辛忠昊，郭效珍，逯曉寒，焦安琪，劉麗萍，于 江，黃 兵，孫淑紅，吳家強(qiáng),

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250000;3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250000)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員[1]，可引起新生仔豬的急性腹瀉、嘔吐、脫水及高死亡率[2]。該病于1971年首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)，被命名為病毒流行性腹瀉(epidemic viral diarrhea,EVD)，EVD-2型病毒株CV777被命名為PEDV[3]，1980年我國(guó)首次分離到PEDV[4]，但并未造成大規(guī)模流行及經(jīng)濟(jì)損失。2010年末中國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)了對(duì)仔豬具有較高毒力的PEDV變異株[5]，并迅速蔓延至國(guó)內(nèi)大部分豬場(chǎng)。該病毒對(duì)各階段的豬均可感染[6]，1周齡以下的哺乳仔豬感染后的病死率最高可達(dá)100%[7]，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。

本研究收集了2020—2021年山東省疑似感染PEDV的臨床病料，通過RT-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、IFA、測(cè)序等方法進(jìn)行病毒分離鑒定，并應(yīng)用數(shù)據(jù)分析軟件MEGA 7.0和DNA star將測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI的參考序列進(jìn)行分析對(duì)比和遺傳進(jìn)化分析，以期為我國(guó)PEDV的防控及疫苗研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源及處理

兩份臨床陽性病料來自山東某腹瀉豬場(chǎng)，取其中一份10日齡腹瀉仔豬小腸組織進(jìn)行研磨稀釋，進(jìn)行后續(xù)分離鑒定。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自BioFlux；One step RT-PCR試劑、DL2000 marker、DL5000 marker購(gòu)自TaKaRa公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自BI公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自gibco公司；TPB購(gòu)自Solarbio公司；鼠源抗PEDV-S蛋白單克隆抗體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何啟蓋教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗購(gòu)自ABclonal公司。

1.3 細(xì)胞及載體

Vero 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)保存、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18T Easyvector購(gòu)自寶生物工程有限公司。

1.4 病料核酸的提取和RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)BioFlux核酸提取試劑盒說明書提取各樣品RNA，隨后RT-PCR擴(kuò)增PEDV較保守的N基因。擴(kuò)增程序如下：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

1.5 病毒分離

待小細(xì)胞瓶中的Vero細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右，將電泳鑒定為陽性病料的組織研磨液凍融3次后10 000 r/min離心，過濾上清液，取濾液500 μL與500 μL維持液(含10 μL胰酶和1%雙抗)混合均勻。然后用DMEM洗滌細(xì)胞3次。將上述處理好的接毒液接種于小細(xì)胞瓶，同時(shí)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照，一同置于37 ℃、5%CO2溫箱中，孵育1 h后補(bǔ)液至5 mL。48 h左右觀察到有明顯病變后收毒。按照此方法，每次收取病毒液后凍融3次，傳至第10代后收毒提取RNA用RT-PCR擴(kuò)增鑒定。

1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)

200 μL PEDV病毒液接種于Vero細(xì)胞密度為80%左右的24孔板，24～32 h后觀察出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)棄去維持液，每孔用PBS洗滌3次，隨后用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌3次，用4 ℃預(yù)冷的冰甲醇透化10 min，PBS洗滌3次。再用BSA液封閉30 min，最后加入比例稀釋好的抗S蛋白單克隆抗體，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次。再加入同樣稀釋好的二抗(HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG)孵育30 min，PBS洗滌3次后置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.7 PEDV分離株的全基因組擴(kuò)增及測(cè)序

參考PEDV AJ1102株設(shè)計(jì)該毒株的基因組全長(zhǎng)引物，共19段，各段引物序列見表1。用設(shè)計(jì)的19段引物分段擴(kuò)增全基因組。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，然后將回收產(chǎn)物分段連接于pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化至Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑菌PCR鑒定為陽性送至公司測(cè)序。

表1 引物序列

1.8 分離株的全基因組及S基因序列對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用DNA star軟件將分離毒株的全基因組和S基因測(cè)序結(jié)果與NCBI參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)，對(duì)分離株的核苷酸、氨基酸變異程度進(jìn)行分析并應(yīng)用PROVEAN(provean.jcvi.org)對(duì)分離毒株S蛋白中的氨基酸突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹觀察該毒株的遺傳演化情況及分析氨基酸突變對(duì)毒株產(chǎn)生的影響，毒株參考序列見表2。

表2 PEDV參考毒株及序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病料檢測(cè)

使用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的PEDV-N引物對(duì)送檢樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 326 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度一致(圖1)。

M：DL10000 DNA Marker；1：分離株N蛋白基因。

2.2 毒株的分離鑒定

將送檢的小腸組織上清液接種于Vero細(xì)胞，48 h后收毒。按照此步驟盲傳3代后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞瓶中出現(xiàn)輕微的病變，收毒后繼續(xù)接毒傳代培養(yǎng)至第10代，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變顯著(圖2)。將第10代病毒液進(jìn)行RT-PCR鑒定結(jié)果為陽性，同時(shí)將第10代細(xì)胞毒進(jìn)行IFA鑒定，利用抗S蛋白的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為陽性。證明成功分離到一株P(guān)EDV，將其命名為QH-202105株。

