趙芮， 黃瑾， 方明， 田敏

軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心 陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安（710032）

牙周炎是一種慢性免疫炎癥性疾病。臨床表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周結(jié)締組織破壞、牙周袋形成、牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落，會(huì)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，但通常在出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)和牙槽骨破壞時(shí)才被診斷出來［1-2］。因此，迫切需要一種方法在早期階段檢測疾病活動(dòng)，以便在疾病進(jìn)展之前進(jìn)行干預(yù)。代謝組學(xué)技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨的代謝標(biāo)志物變化，對疾病的致病機(jī)理研究和早期診斷具有獨(dú)特的優(yōu)勢，利用代謝組學(xué)技術(shù)可將差異代謝物作為臨床診斷和預(yù)測指標(biāo)對高危人群進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，從而針對性設(shè)計(jì)預(yù)防及干預(yù)措施，降低牙周炎發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。目前，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在牙周炎的病因、診斷和預(yù)測研究中取得了一定成果［3］，有望成為基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化間的重要橋梁。

1 代謝組學(xué)的概述、研究方法及步驟

英國倫敦大學(xué)Nicholson 課題組［4］在1999 年首次提出了代謝組學(xué)的概念，認(rèn)為代謝組學(xué)是定量測量生物體系對病理生理刺激或遺傳因素改變所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的一種技術(shù)。代謝組學(xué)技術(shù)通過高通量的色譜、質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)對生物樣本進(jìn)行處理，描述代謝過程中各種小分子代謝物的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，識別并定量生物體體液、動(dòng)物或人體生物樣本中的數(shù)千個(gè)靶標(biāo)代謝物，最終反映復(fù)雜生命體的整體功能狀態(tài)［5］。代謝組學(xué)的研究步驟主要包括樣本的采集和前處理、代謝組學(xué)樣本檢測、數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)庫生物學(xué)闡釋等［6］。

1.1 樣本的采集和前處理

樣本的采集和前處理是代謝組學(xué)研究的初始步驟，可用于代謝組學(xué)分析的樣本有血液、尿液、腦脊液、唾液、活檢組織提取物或細(xì)胞提取物（原代培養(yǎng)物）等。對于牙周炎的代謝組學(xué)研究，常用的樣本有唾液、齦溝液、血清等，由于牙周炎與糖尿病、心血管疾病等系統(tǒng)性疾病密切關(guān)聯(lián)［7-8］，因此要注意納入排除標(biāo)準(zhǔn)的制定及試驗(yàn)組與對照組的因素匹配。

1.2 代謝組學(xué)樣本檢測

為了獲得可靠和有效的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，重要的是使用高靈敏度和高選擇性的數(shù)據(jù)采集技術(shù)，既能夠檢測給定生物樣本中的大多數(shù)代謝物，又可以低成本提供高度可重復(fù)性數(shù)據(jù)［9］。研究者嘗試采用多種分析技術(shù)來進(jìn)行代謝物的互補(bǔ)覆蓋分析，其中核磁共振技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）是應(yīng)用最廣泛的方法，目前常用的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-MS，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-MS，GC-MS）、以及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（capillary electrophoresis-MS，CE-MS）三類［10］。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)分析

在對樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測后會(huì)產(chǎn)生大量的復(fù)雜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)預(yù)處理可以減少與研究目的無關(guān)的變異對數(shù)據(jù)分析的影響，利于目標(biāo)差異代謝物的篩選和分析。將代謝組學(xué)檢測后產(chǎn)生的圖譜導(dǎo)入相應(yīng)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，隨后進(jìn)行缺失值過濾、峰值對齊、數(shù)據(jù)歸一化等預(yù)處理，最終得到可用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。

代謝組學(xué)檢測后產(chǎn)生的是高維的數(shù)據(jù)，僅采用單變量分析不能揭示變量間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，多變量統(tǒng)計(jì)分析在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中具有重要作用。常采用主成分分析、層次聚類分析等識別代謝物整體趨勢、評價(jià)組內(nèi)樣本的相似性和組間樣本的差異性；使用偏最小二乘法判別分析、偏最小二乘法回歸、正交偏最小二乘判別分析等判斷組間差異的大小以及差異產(chǎn)生的來源，尋找差異代謝物。其中牙周炎代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法以主成分分析、偏最小二乘法判別分析及正交偏最小二乘判別分析使用最為廣泛［11］。

