都慧，王曉偉，劉樹生

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院昆蟲科學(xué)研究所，杭州310058）

煙粉虱（Bemisia tabaci）屬半翅目（Hemiptera）粉虱科（Aleyrodidae），是一類全球廣泛分布、體型微小的刺吸式口器昆蟲。煙粉虱通過直接取食和傳播植物病毒危害寄主植物，是棉花、番茄、煙草等多種經(jīng)濟(jì)作物的重要害蟲[1]。煙粉虱是一個(gè)含有數(shù)十個(gè)隱存種的物種復(fù)合群[2-5]，其中有2個(gè)入侵我國，分別為中東-小亞細(xì)亞1 種（Middle East-Asia Minor 1,MEAM1）和地中海種（Mediterranean, MED），由于煙粉虱具有極強(qiáng)的抗藥性、適應(yīng)寄主能力和繁殖能力，得以在我國迅速擴(kuò)散定殖[6-8]。

作為刺吸式口器昆蟲，煙粉虱在取食植物時(shí)用口針刺穿植物組織以到達(dá)韌皮部，通過吸取韌皮部汁液獲取營養(yǎng)，且在取食時(shí)分泌大量唾液到植物中，這種取食方式使得唾液成為煙粉虱與植物相互作用的紐帶。煙粉虱唾液的功能很多，其中最重要的是幫助煙粉虱調(diào)控植物的防御反應(yīng)，其唾液中可以抑制植物防御反應(yīng)的成分被稱為效應(yīng)因子（effector）[9]。

WRKY是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，至少包含一個(gè)由大約60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域。WRKY主要存在于高等植物中，通過與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）等蛋白互作來調(diào)控植物的生長發(fā)育，參與植物抗脅迫和抗病蟲害等過程[10-13]。

前期我們鑒定到1 個(gè)煙粉虱的唾液效應(yīng)因子BtArmet（Bemisia tabaciarginine rich, mutated in early stage of tumors），它可以隨著煙粉虱的唾液被分泌到植物中，并促進(jìn)煙粉虱在植物上的取食和繁殖；蛋白互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，BtArmet通過靶向植物體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶抑制素蛋白來抑制植物的抗蟲性[14]。但由于昆蟲與植物互作的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，昆蟲的唾液效應(yīng)蛋白不可能僅與1個(gè)植物蛋白互作而發(fā)揮功能，因此本研究對前期篩選到的另一個(gè)可以與BtArmet 蛋白互作的普通煙（Nicotiana tabacum）的轉(zhuǎn)錄因子WRKY51 進(jìn)行了功能驗(yàn)證和互作機(jī)制探究，旨在進(jìn)一步明確BtArmet 蛋白在調(diào)控植物防御反應(yīng)中的作用，為深入解析唾液效應(yīng)因子在調(diào)控?zé)煼凼c寄主植物互作中的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為MEAM1 煙粉虱（mtCOI，GenBank登錄號：GQ332577），于2010年8月采集于溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所，飼養(yǎng)在人工氣候室中特制的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，使用7—8葉無蟲源污染的棉花植株進(jìn)行種群的維持。人工氣候室的溫度控制在（26±1）℃，相對濕度控制在（70±10）%，光照周期為14 h光照∶10 h黑暗。每隔2～3月對煙粉虱的隱存種進(jìn)行一次分子鑒定，以監(jiān)測種群的純度。

1.1.2 供試植物

供試植物包括棉花（Gossypium hirsutum），品種為浙棉1793；普通煙（N.tabacum），品種為NC89；本氏煙（Nicotiana benthamiana），為轉(zhuǎn)基因H2B-RFP（紅色熒光蛋白細(xì)胞核定位）株系。種子均由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。所有植物均使用塑料花盆單獨(dú)栽培，置于無蟲源、無病菌污染的人工玻璃溫室內(nèi)培養(yǎng)。溫室內(nèi)溫度、相對濕度、光照周期的控制同人工氣候室，采用自然光照并輔以人工光照鈉燈補(bǔ)光。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母雙雜交（yeast two-hybrid,Y2H）系統(tǒng)互作驗(yàn)證