(a)陰性對(duì)照；(b)分離株第10代病毒引起的病變；(c)IFA綠色熒光；(d)DAPI；(e)Merge。放大倍數(shù)為100倍。

2.3 PEDV分離毒株的全基因組擴(kuò)增、測(cè)序拼接

通過RT-PCR對(duì)分離株QH-202105的分段擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出全基因組各片段，各片段大小符合預(yù)期。將擴(kuò)增的全部片段送至擎科生物公司測(cè)序，利用Seqman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到完整的QH-202105全基因組序列。

2.4 全基因組序列的遺傳發(fā)育樹分析

應(yīng)用MEGA7.0對(duì)分離株QH-202105和NCBI中國(guó)內(nèi)外21株P(guān)EDV參考毒株進(jìn)行對(duì)比和遺傳發(fā)育樹構(gòu)建(圖3)以分析其遺傳變異情況，遺傳發(fā)育樹采用Neighbor-joining方法進(jìn)行繪制，并進(jìn)行1 000次Bootstrap舉例計(jì)算。結(jié)果顯示，22株P(guān)EDV序列主要形成G1、G2兩個(gè)基因群，本研究分離株屬于G2基因群，與G1基因群中經(jīng)典毒株CV777屬不同分支，與G2基因群中變異株AJ1102親緣關(guān)系較近。

▲分析代表本研究分離毒株。

2.5 全基因組核苷酸的同源性分析

通過MegAlign軟件對(duì)分離株QH-202105同國(guó)內(nèi)外21株P(guān)EDV參考序列全基因組進(jìn)行核苷酸同源性對(duì)比，結(jié)果顯示QH-202105與美國(guó)分離株USA/Colorado/2013核苷酸同源性最高，為99.1%，與CHM2013同源性最低，為96.5%。與AJ1102變異株同源性較高，為98.2%，與經(jīng)典毒株CV777的同源性較低，為96.6%(圖4)。

圖4 QH-202105和參考毒株全基因組的核苷酸比對(duì)

2.6 S基因序列的遺傳進(jìn)化樹分析

S基因遺傳進(jìn)化樹繪制及算法同全基因組。結(jié)果顯示，所有毒株分為兩大基因群，分別是G1和G2，又將兩個(gè)群分為a和b兩個(gè)亞群，與參考毒株不同分支表明S基因存在變異，見圖5。本研究的毒株屬于G2b亞群，與毒株KM609213.1的親緣關(guān)系最近，與經(jīng)典毒株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于變異株。

●表示本研究分離毒株。

2.7 S基因序列核苷酸的同源性分析

本研究中分離株QH-202105的S基因全長(zhǎng)為4 161 bp，利用與全基因組序列相同的核苷酸比對(duì)方法將分離株同31株國(guó)內(nèi)外流行毒株用MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果表明本研究的分離株S基因與毒株KM887144.1同源性最低，同源性為93.6%，和經(jīng)典毒株CV777同源性為93.9%，親緣關(guān)系較低，與毒株KM609213.1親緣關(guān)系最近，同源性為99.0%，與中國(guó)毒株AJ1102同源性為97.5%(圖6)。

●為分離毒株。

2.8 S基因的氨基酸序列分析

分離株S基因的總長(zhǎng)為4 161 bp，編碼1 387個(gè)氨基酸。進(jìn)一步同USA lowa107 2013、AJ1102、CHM2013、CV777、DR13、OH851等參考毒株進(jìn)行氨基酸序列變異分析，結(jié)果顯示，分離株QH-202105在S基因的N端有60多處突變，兩處氨基酸插入(包括第59～62位氨基酸的QGVN 4個(gè)氨基酸插入，第145位氨基酸N的插入)和兩處氨基酸缺失(第115～118氨基酸的缺失，第167～168氨基酸的缺失)，以及只有分離株在第32位氨基酸處的突變(F→L)、第143處(N→D)、第235處(P→L)、第239處(N→D)，見圖7。此外，進(jìn)一步與變異毒株AJ1102進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該分離株在S蛋白的其中一個(gè)關(guān)鍵抗原中和表位區(qū)(aa 499～638)，發(fā)現(xiàn)3處氨基酸的突變，第505處(T→I)、第514處(N→I)、第526處(A→S)，見圖8。PROVEAN預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，與G2基因群中經(jīng)典的變異毒株AJ1102進(jìn)行S蛋白氨基酸比對(duì)，QH-202105毒株在1 361處氨基酸由G突變?yōu)镃，此處的突變被判定為“Deleterious”(圖9)。