1.4 數(shù)據(jù)庫生物學(xué)闡釋

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫可以對數(shù)據(jù)進(jìn)行深層次的交叉分析，揭示隱藏在大數(shù)據(jù)背后的代謝物生物學(xué)原理，常用的數(shù)據(jù)庫有京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG）和人類代謝組數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）等。

2 唾液代謝組學(xué)在牙周炎中的應(yīng)用

人類口腔是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，數(shù)百種細(xì)菌和其他微生物在宿主的口腔環(huán)境中相互作用，唾液是防御微生物攻擊的關(guān)鍵成分，可以反映整個(gè)口腔炎癥狀態(tài)和病原體微生物的各種生物信息［12］。此外，唾液樣本具有采樣方便、無創(chuàng)的優(yōu)勢，且便于重復(fù)采樣。因此，唾液分析在大型臨床試驗(yàn)、流行病學(xué)研究和疾病的診斷及預(yù)防等領(lǐng)域得以廣泛運(yùn)用［13-14］。

2.1 與牙周炎發(fā)生、發(fā)展、診斷相關(guān)的代謝物

Romano 等［15］運(yùn)用核磁共振技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者和侵襲性牙周炎患者唾液代謝組譜之間沒有顯著差別，與牙周健康者相比，慢性牙周炎患者和侵襲性牙周炎患者唾液中丙酮酸、n-乙酰和乳酸水平顯著降低，脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸水平顯著升高，其中，乳酸水平的降低可能是牙周常見細(xì)菌將其分解的結(jié)果，多種氨基酸水平的升高為細(xì)菌的增殖提供了理想環(huán)境。García-Villaescusa 等［16］對130 名受試者的唾液樣本進(jìn)行核磁共振技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)牙周炎患者己酸、異己酸、丁酸、異戊酸、乳酸、脯氨酸水平顯著升高，是診斷牙周炎的潛在生物標(biāo)志物，己酸、異己酸、丁酸等短鏈脂肪酸刺激炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的釋放，抑制牙齦上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的白細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞修復(fù)［17］。Gawron 等［18］采用核磁共振技術(shù)對唾液樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)牙周炎組的丙酮、甲醇水平低于健康組，而乳酸水平高于健康組。丙酮參與脂肪酸降解、糖酵解和丙酮酸代謝，牙周炎組丙酮表達(dá)的下調(diào)可能與細(xì)菌能量代謝有關(guān)；慢性牙周炎患者的甲醇水平較低，研究者認(rèn)為這可能與甲醇被用作相關(guān)細(xì)菌的碳源或能量源有關(guān)。

2.2 與牙周炎發(fā)生、發(fā)展、診斷相關(guān)的代謝途徑

Baima 等［19］對牙周炎相關(guān)的差異代謝物進(jìn)行代謝途徑富集分析，發(fā)現(xiàn)與健康狀態(tài)相比，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸途徑對牙周炎患者的唾液代謝譜的影響最大，氨基酸作為蛋白分解產(chǎn)物，其濃度的升高可能與炎癥對牙周組織的破壞有關(guān)，氨基酸代謝途徑在免疫激活的條件下高度表達(dá)，并且在細(xì)菌合成代謝中起關(guān)鍵作用。Singh 等［20］對176 份唾液樣本進(jìn)行核磁共振技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與慢性牙周炎患者相比，接受牙周炎手術(shù)治療的患者谷氨酸、乙烷磺酸、巖藻糖、乳酸等表達(dá)下調(diào)，代謝通路分析顯示牙周炎手術(shù)治療對丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的影響最大，其中谷氨酸在轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)將上調(diào)蛋白分解導(dǎo)致膠原破壞，加速慢性牙周炎發(fā)展，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑的下調(diào)體現(xiàn)了與炎癥狀態(tài)相比，手術(shù)治療后唾液中細(xì)菌合成代謝變緩，牙周組織破壞減輕。

