韋鳳娟，龔一富，章 麗，陳榮實，王何瑜，楊冰迪

(1.寧波大學 海洋學院，寧波 315832；2.寧波大學 食品與藥學學院，寧波 315832)

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中含有巖藻黃素(Fucoxanthin)等光輔助合成色素，是生產高品質巖藻黃素的潛在資源[1]。巖藻黃素具有抗癌、抗炎、減肥、抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)血糖、提高免疫力等多種生物學功能[2-7]。但巖藻黃素產量低，市場對巖藻黃素需求較大，如何提高巖藻黃素產量是目前國內外研究者的關注焦點。前人使用硫酸鈰銨、乙酰水楊酸、花生四烯酸、光質等不同誘導子和培養(yǎng)條件提高三角褐指藻巖藻黃素含量[8-11]，但要實現(xiàn)巖藻黃素的商業(yè)化生產，還需要篩選更多提高巖藻黃素含量的誘導子。

雷帕霉素(Rapamycin，RPM)是從復活節(jié)島的土壤吸濕鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中分離的一種免疫抑制性大環(huán)內酯類抗生素[12]。雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)可使40S核糖體蛋白S6激酶(S6K)磷酸化，并通過調節(jié)不敏感的油菜素類固醇-2(BR INSENSITIVE 2)促進葉綠體的產生和幼苗生長[13]。過表達擬南芥(Arabidopsisthaliana)TOR有利于促進生長[14]。RPM可使牡丹(Paeoniasuffruticosa)衰老延遲、切花保鮮期延長[15]。在藻類次生代謝調節(jié)的研究中，RPM促進萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)甘油三酯(triacylglycerol，TAG)含量積累[16-17]，目前RPM對三角褐指藻次生代謝產物含量影響及機理的研究尚未見報道，本實驗研究RPM對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響，將擴大RPM在藻類次生代謝調控方面的應用。

巖藻黃素合成途徑已基本清楚，八氫番茄紅素脫氫酶基因(pds)和番茄紅素β-環(huán)化酶基因(lcyb)是巖藻黃素生物合成下游途徑中的關鍵酶，其基因表達與巖藻黃素合成息息相關[9-11]，且pds和lcyb基因對巖藻黃素積累貢獻率最高[9]。前人研究還表明，巖藻黃素含量與光合作用相關[11,18]，光系統(tǒng)II蛋白D1基因(psbA)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亞基基因(rbcL)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因(rbcS)是參與光系統(tǒng)II、決定碳同化速率和植物光呼吸的關鍵酶，光合抑制劑(DCMU)抑制psbA和rbcL基因的表達，通過抑制光合作用效率從而抑制巖藻黃素的積累[18]。水楊酸處理大豆后rbcS基因表達上升[19]，巖藻黃素在植物體內與葉綠素a集合形成蛋白復合體(FCP)參與光合作用[20]。但RPM是否通過合成途徑相關酶基因表達調控巖藻黃素的合成，或光合作用相關酶基因表達調控，又或二者共同參與，均未見相關報道。因此，實驗通過RPM對三角褐指藻巖藻黃素含量變化影響，以及對巖藻黃素生物合成基因pds、lcyb和光合作用相關基因psbA、rbcL、rbcS、fcpb表達數(shù)據(jù)分析，為研究RPM對植物次生代謝產物調控提供前期基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料

三角褐指藻藻種由寧波大學海洋學院藻類實驗室培養(yǎng)提供，藻液體培養(yǎng)基由天然海水過濾高溫滅菌，加入1∶1 000比例滅菌MAV母液[21]備用，藻固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎上加1.2%的瓊脂滅菌備用。藻種在固體培養(yǎng)基純化后加入液體培養(yǎng)基擴繁。

1.2 方法

1.2.1 三角褐指藻的培養(yǎng)及RPM濃度設置

天然海水過濾后高溫滅菌，添加1∶1 000滅菌MAV母液制備三角褐指藻培養(yǎng)基，以1∶10比例接入無菌原藻液擴繁培養(yǎng)，藻液置于20 ℃± 1 ℃，12 h/12 h(黑暗/光照)62.5 μmol photons/(m2·s)培養(yǎng)7 d至對數(shù)生長期。RPM(上海阿拉丁生化試劑有限公司)溶于無菌水，微量乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)助溶。0、2.5、5、7.5和10 mmol/L 5個水平的RPM質量濃度，加入三角褐指藻藻液中，共3個生物學重復。

1.2.2 三角褐指藻生長曲線測定

三角褐指藻標準生長曲線參考徐潤潔等[11]測定方法。藻液加入RPM后每間隔24 h定時取藻液用紫外分光光度計(UV-5200，上海元析儀器有限公司)測定藻液OD680數(shù)值，3個生物學重復。根據(jù)標準生長曲線公式換算各RPM處理組藻細胞數(shù)作生長曲線。

1.2.3 三角褐指藻葉綠素a含量測定

量取平臺末期藻液30 mL，在4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄上清液，藻泥用蒸餾水2次洗滌，1 mL無水乙醇混勻藻泥，避光靜置24 h，測量靜提液A649、A665處吸光值，計算葉綠素a含量[22]。