圖7 S蛋白基因的氨基酸序列變異

圖8 S蛋白抗原中和表位區(qū)氨基酸的突變

圖9 QH-202105的氨基酸突變對(duì)其毒株功能的影響

3 討論

1973年P(guān)ED首次在中國(guó)暴發(fā)[9]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)甚至公共衛(wèi)生事業(yè)造成嚴(yán)重的威脅[10]。中國(guó)成功分離出PEDV后[11]，經(jīng)典的CV777毒株被制成滅活疫苗，PEDV得到了一定的控制[12]。但自2010年以來，中國(guó)多省份開始暴發(fā)PED[13]，即使是接種過CV777疫苗的豬場(chǎng)也在所難免，這與PEDV的變異有著重要關(guān)系[7]。

PEDV目前只有一個(gè)血清型，由于在S基因編碼的氨基酸N端的不同，PEDV被分為兩大基因群，G1群(G1a、G1b)和G2群(G2a、G2b)，2010年之前，亞洲和歐洲絕大多數(shù)的PEDV都屬于G1a亞群[14]。2010年之后，G2b亞群開始在美國(guó)、加拿大和南美洲傳播[15]，開始與經(jīng)典PEDV毒株共存，通過構(gòu)建S基因進(jìn)化樹顯示我們分離的毒株屬于G2b亞群。已知S蛋白是介導(dǎo)病毒進(jìn)入并在自然宿主中誘導(dǎo)中和抗體，S1亞單位是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，可與靶細(xì)胞受體結(jié)合[16]，它對(duì)細(xì)胞膜融合和病毒進(jìn)入非常重要，是中和抗體的抗原靶點(diǎn)[17]。S0也稱為N末端區(qū)域，是豬流行性腹瀉病毒的功能性受體。PEDV使用N末端區(qū)域作為細(xì)胞進(jìn)入的主要受體[18]，這是幫助病毒侵入細(xì)胞的第一個(gè)重要步驟[16]。

任何氨基酸突變都可以改變冠狀病毒的毒力[19]，將本研究毒株S基因與31株S基因的參考序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，QH-202105存在大量氨基酸突變、插入或缺失。以USA lowa107 2013、CHM2013、CV777、DR13、OH851等經(jīng)典毒株為參考，將該毒株的蛋白功能區(qū)序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在59～62位氨基酸的QGVN 4個(gè)氨基酸插入，第145位氨基酸N的插入，這些氨基酸的插入可能會(huì)導(dǎo)致當(dāng)前疫苗和藥物效力的下降，這也解釋了為什么CV777疫苗不能對(duì)仔豬產(chǎn)生足夠的保護(hù)作用。此外，通過氨基酸的同源性分析發(fā)現(xiàn)本研究的分離毒株與同為變異毒株AJ1102有密切關(guān)系，在第32位氨基酸處的突變(F→L)、第143處(N→D)、第235處(P→L)、第239處(N→D)。更值得注意的是，QH-202105的S蛋白1 361處的氨基酸突變(G→C)被判定為“Deleterious”時(shí)，可以推測(cè)，本研究的分離毒株出現(xiàn)了類似于“細(xì)胞自噬”的現(xiàn)象以適應(yīng)當(dāng)前地區(qū)的環(huán)境和條件，從而使病毒本身向著有利于自身生存的方向出發(fā)，這可能會(huì)間接影響QH-202105毒株的侵襲力及毒力。另外，現(xiàn)已證實(shí)S蛋白表面的中和表位有4個(gè)(aa 499～638、748～755、764～771、1368～1374)，本研究分離株的S蛋白在aa 499～638處產(chǎn)生多處氨基酸突變，這對(duì)病毒的抗原性和毒力可能會(huì)產(chǎn)生重要影響。有研究進(jìn)一步支持了我們的假設(shè)，該研究表明S基因中和表位區(qū)域的突變導(dǎo)致疫苗接種效率低下[20]。研究表明，S蛋白、N蛋白和輔助ORF3蛋白在調(diào)節(jié)PEDV毒株的毒力方面也起著重要作用，可通過逃避宿主免疫機(jī)制而造成嚴(yán)重?fù)p害[21]，輔助蛋白ORF3被鑒定為一種離子通道，具有多種調(diào)節(jié)功能[22]，ORF3蛋白可以與S蛋白一起在病毒復(fù)制步驟組裝PEDV。ORF3蛋白也通過其在病毒產(chǎn)生中的調(diào)節(jié)過程與PEDV的毒力相關(guān)，總之，ORF3蛋白是PEDV致病性和分子流行病學(xué)研究的重要毒力基因[23]。因此，S蛋白和ORF3蛋白中的氨基酸替換可能有助于QH-202105毒株逃避宿主免疫系統(tǒng)，并可能使其病毒的毒力和抗原性發(fā)生改變。

通過對(duì)分離毒株的核苷酸同源性分析和遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，參考毒株與QH-202105的同源性較低，這可能提示我們當(dāng)下PEDV流行毒株不斷發(fā)生變異和進(jìn)化，進(jìn)而可能產(chǎn)生新的毒株。其中S基因的高變異趨勢(shì)可能增強(qiáng)病毒毒力和侵襲力，從而進(jìn)一步對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅，因此應(yīng)該密切關(guān)注PEDV的流行情況。