2.3 基于多元模型診斷和預(yù)測牙周炎

Rzeznik 等［21］研究認(rèn)為牙周炎的主要差異代謝物為丁酸、乳酸、γ-氨基丁酸、甲醇和蘇氨酸，研究者通過Logistic 回歸分析得出乳酸、γ-氨基丁酸和丁酸是診斷牙周炎的獨(dú)立生物標(biāo)志物，三者聯(lián)合生成一個(gè)聚合變量，診斷牙周炎的陽性預(yù)測值達(dá)0.77。研究者將臨床附著水平、牙齦退縮和探診出血3 個(gè)指標(biāo)結(jié)合，通過計(jì)算得出牙周炎癥表面積（periodontal inflamed surface area，PISA）［22］，用于量化表達(dá)感染的牙周組織面積，Sakanaka 等［23］使用GC-MS 法對50 名受試者菌斑去除前后的100 份唾液樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PISA 與唾液代謝譜有較強(qiáng)的相關(guān)性，尸胺（AUC = 0.875）和氫肉桂酸（AUC= 0.842）是牙周炎癥嚴(yán)重程度的高度特異性標(biāo)志物，構(gòu)建了菌斑去除前唾液代謝物和PISA之間的預(yù)測模型。然而這一預(yù)測模型是基于橫斷面研究構(gòu)建的，未在前瞻性研究中對模型的預(yù)測能力進(jìn)行驗(yàn)證，模型存在一定的局限性。And?rfer等［24］使用LC-MS 技術(shù)分析唾液代謝物與牙周炎導(dǎo)致的牙齒脫落的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)研究對象基線水平唾液中代謝物2-吡咯烷乙酸和丁基腐胺與隨訪5 年后的牙齒脫落成正相關(guān)，通過表型關(guān)聯(lián)和代謝網(wǎng)絡(luò)分析，研究者認(rèn)為2-吡咯烷乙酸可能是細(xì)菌降解產(chǎn)物，并認(rèn)為其另一個(gè)潛在來源可能是牙周組織的膠原蛋白轉(zhuǎn)化，因?yàn)槟z原蛋白轉(zhuǎn)化的增加被認(rèn)為是牙槽骨吸收的預(yù)測標(biāo)志，且吡咯烷殘基與膠原蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。由此And?rfer 等認(rèn)為2-吡咯烷乙酸和丁基腐胺可以作為生物標(biāo)志物用于篩查和診斷牙周炎、識別及預(yù)測牙齒脫落的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，基于代謝物診斷和預(yù)測牙周炎具有較高的準(zhǔn)確率，可以識別牙周炎的特異性代謝譜。目前預(yù)測模型的局限性在于對模型的驗(yàn)證多是基于同隊(duì)列人群，缺乏外部臨床驗(yàn)證以提高模型的適用性。

3 齦溝液代謝組學(xué)在牙周炎中的應(yīng)用

齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）是各種細(xì)菌產(chǎn)物進(jìn)入牙齦或宿主源性免疫成分向外運(yùn)輸?shù)妮d體。在健康部位，齦溝液由毛細(xì)血管滲出的血清構(gòu)成；當(dāng)牙周發(fā)生炎癥或受機(jī)械刺激時(shí)，齦溝液主要由炎性滲出液構(gòu)成，因此齦溝液的成分可用于檢測組織代謝、炎癥細(xì)胞募集和結(jié)締組織重塑等臨床和亞臨床變化［25］。

