魏 欣，徐維平

(1.中國科學院合肥物質科學研究院智能機械研究所，合肥 230031；2.中國科學技術大學研究生院科學島分院，合肥 230026；3.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院，合肥 230001)

加強科學研究過程中實驗設計的科學性以及對動物給予人道主義關懷和福利，加快替代動物實驗的廣泛實施，實現(xiàn)對替代動物倫理委員會替代方案評估的指導，規(guī)范替代動物倫理委員會的審查工作，切實保護實驗動物的權益是推進動物實驗改革的重要內容。嚴格遵守《動物倫理學》3R原則，即實驗動物的替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)，向社會倡導科學、人道地開展動物實驗是科學研究始終堅守的宗旨。替代是使用低等動物代替高等動物，或不使用動物而采用其他方法達到與動物實驗相同的目的[1]；減少是使用較少量的動物獲取同樣多的實驗數據或使用一定數量的動物獲得更多的實驗數據[2]；優(yōu)化是對必須使用的實驗動物，應盡量減低非人道方法的使用頻率或危害程度[3]。隨著時代的進步，Russell和Burch在3R原則的基礎上提出了4Rs原則，強調在實驗過程中要不斷增強倫理觀念，對實驗動物要有責任感(responsibility)[4]。

隨著實驗動物質量要求和控制級別越來越高以保證實驗結果的均一性和重復性，以及受到動物福利和動物保護主義思想的影響，人們更加傾向于把握實驗動物福利原則、遵循實驗動物福利法規(guī)、嚴格履行動物實驗倫理審查制度。但針對高校師生、醫(yī)務工作者和實驗動物從業(yè)人員關于動物福利倫理認知情況的調查結果顯示，對動物福利倫理管理法規(guī)和動物福利概念，大多數人沒有清晰的認識和了解，這種現(xiàn)象說明我國關于動物福利教育的普及亟待進一步加強[5]。3R原則在近代動物實驗研究發(fā)展中是始終貫穿的核心思想，它試圖通過其他實驗手段代替動物實驗或用離體培養(yǎng)的細胞、組織、器官等半替代動物實驗減少動物的使用，這在單克隆抗體的生產、病毒疫苗的制備、效力和安全性實驗、細胞膜研究等項目中已廣泛應用。通過使用低等生物如用果蠅代替小鼠研究致畸致突變[6]；用海洋無脊椎動物代替蟾蜍和犬研究神經生理學[7-8]；用微生物代替動物進行艾母式試驗(ames test)[9]；用物理方法代替動物研究心肺復蘇等病理過程；用免疫化學方法代替動物來搜尋抗原或鑒定毒素的存在。此外，計算機模擬在替代動物實驗的應用中已初見曙光，計算機毒理學在新藥毒性研究應用中具有前景。國外實驗室還通過使用光纖、導管、激光等遠程控制，盡量減少對動物的刺激，避免應激反應提高實驗的準確性[10]。替代動物方法和模型取得了長足進展。然而，關于替代動物實驗的倫理規(guī)范目前國家尚無明確法規(guī)出臺，現(xiàn)就替代動物實驗倫理相關進展進行綜述。

1 替代動物實驗研究倫理規(guī)范化的必要性

1.1 實驗動物使用持續(xù)增長

針對實驗動物使用數量的調查結果顯示，我國2016—2018年間的新藥研發(fā)使用的實驗動物數量呈平穩(wěn)增長趨勢[11]。2008年至2017年期間，土耳其共有約210萬只動物被用于實驗和其他科學研究目的[12]。土耳其管理動物使用的法律結構與歐盟的法律結構是一致的。1995年至2011年間，歐盟國家用于科學研究目的的動物總數量(每年約1 100萬只)保持相對穩(wěn)定，德國和英國的凈數量在增加，比利時、丹麥、意大利、芬蘭、荷蘭和瑞典的凈數量在減少。在實驗動物用途分類上，用于安全性評估的實驗動物數量相對較低(其中毒理學為8%)，這可能是由于在這一領域對替代方法進行了特別密集的研究導致實驗動物使用減少[13]。在總量上，有研究對2015年全球使用的實驗動物數量進行了估計，2015年用于科學目的的動物數量全球總數為1.921億只，比2005年統(tǒng)計數量增加36.9%[14]。這一數字包括因其組織有用而被處死的動物、用于維持轉基因菌株的正常動物和沒有有害基因突變的轉基因動物，以及為實驗室用途而飼養(yǎng)但未使用的動物。由此可見，控制實驗動物的使用數量，積極尋找替代方案是全球共同致力的心愿。

