劉健鑫， 葉玲， 汪成林

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓科，四川 成都（610041）

基于細胞移植的牙髓再生屬于組織工程技術(shù)，使用的外植入體一般包括外源性干細胞、支架和生長因子三個部分。雖然部分前瞻性臨床研究提示基于細胞移植的牙髓再生能獲得穩(wěn)定理想的臨床效果［1-2］，但目前技術(shù)并不成熟，大多數(shù)研究尚停留在體內(nèi)實驗階段。動物模型的選擇對體內(nèi)實驗結(jié)果影響巨大。生物醫(yī)學(xué)實驗常選用異位模型和原位模型，而因為牙髓再生環(huán)境的特殊，延伸出了一種新的動物模型——半原位模型。另外，因各模型構(gòu)建難度、檢測手段并不相同，研究者對動物模型的選擇逐漸從單一的動物模型過渡到分階段使用多種動物模型綜合評價。本文從基于細胞移植的牙髓再生技術(shù)需求出發(fā)，在Pubmed 網(wǎng)站對“pulp regeneration”、“stem cell”、“animal model”等關(guān)鍵詞進行檢索，收集了基于細胞移植的牙髓再生實驗動物體內(nèi)模型相關(guān)內(nèi)容，將已建立的動物體內(nèi)模型，根據(jù)誘導(dǎo)牙髓再生的環(huán)境不同分為異位再生模型、半原位再生模型、原位再生模型進行綜述，旨在為研究者在牙髓再生實驗中合理應(yīng)用各類動物模型提供參考。

1 異位再生模型

異位再生模型是指外植入體誘導(dǎo)的牙髓再生發(fā)生位置不在牙齒根管內(nèi)的免疫缺陷動物模型。異位再生模型只需將消毒后的外植入體植入免疫缺陷鼠的皮下或腎被膜下，操作簡便。該模型使用小鼠或大鼠，在實驗成本、實驗周期、分析測試手段等方面擁有明顯優(yōu)勢［3］。

皮下移植空間大、操作最方便，但由于存在植入體易移位、再生環(huán)境復(fù)雜等缺點會影響實驗結(jié)果［4］。腎被膜下區(qū)域血運豐富、免疫反應(yīng)弱、無內(nèi)源性干細胞影響［5］，但該區(qū)域操作難度大，且組織易破裂使外植入體游離于腹腔造成實驗失敗。異位再生模型只是驗證外植入體再生效果的簡單模型，更側(cè)重操作的簡便性，目前主要采用皮下異位再生模型。

異位再生模型非常適合實驗初步驗證外植入體的再生效果及安全性。如Chang 等［6］用高溫高壓處理的人預(yù)處理牙本質(zhì)基質(zhì)（human treated dentin matrix，hTDM）搭載牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）植入小鼠皮下，第6 周觀察到了比未處理hTDM 組更多的成牙本質(zhì)細胞和牙本質(zhì)樣組織，同時觀察到了釉質(zhì)結(jié)構(gòu)，該陽性結(jié)果指導(dǎo)Chang 等設(shè)計了之后的原位再生實驗［6］。Atalayin 等［7］將添加了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的羥基磷灰石/β-磷酸三鈣復(fù)合支架、D，L-丙交酯支架和L-丙交酯與D，L-丙交酯共聚材料支架分別搭載hDPSC植入免疫缺陷小鼠皮下，第6 周和第12 周均檢測到牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）等牙本質(zhì)發(fā)生相關(guān)蛋白表達水平明顯高于不含rhBMP-2 的對照組，初步證明了rhBMP-2 可作為基于細胞移植的牙髓再生實驗的外源性生長因子使用。這些在異位再生模型上得到的結(jié)果為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

異位再生模型的缺點在于再生環(huán)境與真實情況相去甚遠，實驗結(jié)論準確性不高，因此通常作為牙髓再生體內(nèi)實驗的第一步，之后需要其他再生模型進一步驗證。

2 半原位再生模型

半原位再生模型是指外植入體誘導(dǎo)的牙髓再生發(fā)生在真實的牙齒片段根管內(nèi)，但該牙齒片段經(jīng)過體外處理并移植于動物體內(nèi)非牙齒生理所在位置的免疫缺陷動物模型。該模型相對于異位再生模型難度大、操作要求高，但具有如下優(yōu)勢：提供干細胞與牙齒硬組織的接觸界面，能有效誘導(dǎo)各類干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞［8］；提供貼近生理情況的三維再生環(huán)境；限制了外植入體的血供和植入位置本身的干擾［9］。另外，由于仍可使用小鼠或大鼠建立模型，成本低、周期短和分析檢測容易的優(yōu)勢仍然存在。

