朱 斌，錢 方，王曉雙，劉映良

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

木蘭科(Magnoliaceae)是雙子葉植物中較為原始的科，基于不同的分類系統(tǒng)，木蘭科有廣義和狹義之分[1]。在恩格勒(Engler)系統(tǒng)分類中，廣義的木蘭科包括木蘭亞科、八角亞科、五味子亞科、水青樹亞科等[2]。在哈欽松(Hutchinson)系統(tǒng)中，狹義的木蘭科指木蘭亞科和鵝掌楸亞科[3]。狹義的木蘭科下有18屬，約335種，我國有14屬，約165種，主要分布于我國東南部至西南部[4]。木蘭科植物不僅是溫帶森林的重要組成成分[5]，也是重要的觀賞和藥用植物[6]，木蘭科植物具有較為原始的性狀，常被作為探究被子植物起源與進(jìn)化的典型代表物種[7-8]。

葉綠體(chloroplast, cp)是綠色植物進(jìn)行光合作用的場所，普遍認(rèn)為起源于“內(nèi)共生”的古藍(lán)細(xì)菌[9]。葉綠體擁有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)[10]。由于葉綠體基因組具有相對(duì)保守、進(jìn)化速率適中、基因組小等特點(diǎn)[11-12]，因此cpDNA被廣泛應(yīng)用于解決物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[13-14]。此外葉綠體蛋白編碼序列也可用于植物的系統(tǒng)發(fā)育分析[15]。matK基因是位于葉綠體賴氨酸t(yī)rnA基因(trnK)的內(nèi)含子內(nèi)、單一拷貝編碼基因，是葉綠體基因組中蛋白編碼基因中進(jìn)化速率最快的基因之一[16]，對(duì)系統(tǒng)學(xué)的研究具有重要價(jià)值。采用單個(gè)基因序列分析物種間的系統(tǒng)關(guān)系已應(yīng)用于許多科屬中，如鱗毛蕨科[17]、石斛屬[18]和木犀屬[19]等。

不同的分類學(xué)者從形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和孢粉學(xué)等對(duì)木蘭科進(jìn)行了系統(tǒng)劃分，但除鵝掌楸屬外，分類學(xué)者對(duì)木蘭科其他屬的劃分存在很大分歧[20]。如Nooteboom[21]認(rèn)為華蓋木屬、擬單性木蘭屬應(yīng)歸并為木蘭屬，而合果木屬和觀光木屬應(yīng)并入含笑屬；隨后通過對(duì)中國木蘭科植物的分類研究，Chen 等[22]又將華蓋木屬歸并入木蓮屬；有學(xué)者通過對(duì)木蘭亞科主要性狀的觀察，將中國木蘭亞科分為木蘭屬和含笑屬，而合果木屬、玉蘭亞屬及觀光木屬被并入含笑屬；王猛等[23]通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)分布于云南的木蘭科植物進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)存在差異，含笑屬、木蘭屬和木蓮屬間存在明顯屬間交叉現(xiàn)象?？傮w而言，木蘭科植物的分類分歧主要存在于木蘭亞科下的一些單種屬和寡種屬之間。由于測序技術(shù)的限制，前人只是對(duì)極少數(shù)的木蘭科物種基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，鮮有cpDNA水平的系統(tǒng)發(fā)育研究。本研究基于已公布的廣義木蘭科41個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用葉綠體全基因組序列(WCGS)、編碼序列(CDS)和matK序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，為木蘭科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)，以及為該科物種精準(zhǔn)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考，為木蘭科植物的種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫共獲取了41個(gè)已公布的木蘭科物種的葉綠體基因組(數(shù)據(jù)獲取的截止日期為2020年11月15日)，以擬南芥(Arabidopsisthalian)葉綠體基因組作為外類群，木蘭科物種葉綠體基因組信息和GenBank登錄號(hào)見表1。