1.2 動物實驗倫理規(guī)范欠缺

雖然實驗動物模型在科學研究中具有非常多的優(yōu)越性，然而動物實驗倫理的規(guī)范化目前還存在缺陷。研究顯示，無論是科學研究設計[15]、醫(yī)學教學過程[16]，還是期刊論文發(fā)表要求中動物實驗的倫理審查都還存在大量不規(guī)范的問題[17]。動物實驗符合倫理要求一方面是人道主義的體現(xiàn)，另一方面是保障實驗結果可靠、可重復的重要前提。目前動物實驗倫理缺陷主要體現(xiàn)在動物實驗倫理學認識不足、試驗過程中缺乏對動物倫理的思考，國內學術期刊對實驗動物倫理的要求有待提高，實驗動物倫理審查委員會建設有待規(guī)范，實驗動物機構資質認證有待加強，實驗過程對動物的麻醉、取材和處死過程有待優(yōu)化等[18-19]。

雖然人們已經發(fā)現(xiàn)動物實驗暴露的倫理問題，但動物實驗倫理規(guī)范化進展緩慢，并且不同國家的法律法規(guī)跟進程度和速度差異巨大，難以在短期內對現(xiàn)狀實現(xiàn)較大的改善。因此，使用低等生物替代高等生物，使用非生物替代生物的替代動物研究方法成為研究者的希望所在。替代動物在很多方面避免了倫理審查問題，采用其他手段減少動物的使用或不使用動物進行科學研究，因此規(guī)范化更加容易實現(xiàn)，在近年來得以快速發(fā)展。

2 替代動物研究倫理規(guī)范評估的范圍

“替代”是3R原則的核心內容之一。替代動物實驗的基本范圍主要包括3個層次：(1)應用體外實驗替代整體動物實驗，如體外培養(yǎng)的動物或人原代細胞、組織標本、類器官和細胞系等；(2)應用低等生物和有限知覺的生物體替代脊椎動物實驗，如植物、細菌、果蠅和斑馬魚等；(3)應用數學、物理和化學方法以及計算機模型等非生物手段，如利用構效關系(structure-activity relationships，SARs)模型預測化合物的潛在生物學效應[20]。替代方法主要研究內容包括:毒理學檢測、化妝品毒性檢測、眼刺激試驗替代方法;動物模型替代，以體外細胞實驗代替整體動物實驗；藥物代謝反應和動物實驗教學等。

2.1 毒理學檢測、化妝品毒性檢測、眼刺激試驗替代方法

替代動物毒理學檢測范圍包括急性經口毒性試驗、急性吸入毒性試驗、皮膚腐蝕試驗、皮膚刺激試驗、經皮膚吸收試驗、眼刺激試驗、皮膚過敏試驗、光毒性試驗、內分泌干擾試驗、胚胎毒性試驗、血液毒性試驗、遺傳毒性[10]。當前國家已發(fā)布的替代方法標準幾乎全部涉及化妝品毒性研究，如化妝品體外替代試驗實驗室規(guī)范(SN/T 2285—2009)、化妝品急性毒性的角質細胞試驗(SN/T 2328—2009)、防曬化妝品紫外線A(UVA)光防護效果體外測定方法(SN/T 5150—2019)等[21]。目前根據使用材料和作用原理的不同，眼刺激試驗替代方法可分為7類：(1)嚴重眼損傷和眼刺激性的體外綜合測試評估方法；(2)牛角膜渾濁和滲透性試驗細胞膜損傷試驗；(3)離體雞眼試驗；(4)短時暴露試驗；(5)重組人角膜上皮模型試驗；(6)熒光素滲漏試驗；(7)其他替代試驗方法(如體外細胞試驗方法、微生理儀細胞傳感器試驗等)[22]。