半原位再生模型可分為牙薄片模型和牙片段模型兩種，植入部位通常也選擇在皮下或腎被膜下。

2.1 牙薄片模型

牙薄片模型是在垂直于牙體長軸方向上切取牙根頸部薄片，將牙髓組織去凈后，填入合適的支架和干細胞并植入小鼠皮下或大鼠腎被膜下。牙薄片模型增加了外植入體與牙本質(zhì)的接觸界面，用牙本質(zhì)誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞向分化、促進牙髓再生［8］。同時，牙本質(zhì)界面的存在對再生組織的功能層次有指示定位的作用。該模型能初步檢驗外植入體的功能性牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體組織再生能力，另外由于能誘導(dǎo)多能干細胞向成牙本質(zhì)細胞向分化，牙薄片模型非常適合在非牙源性干細胞的牙髓再生實驗中作為動物實驗的第一步［10］。

由于兩端開放的結(jié)構(gòu)特點，填充的支架材料需要一定的剛性和可塑性以防脫出，可聚合的左旋聚乳酸（poly L-lacticacid，PLLA）使用較多［11］。有研究將基于PLLA 的牙薄片搭載hDPSC 后植入免疫缺陷小鼠皮下［12］，2 周至1 個月后觀察到實驗組高分泌活性細胞的出現(xiàn)，DMP-1、DSPP 等成牙本質(zhì)細胞分化標志基因表達明顯高于僅含PLLA 支架的對照組，體現(xiàn)了牙薄片模型中牙本質(zhì)對于成牙本質(zhì)細胞分化的誘導(dǎo)作用。

除PLLA 外，還有一些使用其他方法或支架構(gòu)建的牙薄片模型。Lei 等［10］將人骨髓間充質(zhì)干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMMSC）細胞聚集體接種到2 mm 厚的牙薄片內(nèi)并植入大鼠腎被膜下，6 周后在牙本質(zhì)內(nèi)壁上觀察到類成牙本質(zhì)細胞層，而不含細胞的牙薄片和僅含細胞團的異位再生對照組均未發(fā)現(xiàn)類成牙本質(zhì)細胞。該實驗證明了hBMMSC 的成牙本質(zhì)潛能和牙本質(zhì)壁對hBMMSC 的誘導(dǎo)作用。Tan 等［13］將交聯(lián)的透明質(zhì)酸凝膠與牙胚來源的間充質(zhì)干細胞混合注射到1 mm 厚的牙薄片內(nèi)并植入裸小鼠皮下，10 周后觀察到沿牙本質(zhì)內(nèi)壁排列的柱狀類牙本質(zhì)細胞和管狀牙本質(zhì)的形成。該模型比基于PLLA 的牙薄片模型更容易構(gòu)建，且由于該凝膠的可注射性，具有臨床轉(zhuǎn)化價值。

牙薄片半原位再生模型環(huán)境血供豐富，且不需要進行根管預(yù)備等臨床操作，但對牙髓再生真實環(huán)境的模擬相對有限，目前僅作為一種驗證外植入體功能性再生能力的簡單模型。

2.2 牙片段模型

由于牙片段模型是在保留根尖的基礎(chǔ)上切取牙根方一定長度的牙片段，根管預(yù)備消毒后填入合適的外植入體，冠方封閉并植入動物相應(yīng)部位。牙片段模型的根管長度接近實際牙根，并且根管內(nèi)部營養(yǎng)供給只能由根方進入，貼近真實血供情況。另外，實驗對牙片段的處理技術(shù)可為臨床操作提供參考。