Chl a(mg/L)=13.95 ×A665-6.88 ×A649

(1)

1.2.4 巖藻黃素含量的測定

收集各RPM組藻細胞，提取巖藻黃素和測定含量[23-24]，3個生物學重復。量取90 mL藻液，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，棄上清液，藻泥-80℃凍存10 h，冷凍干燥48 h，凍干藻泥稱重研磨成粉末，約0.1 g。加入1 mL無水乙醇充分混勻，60 ℃避光浸提1 h，2次。4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，取上清液，測定提取液A445，計算巖藻黃素含量。

巖藻黃素含量(mg/g DW)=

(2)

1.2.5 RT-QPCR測定巖藻黃素生物合成及光合作用相關基因表達分析

RPM處理對數(shù)生長期三角褐指藻24 h，量取藻液90 mL在4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，棄上清液，總RNA提取按Plant RNA Kit試劑盒說明書，總RNA反轉錄cDNA使用Takara Prime Script RT Reagent Kit試劑盒。

三角褐指藻巖藻黃素生物合成代謝通路相關核心序列和轉錄組測序結果從NCBI下載[9]，選出巖藻黃素合成關鍵酶基因pds和lcyb序列，光合作用相關基因psbA、rbcL、rbcS和fcpb序列。引物設計應用Primer Primer 5.0軟件(表1)，上海生工生物工程公司合成，模板cDNA為RPM處理組cDNA。SYBR 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、超純水6.4 μL、模板2 μL，共20 μL為PCR反應體系。程序在Mastercycler ep realplex實時熒光定量PCR儀(Eppendorf，German)進行，擴增反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；蛳鄬Ρ磉_量數(shù)據(jù)以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCT法[25]計算得出。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Mircosoft Excel 2019對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、Origin 7.0作圖，采用SPSS22.0進行顯著性分析。將RPM處理三角褐指藻巖藻黃素生物合成及光合作用相關的6個基因和葉綠素a含量作為指標，與巖藻黃素含量作相關性分析和主成分分析(PCA)。對數(shù)據(jù)進行標準化處理，提取主成分的特征值/方差，然后提取每個變量的特征值，繪制變量和相關曲線。通過PCA分析，找到對主成分重要的變量，消除嘈雜的數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 不同濃度RPM對三角褐指藻藻細胞生長的影響

RPM對三角褐指藻細胞生長變化結果表明(圖1)，RPM處理后1～2 d藻細胞數(shù)增長速率均比對照組(0 mmol/L)快，第3天藻細胞數(shù)總體下降，第4～5天藻細胞數(shù)保持上升，其中5 mmol/L RPM處理組藻細胞數(shù)增加得最多。

圖1 RPM對三角褐指藻細胞生長的影響

2.2 RPM對三角褐指藻葉綠素a含量的影響

RPM對三角褐指藻葉綠素a含量變化結果表明(圖2)，7.5 mmol/L RPM處理組的三角褐指藻葉綠素a含量比對照組(0 mmol/L)高，表明7.5 mmol/L RPM可促進三角褐指藻光合作用及色素積累。其他濃度處理組的葉綠素a含量下降，2.5 mmol/L和10 mmol/L RPM對三角褐指藻葉綠素a抑制明顯(P<0.01)。

** 為P<0.01。

2.3 RPM對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響

RPM對三角褐指藻巖藻黃素含量的影響結果表明[圖3(a)]，RPM處理組三角褐指藻巖藻黃素含量均高于對照組(0 mmol/L)(P<0.01)，其中5 mmol/L和2.5 mmol/LRPM處理組的三角褐指藻巖藻黃素含量都提高了40%。RPM處理對單位藻細胞巖藻黃素含量的影響結果表明[圖3(b)]，RPM處理單位藻細胞巖藻黃素含量變化跟總巖藻黃素含量變化趨勢基本一致，2.5 mmol/L和5 mmol/L RPM處理組三角褐指藻巖藻黃素含量提高31%(P<0.01)，表明RPM處理對三角褐指藻巖藻黃素含量積累具有促進作用。

** 為P<0.01。

2.4 RPM對三角褐指藻巖藻黃素生物合成及光合作用相關基因表達影響

RT-qPCR研究結果表明(圖4)，RPM處理組巖藻黃素合成途徑貢獻率最高的基因是pds和lcyb，在7.5 mmol/L和10 mmol/L處理組pds的表達量均高于對照組(P<0.01)，5 mmol/L處理組pds表達量低于對照組。lcyb基因表達量在RPM處理組中均低于對照組。psbA、rbcL和rbcS3個光合作用相關基因在5 mmol/L RPM處理組表達均上調(P<0.01)，fcpb基因則在7.5 mmol/L和10 mmol/L處理組表達上調(P<0.01)，即RPM可促進合成途徑基因pds及光合基因psbA、rbcL、rbcS和fcpb轉錄表達。RPM處理組基因轉錄表達與巖藻黃素含量結果趨勢稍有差異，說明巖藻黃素合成途徑相關基因和光合作用相關基因共同參與巖藻黃素生物合成。