表1 研究所用的木蘭科植物及擬南芥葉綠體基因組信息

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將數(shù)據(jù)經(jīng)EditPlus進(jìn)行初步整理，直接下載WCGS和matK基因序列處理之后用MEGA 7.0以Maximum Likelihood(ML)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；將從NCBI下載經(jīng)過初步篩選處理的注釋文件，選擇所有物種的蛋白編碼基因名，通過在線網(wǎng)站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/提取41個(gè)木蘭科物種的56個(gè)共有蛋白編碼基因，分別為psbB、ycf3、petG、ycf4、rpoB、psbA、psaJ、ccsA、rps8、rbcL、psbM、rps19、rpl2、psaC、matK、psbE、petA、rpl33、psaA、rpl36、ndhJ、psbK、atpI、psbF、rps2、rpl32、atpH、psbN、psaB、atpA、rps14、infA、psaI、psbJ、rpl16、rpl20、rpoA、ndhD、psbH、rpoC2、ndhA、ndhI、ndhH、atpB、petD、ndhB、atpF、rps7、rpl23、clpP、cemA、ndhE、petL、psbT、rps12和ndhC，使用MEGA7.0以ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征

通過對(duì)所選物種的cpDNA比較分析，發(fā)現(xiàn)41個(gè)木蘭科物種的葉綠體基因組大小在142 723～160 183 bp(表1)，最小的是日本八角，最大的是厚樸；不同的物種之間序列大小差異在0～460 bp，其中南五味子和馨香木蘭、墨西哥巨葉木蘭和望春玉蘭的序列大小均無差異；41個(gè)木蘭科cpDNA的GC含量在39.0%～39.8%(平均為39.3%)，均高于擬南芥cpDNA的GC含量(36.3%)，其中含量最高和最低的是南五味子和美洲八角，分別為39.8%和39.0%；蛋白編碼基因數(shù)為77～91，南五味子的編碼基因個(gè)數(shù)最少，為77個(gè)，云南擬單性木蘭的蛋白編碼基因個(gè)數(shù)最多，為91個(gè)；葉綠體基因組基因總數(shù)為116～138個(gè)，其中最少的是五味子，最多的是云南擬單性木蘭。

2.2 不同建樹方法的比較

對(duì)木蘭科41個(gè)物種的WCGS、CDS和matK基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，統(tǒng)計(jì)3種建樹方法中各個(gè)分支的BVs[圖1(a)]。系統(tǒng)發(fā)育樹共生成39個(gè)分支，WCGS系統(tǒng)發(fā)育樹中BVs值低于90%和位于90%～99%的分別有8個(gè)和5個(gè)，26個(gè)分支的BVs達(dá)到100%；而在CDS系統(tǒng)發(fā)育樹和matK系統(tǒng)發(fā)育樹中BVs值低于90%的分別有11個(gè)和30個(gè)，位于90%～99%的分別有10個(gè)和5個(gè)，CDS系統(tǒng)發(fā)育樹中有18個(gè)節(jié)點(diǎn)達(dá)到100%，matK系統(tǒng)發(fā)育樹中僅有4個(gè)節(jié)點(diǎn)達(dá)到100%?？傮w上，基于WCGS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分支的BVs高于CDS和matK基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中BVs最低的是基于matK構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