收集煙粉虱取食過的普通煙葉提取總RNA，送至寶生物工程（大連）有限公司構(gòu)建煙草cDNA 文庫，同時(shí)構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-BtArmet（引物序列見表1）。按照酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（YeastmakerTMYeast Transformation System 2）試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］說明書進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。使用酵母質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Yeast Plasmid DNA Kit）［天根生化科技（北京）有限公司］提取互作的酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌后送至公司測序。

1.2.2 雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）互作驗(yàn)證

分別將BtArmet和NtWRKY51基因的全長克隆至p2YC 和p2YN 載體中（引物序列見表1），將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至EHA105 根癌農(nóng)桿菌中。將表達(dá)p2YC-BtArmet和p2YN-NtWRKY51的根癌農(nóng)桿菌制備成懸浮液，等體積混勻后共同浸潤轉(zhuǎn)H2B-RFP的本氏煙葉，48 h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色情況。

1.2.3 應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）方法沉默煙草NtWRKY51基因

通過SGN VIGS Tool網(wǎng)站（https://vigs.solgenomics.net/）分析NtWRKY51基因序列，選取約300 bp 的最佳沉默片段克隆至pBIN2mDNA1載體中（引物序列見表1），并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至EHA105 根癌農(nóng)桿菌中。用煙草曲莖病毒（tobacco curly shoot virus,TbCSV）Y35 輔助侵染煙草，將重組質(zhì)粒2mDNA1-Su（可以抑制煙草內(nèi)源基因Su的表達(dá)以產(chǎn)生葉脈褪綠的表型突變）作為陽性對照，空載體2mDNA1 作為陰性對照[15]。將表達(dá)2mDNA1、2mDNA1-Su、2mDNA1-NtWRKY51 與TbCSV Y35 的根癌農(nóng)桿菌分別制備成懸浮液，按照2mDNA1＋Y35、2mDNA1-Su＋Y35、2mDNA1-NtWRKY51＋Y35 的組合等體積混勻懸浮液，共同浸潤2 片真葉期的普通煙葉。將接種過的普通煙放在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，待生長到5—6 片真葉期時(shí)，取樣提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）技術(shù)檢測NtWRKY51基因的表達(dá)量，隨后用于生物學(xué)測定實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 沉默NtWRKY51基因煙草上煙粉虱的生物學(xué)測定

準(zhǔn)備初羽化3 d 的煙粉虱成蟲，使用1.2.3 節(jié)中獲得的沉默NtWRKY51基因的普通煙進(jìn)行生物學(xué)測定實(shí)驗(yàn)，將夾葉籠夾在葉片背面，每個(gè)夾葉籠內(nèi)放入10頭（5雌5雄）煙粉虱成蟲。將接種煙粉虱的普通煙置于人工氣候室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)夾葉籠中煙粉虱的存活數(shù)和每片煙葉上夾葉籠范圍內(nèi)的產(chǎn)卵數(shù)。

1.2.5 qRT-PCR 檢測相關(guān)基因的表達(dá)

將煙粉虱置于普通煙葉上取食3 d 后，收集葉片提取總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過qRT-PCR 技術(shù)檢測煙草中NtWRKY51基因的表達(dá)量。收集1.2.3節(jié)中沉默NtWRKY51基因的普通煙葉，提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過qRT-PCR技術(shù)檢測植物激素信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況（引物序列見表1）。

表1 用于基因克隆、載體構(gòu)建和定量檢測的引物Table 1 Primers used for gene cloning,vector construction and quantitative detection

表1（續(xù)） Continuation of Table 1

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)處理的生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示。2個(gè)處理間的比較采用獨(dú)立樣本學(xué)生t檢驗(yàn)（student’st-test）法進(jìn)行分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtWRKY51 基因的克隆及序列分析