3.1 與牙周炎發(fā)生、發(fā)展、診斷相關(guān)的齦溝液代謝物和診斷標(biāo)志物

Hashimura 等［26］采用LC-MS 法發(fā)現(xiàn)牙周炎患者齦溝液中溶血磷脂酸的濃度低于健康對照組，隨后通過大鼠牙周炎模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，牙周局部注射溶血磷脂酸可減輕牙周炎造成的骨吸收，認(rèn)為齦溝液中高濃度的溶血磷脂酸可以維持正常的牙齦上皮完整性和功能，抑制牙周炎的進(jìn)展。Pei 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，甘氨酸、N -氨甲酰谷氨酸、果糖-1 等17 種代謝物是牙周炎患者齦溝液的顯著差異代謝物，研究者通過進(jìn)一步分析認(rèn)為，檸檬酸和N-氨基甲酰谷氨酸聯(lián)合檢測對中、重度牙周炎的診斷有較好的準(zhǔn)確性（AUC = 0.876），是齦溝液中有效的診斷標(biāo)志物。Ghallab 等［27］使用液相色譜法測定齦溝液樣本中的丙二醛水平，發(fā)現(xiàn)侵襲性牙周炎組齦溝液中丙二醛含量顯著高于牙周炎組和健康組，牙周炎組齦溝液中丙二醛含量顯著高于健康組，認(rèn)為丙二醛等是牙周炎氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。與牙周炎患者相比，侵襲性牙周炎患者齦溝液代謝物出現(xiàn)顯著差異，與Romano 等［15］唾液代謝組的研究結(jié)果不同，提示侵襲性牙周炎患者齦溝液中存在更高的氧化應(yīng)激水平，其差異可能歸因于與侵襲性牙周炎嚴(yán)重牙周破壞相關(guān)的其他氧化因素。

3.2 與牙周炎發(fā)生、發(fā)展、診斷相關(guān)的代謝途徑

Pei 等［3］采用GC-MS 技術(shù)對58 名受試者的齦溝液進(jìn)行分析，認(rèn)為嘧啶代謝、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝是牙周炎患者顯著過表達(dá)的代謝途徑，研究者通過聯(lián)合微生物組學(xué)分析認(rèn)為代謝途徑的差異可能反映了牙周炎相關(guān)菌群的代謝特征。已有研究證明活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與了牙周炎過程中牙周組織的破壞［28］，但ROS 的生化來源尚不明確，Barnes 等［29］通過GC-MS 和LCMS 技術(shù)對齦溝液樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在牙周炎炎癥位點(diǎn)，肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、鳥苷和鳥嘌呤表達(dá)上調(diào)，嘌呤降解途徑和黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的ROS 明顯加快，研究者認(rèn)為嘌呤降解途徑和黃嘌呤氧化酶可能與牙周炎的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并認(rèn)為黃嘌呤氧化酶抑制劑有望在牙周炎的治療中發(fā)揮作用。

4 小 結(jié)

隨著代謝組學(xué)分析技術(shù)在牙周炎領(lǐng)域的逐步應(yīng)用，代謝組學(xué)分析為闡明牙周炎的病因、探尋可能的診斷和預(yù)測標(biāo)志物做出了積極貢獻(xiàn)。然而，牙周炎代謝組學(xué)的研究仍面臨許多挑戰(zhàn)。首先，由于吸煙、糖尿病等牙周炎的危險(xiǎn)因素對機(jī)體代謝水平影響較大，部分牙周炎代謝組學(xué)研究并未說明患者的一般狀況及危險(xiǎn)因素控制情況［15-16,20］，造成研究結(jié)果異質(zhì)性較高，提示研究者在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意排除其他因素對研究的影響。其次，代謝物對環(huán)境因素敏感度高，飲食、年齡、性別、晝夜節(jié)律和鍛煉等因素均會(huì)造成代謝物波動(dòng)，個(gè)體間代謝物差異大，對研究目標(biāo)造成一定干擾，對于這一問題，可以通過完善統(tǒng)計(jì)分析方法、建立數(shù)據(jù)庫等途徑降低混雜因素對結(jié)果的影響，例如HMDB和FooDB 數(shù)據(jù)庫現(xiàn)已包含了關(guān)于人體體液和飲食成分中特定代謝物濃度范圍的信息，可以為判斷代謝物波動(dòng)是否由混雜因素造成提供參考。

盡早確定可靠的代謝標(biāo)志物對牙周炎的發(fā)病進(jìn)行預(yù)測并制定有效防治措施具有重要意義，為了保證預(yù)測標(biāo)志物的靈敏度、特異性和可靠性，需要采用多中心前瞻性研究等方法，以更好實(shí)現(xiàn)代謝組學(xué)在牙周炎防治方面的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

【Author contributions】 Zhao R wrote the article. Huang J revised the article. Fang M, Tian M reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.