牙片段模型截取的根管長度和預(yù)備后的根方直徑直接影響血供，能否實現(xiàn)全長根管內(nèi)的牙髓再生是評價外植入體再生效果和應(yīng)用條件的重要指標。Huang 等［14］通過預(yù)備得到根管長5～6 mm、根方直徑1～2.5 mm的牙片段，經(jīng)消毒清洗后用聚-D，L-丙交酯-乙交酯（poly-D，L-lactide and glycolide，PLG）支架搭載hDPSC 置入牙片段內(nèi)并植入免疫缺陷小鼠皮下，3 個月后觀察到再生組織充滿整個根管腔，有類似天然牙髓的細胞密度、血管化的髓樣組織及類牙本質(zhì)。該研究團隊在同樣實驗條件下更換成根尖孔較?。? mm）、根管較長（6～10 mm）的牙片段模型，發(fā)現(xiàn)牙髓再生僅發(fā)生在根尖部分［15］。該結(jié)果提示該外植入體成牙本質(zhì)能力雖強，但血管生成能力不足，臨床上很難保證全長根管內(nèi)血供充足。

為了保障外植入體的血供，牙片段模型被用來測試不同的支架或生長因子的效果?？勺⑸洹⑸锝到庑院玫妮d細胞微球系統(tǒng)擁有允許營養(yǎng)快速擴散的巨大表面積，以基于PLLA 的微球系統(tǒng)最具代表性［16］。有研究用牙片段模型探究搭載hDPSC 的基于PLLA 的納米纖維海綿微球。預(yù)備牙片段的根尖孔直徑為1.5～2 mm、根長為6 mm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仿細胞外基質(zhì)多孔結(jié)構(gòu)能促進hDPSC 的附著、增殖，并實現(xiàn)牙片段全長范圍內(nèi)的牙髓-牙本質(zhì)樣組織再生［17］。Li 等［18］預(yù)備13 mm 長、根尖直徑1 mm 的牙片段，把包裹有血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的PLLA 微球系統(tǒng)搭載hDPSC 置于其中，植入裸小鼠皮下9 周后觀察到全長范圍內(nèi)富含血管的牙髓樣組織和類牙本質(zhì)以及與牙本質(zhì)小管對齊排列的成牙本質(zhì)樣細胞層。該結(jié)果提示牙片段根尖直徑應(yīng)預(yù)備至1 mm以上。

牙片段模型構(gòu)建復(fù)雜，但對牙髓再生環(huán)境的模擬較全面，可綜合探究外植入體的功能性牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的組織再生能力。另外，牙片段處理技術(shù)和臨床操作相關(guān)，對于后續(xù)研究及臨床轉(zhuǎn)化有參考價值。

3 原位再生模型

異位再生模型、半原位再生模型易于控制和研究，但與實際臨床情況仍有以下不同：植入部位的血供與根尖周組織有一定差異；消毒、牙體預(yù)備等處理程序是體外操作；使用動物是免疫缺陷動物。而原位再生模型是指外植入體誘導(dǎo)的牙髓再生發(fā)生在生理位置死髓牙根管內(nèi)的動物模型，該模型高度還原真實情況，其實驗結(jié)果是臨床轉(zhuǎn)化的重要依據(jù)。另外，在原位再生模型上能將應(yīng)用于臨床的基于細胞歸巢的牙髓再生技術(shù)作為對照組使用，實驗結(jié)果更有說服力。目前常用的有雪貂、狗、小型豬三種原位再生動物模型。

3.1 雪貂模型

雪貂動物模型的根管解剖結(jié)構(gòu)類似人類。雄性雪貂未發(fā)育完全的尖牙長約15～17 mm，足以使用臨床牙科設(shè)備進行根管內(nèi)操作，雪貂發(fā)育較快，50～90 日齡即可用于實驗，因此雪貂在牙體牙髓領(lǐng)域?qū)嶒炛袘?yīng)用很多，特別是基于細胞歸巢的牙髓再生實驗［19］。

目前的原位再生模型需要使用該動物的同種異體干細胞或自體細胞以避免強烈的免疫排斥反應(yīng)。2016 年Homayounfar 等［20］從雪貂尖牙中分離鑒定了雪貂牙髓干細胞（ferret dental pulp stem cell，fDPSC）。Verma 等［21］用藻酸鹽/纖維蛋白凝膠支架搭載fDPSC 植入感染的雪貂尖牙根管內(nèi)，在實驗組中發(fā)現(xiàn)了牙本質(zhì)樣礦化組織的沉積。雖然和基于細胞歸巢的牙髓再生方法對比無明顯差異，但這項研究首次在雪貂原位模型上嘗試基于細胞移植的牙髓再生實驗，展現(xiàn)了雪貂原位再生模型的可操作性。