基于3種系統(tǒng)發(fā)育建樹結(jié)果，狹義木蘭科下的31個(gè)物種大致均與本屬的物種聚為一類，且均聚在木蘭亞科這一大分支內(nèi)，因此將木蘭亞科植物合并分析(圖2～圖4)。3種系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)分類明確的4個(gè)屬在屬間和種間分類時(shí)與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，差異僅為分支的BVs值。其中鵝掌楸屬與木蘭亞科植物聚為一個(gè)分支，顯示較近的親緣關(guān)系；五味子屬與南五味子屬植物聚為一個(gè)亞類，八角屬植物自成一類。對(duì)比3種建樹方法發(fā)現(xiàn)對(duì)分類明確的10個(gè)物種，其9個(gè)節(jié)點(diǎn)BVs均較高[圖1(b)]。其中WCGS系統(tǒng)發(fā)育樹有8個(gè)節(jié)點(diǎn)BVs達(dá)到100%，僅1個(gè)節(jié)點(diǎn)為87%(圖2)；CDS系統(tǒng)發(fā)育樹中6個(gè)節(jié)點(diǎn)BVs達(dá)到100%，位于90%～100%和低于90%的節(jié)點(diǎn)分別有2個(gè)和1個(gè)；在matK系統(tǒng)發(fā)育樹中僅有4個(gè)節(jié)點(diǎn)BVs達(dá)到100%，位于90%～100%和低于90%的節(jié)點(diǎn)分別有2個(gè)和3個(gè)。

(a)41個(gè)物種39個(gè)節(jié)點(diǎn)的BVs比較；(b)4個(gè)明確分類的屬的9個(gè)節(jié)點(diǎn)BVs比較。橫坐標(biāo)代表節(jié)點(diǎn)BVs，縱坐標(biāo)代表節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)。

圖2 基于木蘭科WCGS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于木蘭科41個(gè)物種共有CDS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于matK基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 基于WCGS系統(tǒng)發(fā)育分析

相較于其他兩種方法，WCGS建樹法的BVs值更高，為闡釋木蘭亞科植物間的親緣關(guān)系，對(duì)WCGS系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步分析(圖5)。基于WCGS系統(tǒng)發(fā)育樹可將31個(gè)木蘭亞科的物種大致分為7個(gè)分支，分別是玉蘭屬、華蓋木屬/擬單性木蘭屬、含笑屬、煥鏞木屬、木蘭屬、木蓮屬和喙木蘭屬。其中喙木蘭屬(馨香木蘭)構(gòu)成了遠(yuǎn)離木蘭亞科其他物種的一個(gè)獨(dú)立分支。木蘭屬下的柳葉木蘭與玉蘭屬的物種構(gòu)成一個(gè)分支；華蓋木屬下的華蓋木和擬單性木蘭屬下的云南擬單性木蘭聚成一個(gè)獨(dú)立的分支，與玉蘭屬構(gòu)成姐妹群；長蕊木蘭和紅花木蓮聚在含笑屬內(nèi)；煥鏞木獨(dú)立構(gòu)成一支；木蘭屬與木蓮屬組成姐妹類群，荷花玉蘭、三瓣木蘭、厚樸、西康天女花和天女花聚在木蓮屬內(nèi)，其中荷花玉蘭為木蓮屬中較遠(yuǎn)的一個(gè)分支；馨香木蘭成為木蘭亞科中與其他物種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的一個(gè)獨(dú)立分支；除南五味子下的兩個(gè)物種外，其余廣義木蘭科下的物種均以100%的BVs將各屬下物種分別聚在一起。

圖5 基于WCGS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

有關(guān)木蘭科植物的分類研究歷經(jīng)多次整理與修正[24-28]，但除鵝掌楸屬外，木蘭科其他屬的劃分仍存在很大分歧[20]，尤其是對(duì)木蘭亞科下的一些單種屬和寡種屬系統(tǒng)分類。究其原因，主要是研究者對(duì)木蘭科的分類研究多基于形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和孢粉學(xué)結(jié)果，缺少分子層面的證據(jù)支撐。本研究從cpDNA分子層面對(duì)木蘭科的物種進(jìn)行了分類探究，系統(tǒng)闡明了41個(gè)物種的親緣關(guān)系。木蘭科種、屬界限的明確將為木蘭科瀕危植物的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，掌握木蘭科物種的親緣關(guān)系，是木蘭科植物種質(zhì)資源創(chuàng)新、指導(dǎo)引種的關(guān)鍵，有助于木蘭科植物的保護(hù)與開發(fā)。此外，本研究證實(shí)了基于葉綠體基因組信息對(duì)木蘭科植物進(jìn)行劃分的可靠性，可基于葉綠體基因序列開發(fā)指紋標(biāo)簽，應(yīng)用于木蘭科植物的資源篩選、鑒定及保護(hù)。