NtWRKY51（GenBank登錄號：XM_016626866）是普通煙（N.tabacum）中的一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子51（WRKY51）蛋白，是植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。NtWRKY51基因的開放閱讀框（open reading frame,ORF）序列全長為612 bp，編碼一個(gè)含有203個(gè)氨基酸的蛋白（圖1），預(yù)測該成熟蛋白質(zhì)的分子量為23.4 kDa，沒有預(yù)測到信號肽。根據(jù)NtWRKY51基因ORF 的全長序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以煙粉虱的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到NtWRKY51片段，將其連接到不同載體上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 NtWRKY51的序列分析Fig.1 Sequence analysis of NtWRKY51

2.2 酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證BtArmet與NtWRKY51的互作

將pGBKT7-BtArmet質(zhì)粒和pGADT7-NtWRKY51質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入Y2H Gold 酵母菌株，并分別在亮氨酸/色氨酸缺陷型（SD-Leu/-Trp）固體選擇性培養(yǎng)基（二缺培養(yǎng)基）和含有X-α-gal（顯色底物）和金擔(dān)子素A（aureobasidin A,AbA）的腺嘌呤/組氨酸/亮氨酸/色氨酸缺陷型（SD-Ade/-His/-Leu/-Trp）固體選擇性培養(yǎng)基（四缺培養(yǎng)基）上點(diǎn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些菌株可以在含有X-α-gal 和AbA 的四缺培養(yǎng)基上生長并且變藍(lán)；而將這些質(zhì)粒分別與對應(yīng)的空載質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的酵母菌株，均不能在含有X-α-gal 和AbA的四缺培養(yǎng)基上生長（圖2）。

圖2 BtArmet與NtWRKY51在酵母雙雜交系統(tǒng)中的互作Fig.2 Interactions of BtArmet and NtWRKY51 in the yeast two-hybrid system

2.3 BiFC 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BtArmet 與NtWRKY51 在植物體內(nèi)的互作

在共同表達(dá)p2YC-BtArmet和p2YN-NtWRKY51的本氏煙葉的細(xì)胞質(zhì)中可以觀察到明顯的斑點(diǎn)狀熒光信號，同時(shí)在細(xì)胞核中也可以觀察到少量熒光信號，而在陰性對照中則未觀察到熒光信號（圖3）。因此我們推測BtArmet 與NtWRKY51 可以在植物體內(nèi)發(fā)生互作，并且這種互作可能抑制了轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY51在細(xì)胞核內(nèi)的定位。

圖3 BtArmet與NtWRKY51在植物體內(nèi)的互作Fig.3 Interactions of BtArmet and NtWRKY51 in vivo

2.4 煙粉虱取食對煙草NtWRKY51 基因表達(dá)的影響

為了明確煙粉虱的侵染是否會(huì)誘導(dǎo)煙草中NtWRKY51基因的表達(dá)，我們將煙粉虱置于4—5 片真葉期的普通煙植株上取食3 d 后檢測煙草中NtWRKY51基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，被煙粉虱取食過的煙草中，NtWRKY51基因的表達(dá)量大約是未被煙粉虱取食過煙草的1.9倍（圖4）。

圖4 被煙粉虱取食過的普通煙中NtWRKY51 的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression level of NtWRKY51 in N. tabacum fed by whiteflies

2.5 VIGS 方法沉默NtWRKY51 基因的效率

為探究NtWRKY51 在調(diào)控?zé)煵莘烙鶡煼凼械淖饔?，通過VIGS方法沉默煙草中的NtWRKY51基因。用根瘤農(nóng)桿菌接種普通煙25 d 后觀察葉片的表型發(fā)現(xiàn)，與陰性對照（沉默空載的煙草）葉片相比，沉默NtWRKY51基因的煙草并沒有出現(xiàn)葉片褪綠或細(xì)胞死亡的現(xiàn)象（圖5）。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，沉默NtWRKY51基因的普通煙中NtWRKY51基因的表達(dá)量顯著低于陰性對照（圖6）。

圖5 沉默NtWRKY51基因的普通煙表型Fig.5 Phenotype of NtWRKY51-silenced N.tabacum

圖6 NtWRKY51基因在普通煙中的相對表達(dá)水平Fig.6 Relative expression level of NtWRKY51 in N.tabacum

