè)的無私奉獻(xiàn)。他將永遠(yuǎn)活在學(xué)生的心中！

——沈立榮