此外，3種分類方法均顯示木蘭亞科與鵝掌楸屬親緣關(guān)系相近，五味子科與八角科植物構(gòu)成兩個(gè)親緣關(guān)系較近的姊妹類群，支持形態(tài)學(xué)上對(duì)廣義木蘭科的分類[29]?；赪CGS聚類結(jié)果，在木蘭亞科中，玉蘭屬即為木蘭屬玉蘭亞屬，柳葉木蘭、白玉蘭和紫玉蘭等被聚在玉蘭屬之中，趙晶華等[30]通過對(duì)atpB和rbcL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析也證明白玉蘭與玉蘭屬的親緣關(guān)系較近；華蓋木為極其瀕危的單種屬植物[31]，被認(rèn)為是木蘭科最原始的植物，傳統(tǒng)分類學(xué)認(rèn)為其與木蓮屬關(guān)系較近[32]，然而本研究發(fā)現(xiàn)華蓋木與云南擬單性木蘭(云南擬單性木蘭屬)歸為一類，顯示二者具有較近的親緣關(guān)系，而與木蓮屬植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，司馬永康等[7]系統(tǒng)觀察了木蘭科植物的幼葉卷疊，也將華蓋木屬和擬單性木蘭屬歸為一類；煥鏞木是我國的特有單屬種[33]，在系統(tǒng)發(fā)育樹中單獨(dú)呈現(xiàn)一個(gè)獨(dú)立的分支，表明了其單屬種特性；木蓮屬與木蘭屬構(gòu)成了關(guān)系密切的姊妹類群，而木蓮屬下的兩個(gè)姊妹分支分別由木蘭屬和木蓮屬組成，相對(duì)木蘭屬而言，木蓮屬是較為原始的類群[34]；而紅花木蓮是木蓮屬較為原始的物種，與含笑屬聚為一類，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果不一致。孟愛平等[35]通過核型分析發(fā)現(xiàn)木蓮屬幾個(gè)物種的染色體存在一定的差異，推測部分木蓮屬的植物在進(jìn)化過程中與含笑屬植物經(jīng)歷過胞質(zhì)基因組的交流，或者非人為干預(yù)情況下，生活在同一環(huán)境下的不同物種，長期的自然選擇可能會(huì)出現(xiàn)趨同進(jìn)化的現(xiàn)象，地域分布比較近則普遍親緣關(guān)系比較近，地域分布較遠(yuǎn)的物種則可能出現(xiàn)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象在研究者對(duì)云南分布的木蘭科植物的系統(tǒng)進(jìn)化分析中得到證實(shí)[23]。

本研究證實(shí)3種聚類方法對(duì)分類明確的廣義木蘭科的聚類結(jié)果一致，支持傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果。其中WCGS系統(tǒng)發(fā)育樹自展支持率最高，更適合用于揭示物種的進(jìn)化演變過程。WCGS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)鵝掌楸屬與木蘭亞科植物親緣關(guān)系更為緊密；瀕危單種屬物種華蓋木與云南擬單性木蘭親緣關(guān)系緊密；而馨香木蘭構(gòu)成了遠(yuǎn)離木蘭亞科其他物種的一個(gè)獨(dú)立分支，顯示與其他木蘭亞科物種相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。本研究明確了適用于科屬間的系統(tǒng)發(fā)育分析方法，在葉綠體DNA分子層面構(gòu)建了木蘭科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為該科物種的精準(zhǔn)鑒定、種質(zhì)資源開發(fā)、瀕危物種引種保護(hù)等提供科學(xué)依據(jù)。