2.2 動物模型替代

科學研究在探索現(xiàn)象和真理的同時也會使動物造成超出研究范圍的傷害，因此科學家一直在不斷探索減少動物在研究模型中的使用，或使用非生物體模型進行替代研究從而避免動物的使用。例如，在皮膚抗氧化功效評價模型的使用中，從最初使用大鼠模型進行紫外線照射等研究[23]，發(fā)展到使用動物離體皮膚模型[24]、Episkin模型及Phenion和EpiDermTM等商用全層皮膚模型[25-27]。這避免了動物在實驗過程中造成的皮膚損傷和全身系統(tǒng)反應。類似的，在神經發(fā)育毒性動物實驗研究中，由于毒性化合物的數量巨大，采用哺乳動物進行神經毒性研究在經濟上和動物使用數量上都是巨大負擔，因此采用體外細胞模型模擬神經發(fā)育過程中的關鍵事件，進行化合物的神經毒性測定[28-30]。由于神經系統(tǒng)交錯影響的復雜性，為了彌補體外細胞模型的局限性，還采用了非哺乳動物模型進行系統(tǒng)研究，如斑馬魚、線蟲和果蠅等已廣泛用于神經發(fā)育機制的研究[31]。

2.3 藥物代謝反應和動物實驗教學替代研究

2.3.1 藥物代謝反應體外模擬

計算機模擬在藥物代謝反應替代研究中發(fā)揮重要作用，尤其是基于生理的生物動力學(physiologically-based biokinetic，PBBK)模擬計算工具可以用來預測化妝品的毒性和藥物的吸收、分布、代謝、排泄特征[32]。此外，計算機模擬還常常被用來在細節(jié)上模擬蛋白質、受體、脂質雙分子層、血腦屏障等預測他們對物理條件和刺激或化學物質的行為或反應。計算機模擬和信息學方法通過預先篩選潛在的藥物候選分子，排除成藥可能性較小的化合物從而使藥物發(fā)現(xiàn)過程縮短以及犧牲的實驗動物數量最小化，此外還避免了倫理問題。用基于計算機的替代動物實驗室的比例在西班牙最高(73%)，而在法國和意大利則較低。波蘭、捷克共和國和羅馬尼亞報告了相對較高的計算機化替代試驗使用率。意大利(64%)和荷蘭(67%)最大限度地利用免費的計算機資源。西班牙(27%)、德國(41%)和荷蘭(22%)等國家最大限度地利用了內部開發(fā)的計算機模擬資源[33]。

2.3.2 實驗教學替代研究

高校教學是實驗動物使用的重要組成部分，關于動物實驗教學過程中的替代研究已有一些共識。教學中使用的動物數量約占使用動物總數的1%到10%[34]。人們呼吁通過使用人體生理學實驗代替部分動物教學，或通過合并實驗內容最大程度減少教學過程中動物的使用，強化學生的動物倫理觀念，尊重和保障動物福利。此外，還可以通過增加計算機模擬和視頻教學增強學生操作技能，防止教學過程中因操作原因增加動物不必要的傷害[35]。實踐表明，使用多元化的方式進行動物實驗教學并不會影響實驗教學的效果，反而激發(fā)了學生的學習興趣[2]。計算機模擬和視頻教學也方便學生在課后反復練習，鞏固了教學成果。

3 替代動物研究倫理規(guī)范評估指導原則

人源的細胞和組織在疾病和治療相關研究中具有獨特的優(yōu)越性，更加貼近真實疾病狀態(tài)，因此深受研究者的青睞。雖然替代動物實驗通過選擇細胞、人體組織或低等生物及計算模型代替研究在一定程度上減少了傳統(tǒng)實驗動物的使用，然而關于替代動物實驗中的倫理審查規(guī)范還不十分明確。“人類基因編輯嬰兒”事件是替代動物實驗倫理不規(guī)范的典型案例[36]，該事件造成了嚴重的社會影響并引發(fā)全社會范圍對科學研究過程中倫理問題的關注與擔憂。通常公眾輿論只有在有助于開發(fā)更好的藥物或增加對疾病的了解時才會支持動物研究，進而促進有效的預防方法或對抗此類疾病的新藥被發(fā)現(xiàn)[37]。因此，在采用替代動物方法進行研究時必須嚴格遵守相關倫理規(guī)范。3R原則和5項自由原則(即免于饑渴、不適、痛苦、傷害和疾病、恐懼和焦慮的自由，自由表達天性)同樣適用于替代動物實驗。對低等動物和無脊椎動物替代研究實驗，要遵守實驗動物倫理原則，尊重動物生命和權益，遵守人類社會公德。堅決反對針對動物的野蠻和不人道的行為。對非生物類型的研究，如計算機模擬等的研究，要充分保證替代方法驗證有效，以保證藥物開發(fā)的成功率及臨床試驗的有效性。