** 為P<0.01。

2.5 三角褐指藻巖藻黃素含量積累因子的主成分分析

主成分分析結果表明(表2)，PC1、PC2和PC3的累計貢獻率達91.9%。相關性分析表明(圖5)，前3個主成分均包含有rbcS、psbA和rbcL基因，均是光合作用相關基因，而巖藻黃素合成基因對巖藻黃素積累貢獻率不高，說明光合作用rbcS、psbA和rbcL基因轉錄是影響三角褐指藻巖藻黃素積累的最重要因子。

表2 8個主成分的貢獻率和累積貢獻率

圖5 巖藻黃素生物合成基因、光合作用相關基因與其含量的主成分分析

3 討論與結論

施加誘導劑處理藻類，藻類育種、生長形態(tài)和生物量的積累有一定改變，RPM在調節(jié)代謝、翻譯和轉錄中具有關鍵作用，通過下游靶標TOR的磷酸化控制細胞增殖、發(fā)育和生長[26-27]，RPM復合物可調控營養(yǎng)物質、光和能量而促進植物生長[28-29]。研究結果表明，RPM處理三角褐指藻前期促進藻細胞生長，后期抑制藻細胞生長。7.5 mmol/L RPM促進葉綠素a含量，葉綠素a主要參與光合作用，在光合植物中將光能傳遞給光合電子傳遞鏈(PETC)并在其上轉化為化學能，植物細胞感光強度和PETC工作速率取決于受鹽度、pH值、溫度和營養(yǎng)成分等影響的細胞代謝環(huán)境[30]，故植物受到外界因子刺激伴隨一系列反應促進光合作用。光合系統(tǒng)能量過剩時，激發(fā)態(tài)葉綠素a將能量傳遞給其他分子轉化為熱量[31]，葉綠素a含量消耗，可能是光合系統(tǒng)葉綠素a含量下降原因之一。RPM處理組三角褐指藻巖藻黃素含量和單位藻細胞巖藻黃素含量均上升(P<0.01)，5 mmol/L RPM處理組含量上升最高。光合作用輔助色素中類胡蘿卜素在植物類囊體中捕獲光照和傳遞能量，巖藻黃素與葉綠素a結合形成巖藻黃素-葉綠素蛋白復合體(FCP)作為主要類胡蘿卜素參與光合作用[20]，在植物內起到快速的光保護作用，消耗過剩能量[31]。葉綠素a消耗促進光合作用可能是促進巖藻黃素含量上升因素之一。

研究中巖藻黃素生物合成基因pds和lcyb，光合作用相關基因psbA、rbcL、rbcS和fcpb的表達水平與巖藻黃素含量存在正相關性，rbcS對巖藻黃素合成促進作用明顯。賀超英等[19]發(fā)現(xiàn)大豆中rbcS基因表達量在NaCl和水楊酸處理24 h后出現(xiàn)高峰。植物中促進rbcS基因的表達具有明顯的葉組織特異性和光誘導特異性[32]，可提高植物光合效率[33]。DCMU處理三角褐指藻，藻細胞巖藻黃素含量結果[18]與實驗結果一致，證明光合作用對巖藻黃素積累具有促進作用。光合作用是植物生產物質量的基礎條件，rbcL和rbcS作為Rubisco酶亞基基因可調節(jié)酶活直接影響大豆光合效率[34]，據(jù)基因轉錄水平推測rbcL和rbcS通過提高藻光合效率促進巖藻黃素含量上升目的；psbA是psⅡ光反應中心D1(32 ku)蛋白的基因，D1蛋白作為psⅡ電子受體參與光誘導的電子傳遞[35]，D1蛋白和Rubisco酶在電子傳遞鏈上下游，5 mmol/L RPM處理下藻細胞增量最多，說明電子傳遞速率高，psbA基因表達水平上調，其他處理組未顯著變化，推測高濃度RPM可能會阻斷電子鏈傳遞；在褐藻中主要收集光的葉黃素是巖藻聚糖，巖藻聚糖復合物包含約相同量的巖藻黃素和葉綠素，高濃度RPM處理組fcpb轉錄水平出現(xiàn)上調表明在電子傳遞鏈受阻到一定臨界時，藻內環(huán)境可能會自我調節(jié)，適應外界環(huán)境脅迫，呈現(xiàn)負反饋調節(jié)。合成巖藻黃素后兩步的催化反應與光照條件有關[36]，這也說明光照、光合作用都影響巖藻黃素的積累。徐潤潔等[11]的實驗結果也驗證了這一點。巖藻黃素合成途徑貢獻率最高的pds和lcyb表達水平未隨著RPM濃度呈線性關系，從另一角度說明巖藻黃素合成過程并不僅僅只有生物合成關鍵酶基因參與了，光合作用也扮演著重要角色。在RPM處理下的藻細胞如何通過自我調節(jié)完成巖藻黃素生物量積累過程，還有待探索和研究。