3.2 狗模型

狗牙發(fā)育時間在4～6 月齡，狗尖牙和前磨牙的解剖結(jié)構(gòu)和牙發(fā)育過程與人類相似。其中，比格犬體型和牙齒大小類似人類、性格溫順，常用于構(gòu)建狗的牙髓原位再生模型。

Ashiry 等［22］把是否搭載自體DPSC 作為變量，將加入了VEGF 等生長因子的殼聚糖水凝膠支架植入狗前牙根管內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)搭載自體狗牙髓干細胞（dog dental pulp stem cell，dDPSC）的實驗組根管內(nèi)形成牙髓樣組織和管狀類牙本質(zhì)，而未搭載干細胞的對照組中未觀察到明顯的牙髓樣組織再生。該動物模型展現(xiàn)了這種使用自體干細胞的外植入體的臨床前景，值得進一步探究。

Iohara 等［23］通過粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）在體外刺激同種異體dDPSC 得到大量干細胞后，用膠原支架搭載并植入狗右上第二切牙和右下第三切牙根管內(nèi)，在第12 周的免疫組化結(jié)果中觀察到了再生至釉牙骨質(zhì)界的牙髓樣組織形成，再生組織的血管化及神經(jīng)化水平顯著高于未動員dDPSC 對照組。證明了G-CSF 干細胞動員法能提高干細胞分離培養(yǎng)效率，并有助于牙髓再生。

Huang 等［24］認為牙髓組織集干細胞、支架、生長因子于一體，是天然的組織工程材料。他們將狗自體乳牙牙髓組織整體取出后植入自身前牙根管內(nèi)，以基于細胞歸巢的牙髓再生方法為對照組，結(jié)果顯示實驗組沿管壁形成管狀牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，提示自體乳牙牙髓組織可直接作為完整的外植入體用于基于細胞移植的牙髓再生。

3.3 小型豬模型

小型豬因為解剖學(xué)、病理生理學(xué)或遺傳學(xué)上與人類的高度相似性，是口腔組織再生實驗如骨再生、牙周組織再生最常用的大型動物研究模型［25］，但目前在基于細胞移植的牙髓再生領(lǐng)域僅少量研究涉及。

Kodonas 等［26］首次使用了小型豬原位再生模型，使用膠原或PLGA 搭載異體豬牙髓干細胞（swine dental pulp stem cell，sDPSC）植入小型豬上下前牙根管內(nèi)，術(shù)后10 周觀察到新生牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)沉積并有類成牙本質(zhì)細胞沿壁有序排列，免疫組化結(jié)果顯示新生礦化組織DMP-1、骨唾液酸蛋白-II（bone sialophosphoprotein-Ⅱ，BSP-Ⅱ）抗體呈陽性。而不含細胞或支架的對照組出現(xiàn)了牙根吸收。Xuan 等［1］同樣使用了單根管的小型豬原位再生模型，將分離的小型豬自體脫落乳牙牙髓干細胞細胞聚集體植入下頜切牙根管中，3 個月后的免疫組化分析顯示再生出了具有血管和神經(jīng)的功能性牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，而僅植入氫氧化鈣的對照組無再生組織出現(xiàn)。此外，多根管牙的牙髓再生也在小型豬原位再生模型中報道實現(xiàn)。Zhu 等［15］用羥基磷灰石/β-磷酸三鈣支架搭載異體和自體sDPSC 植入小型豬第三前磨牙根管內(nèi)，在多根管中均成功再生出全長范圍內(nèi)富含血管的牙髓樣組織和新生牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。這些實驗結(jié)果提示了同種異體干細胞在小型豬模型中是安全有效的。同時，小型豬多根管牙牙髓再生的成功也拓展了小型豬模型在牙髓再生技術(shù)的應(yīng)用范圍。

4 展 望

牙髓再生動物模型中，異位再生模型適合實驗初期用于測試干細胞、支架和生長因子的安全性和是否具備再生能力，半原位再生模型通過簡單還原部分真實情況對有再生能力的外植入體進行深入的再生效果評價，而原位再生模型適合在臨床研究之前對有再生能力的外植入體進行最終的再生效果和實用性評價。希望研究者們能設(shè)計完整的實驗方案，合理使用各類動物模型，為后來者提供模型構(gòu)建經(jīng)驗，為構(gòu)建的外植入體提供更充分的臨床前證據(jù)，最終推進臨床試驗的開展［2-4］。