4 替代動物研究倫理規(guī)范實施后追蹤

為了對替代動物研究倫理規(guī)范實施效果進行評估，各級倫理委員會應對特定的實驗進展進行倫理追蹤，不斷強化替代動物實驗的監(jiān)管，保證實施與方案的一致性。對實施過程中的方案變更要及時嚴格進行補充審查，防止變更過程中有不符合倫理規(guī)范的操作。

4.1 對減少或優(yōu)化的動物實驗研究

所謂實驗動物的福利倫理審查，就是按照實驗動物福利倫理的原則和標準，對使用實驗動物的必要性、合理性和規(guī)范性進行專門的檢查和審定。實驗動物(福利)倫理委員會是可獨立開展實驗動物福利倫理審查工作的專門組織，負責實驗開展前、實驗過程中及實驗結束后對實驗過程中動物福利和倫理規(guī)范進行審查和評估。倫理委員會由本級實驗動物主管機構或從業(yè)單位負責組建；可根據實驗動物有關法律、規(guī)定和質量技術標準，負責各自管理權限范圍內實驗動物從業(yè)單位的實驗動物相關的福利倫理審查和監(jiān)督，受理相關的舉報和投訴[38]。

4.2 對教學過程中動物實驗研究

為規(guī)范醫(yī)學及獸醫(yī)學教學過程中的動物倫理審查，院校教學使用的動物應向學校動物倫理委員會報備，教師按照要求提交倫理審查批準書。授課教師應詳細記錄教學內容和動物處理過程、處理結果。每次教學結束應及時提交當次實驗報告給動物倫理委員會備查，倫理委員會及時審查并給出相應意見進行教學改進[39]。若教學過程中發(fā)生突發(fā)事件導致動物意外死亡或因其他原因導致的實驗動物增加的情況，教師應在教學結束后及時向動物倫理委員會進行補充說明。倫理委員會及時審查并評估合理性。教學使用動物的倫理規(guī)范實施后追蹤是教學改進的重要方式。

4.3 對涉及人的標本和細胞實驗研究

研究過程中更改實驗方案，更改細胞或組織類型，增加樣本來源等需要主動向倫理委員會提交倫理審查申請。此外，從人體補充獲取的細胞或組織需獲得受試者的知情同意。

4.4 對醫(yī)療器械動物實驗研究

醫(yī)療器械動物實驗的開展是經決策評估后實施的，而實施后的倫理追蹤對保障動物福利是非常重要的環(huán)節(jié)。倫理委員會在核查過程中發(fā)生以下情況有權要求停止已開展的實驗[40]：實際操作人員未經專業(yè)培訓，違反倫理原則要求的；實際實驗環(huán)境、飼養(yǎng)設施不合格的；實驗過程操作缺乏人性化、虐待動物的；活體解剖未麻醉、處死動物手段殘忍的；實驗動物極端痛苦而對人和動物無任何益處的；供試品和對照品在同一只(頭)動物受試的。

5 展望

替代動物實驗倫理涉及范圍廣泛、層次復雜，迄今為止已經發(fā)展并論證了許多有效的替代動物方法，在減少實驗動物的使用上發(fā)揮了重要作用，然而目前尚無明確完備的關于替代動物實驗倫理的具體規(guī)范。根據3R原則分類，經減少和優(yōu)化的動物實驗，現(xiàn)行的實驗動物倫理相關法規(guī)對其普遍適用；由低等動物或無脊椎動物替代高等動物可酌情使用現(xiàn)行相關倫理法規(guī)；而非生物實驗的倫理規(guī)范問題則需要在未來進行更多的探索。非生物方法的倫理規(guī)范的制定將有效推進替代動物實驗的發(fā)展和減少實驗動物的使用，這也是未來國內替代動物研究倫理評估標準制定的重點發(fā)展方向。