2.6 沉默煙草NtWRKY51 基因?qū)煼凼m合度的影響

將初羽化3 d 的煙粉虱成蟲轉(zhuǎn)移到2.5 節(jié)中沉默NtWRKY51基因的普通煙上進(jìn)行生物學(xué)測定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，連續(xù)取食7 dNtWRKY51基因沉默煙草的煙粉虱的單雌產(chǎn)卵量極顯著低于取食陰性對照煙草的煙粉虱，但兩者在存活率上沒有顯著性差異（圖7）。

圖7 煙粉虱在沉默NtWRKY51 基因普通煙上的產(chǎn)卵量和存活率Fig.7 Fecundity and survival rate of whiteflies on NtWRKY51-silenced N.tabacum

2.7 沉默煙草NtWRKY51 基因?qū)χ参锛に匦盘柾返挠绊?/h3>

為研究NtWRKY51對煙草防御途徑的影響，我們測定了沉默NtWRKY51基因的普通煙中水楊酸（salicylic acid, SA）和茉莉酸（jasmonic acid, JA）信號通路相關(guān)基因的表達(dá)量。如圖8 所示，在沉默NtWRKY51基因的煙草中，水楊酸和茉莉酸信號通路相關(guān)基因的表達(dá)量與陰性對照煙草相比均無顯著性差異。

圖8 沉默NtWRKY51 基因普通煙體內(nèi)水楊酸和茉莉酸信號通路標(biāo)記基因的相對表達(dá)水平Fig.8 Relative expression levels of marker genes in SAsignaling pathways and JA-signaling pathways in NtWRKY51-silenced N.tabacum

3 討論與結(jié)論

煙草WRKY51 蛋白是植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。本研究將煙粉虱的唾液效應(yīng)因子BtArmet 作為誘餌在煙草的cDNA 文庫中篩選到了NtWRKY51 蛋白，并對NtWRKY51 蛋白與BtArmet蛋白互作調(diào)控?zé)煵莘烙鶡煼凼臋C(jī)制進(jìn)行了初步探究。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物遭受病原菌、昆蟲攻擊等生物脅迫和高溫、干旱等逆境引發(fā)的非生物脅迫時(shí)，起到重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的防御功能[16-17]，WRKY主要通過參與SA和JA這2大植物激素的信號途徑來影響植物的防御體系[18-19]。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子為SA和細(xì)菌激發(fā)子誘導(dǎo)PR-1a基因的表達(dá)所必需，說明WRKY 可能是SA 信號通路的正調(diào)控因子[20]。因此，我們推測煙粉虱的BtArmet 蛋白還可能通過與NtWRKY51蛋白互作來調(diào)節(jié)煙草中SA信號通路。

首先，通過酵母雙雜交和BiFC 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BtArmet 與NtWRKY51 在植物體外和體內(nèi)的互作。其次，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，煙粉虱取食煙草會(huì)誘導(dǎo)NtWRKY51基因表達(dá)上調(diào)。為探究NtWRKY51在煙草抗煙粉虱中的作用，本研究通過VIGS 實(shí)驗(yàn)在煙草中沉默了NtWRKY51基因，生物學(xué)測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示煙粉虱在沉默NtWRKY51基因的煙草上產(chǎn)卵量顯著降低，表明NtWRKY51是一種對煙粉虱有利的煙草蛋白，負(fù)調(diào)控?zé)煵輰煼凼目剐?。而煙草中NtWRKY51基因的沉默對SA和JA信號通路相關(guān)基因表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子一般在植物防御中起到正調(diào)控的作用，前人研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱取食誘導(dǎo)的3個(gè)煙草WRKY家族基因均正調(diào)控?zé)煵輰煼凼目剐訹21]，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看似與預(yù)期結(jié)果相悖，即煙粉虱分泌唾液效應(yīng)因子BtArmet進(jìn)入煙草與NtWRKY51互作，但NtWRKY51蛋白本身對煙粉虱取食有利，并且受到煙粉虱取食的大量誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)植物進(jìn)化出了有利于昆蟲取食的基因，為今后研究NtWRKY51 在昆蟲-植物互作中的作用打下了基礎(chǔ)。