岳慧英，楊素萍，趙春貴

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，晉中 030619；2.華僑大學(xué) 生物工程與技術(shù)系，廈門 361021)

紫細菌的光合單元是由一系列定位在內(nèi)質(zhì)膜上的色素蛋白復(fù)合體(Pigment protein complex，PPC)所構(gòu)成，光合作用過程是外周捕光復(fù)合體(Light-harvesting complex 2，LH2，也稱 B800-850)吸收光能，再經(jīng)核心捕光復(fù)合體(LH1)傳遞到反應(yīng)中心(Reaction center，RC)完成光化學(xué)反應(yīng)[1]。紫細菌光合單元結(jié)構(gòu)簡單，是闡明光合作用機理的良好模型，但目前僅報道有3種紫細菌的LH2晶體結(jié)構(gòu)，分別是Rhodopseudomonasacidophila(2.0 ?)[2]、Phaeospirillummolischianum(2.4 ?)[3]和Ectothiorhodospirahaloalkaliphila(3.4 ?)[4]。相對紫細菌物種數(shù)量而言，LH2結(jié)構(gòu)學(xué)的報道只是冰山一角，遠不如RC研究深入，這可能與不同紫細菌LH2的多樣性有關(guān)，例如編碼LH2蛋白基因(pucBA)序列和拷貝數(shù)的多樣性、類胡蘿卜素組成的多樣性，這增加了結(jié)構(gòu)均一的LH2純化和結(jié)晶難度。目前，有關(guān)LH2分離純化、光譜特征、色素組成、能量傳遞效率、穩(wěn)定性、環(huán)境適應(yīng)性機制等研究報道較多[5-7]，尤其闡明了異常光譜LH2(例如LH3和LH4)形成機制和環(huán)境調(diào)控機制，紫細菌為更好適應(yīng)生存環(huán)境，往往通過合成不同光譜類型的LH2來調(diào)控其光合生長，即使是同一菌株，其LH2的合成受環(huán)境因素調(diào)控也表現(xiàn)出不同的光譜類型和能量傳遞活性[6]。

研究LH2的結(jié)構(gòu)、功能和性質(zhì)，首先要純化LH2。PPC是膜整合蛋白，因此LH2的制備首先使用去垢劑將其從內(nèi)質(zhì)膜上解離下來，然后再用鹽析、蔗糖密度梯度離心或差速離心等方法進行粗分離，離子交換層析法和分子篩細分離，但不同文獻使用的去垢劑種類、濃度和增溶時間、鹽析濃度、離子交換層析洗脫鹽度均存在差異，即使同一物種，其分離條件也不相同。引起這種差異的原因，至今尚不明確，這可能與不同菌種(株)中的LH2結(jié)構(gòu)特征不同有關(guān)。Brotosudarmo等[8]曾用分子篩方法比較了不同物種的LH2分子大小，但有關(guān)表面電荷、疏水性、與內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合能力等特征的比較研究未見報道。Rhodobacter(Rba.)和Rhodopseudomonas(Rps.)以及LDAO是LH2研究常用物種和去垢劑[9-11]，因此，本文選用Rba.azotoformansR7和Rps.palustrisCQV97菌株，研究比較了去垢劑LDAO增溶時間、鹽析濃度和NaCl洗脫梯度，對2種不同物種的2種不同類型LH2與內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合能力強弱、表面電荷及疏水性等特征。另外，CQV97 類胡蘿卜素(Car)構(gòu)象對LH2能量傳遞效率的影響未見報道，進一步探求了純化LH2吸收光譜、Car組分、構(gòu)象與能量傳遞效率之間的關(guān)系。研究為不同種屬LH2特征分析提供了一種方法，也有助于了解不同紫細菌LH2結(jié)構(gòu)信息及其環(huán)境適應(yīng)性機制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

紫外可見分光光度計(UV-3200，MAPADA)；高效液相色譜儀(CTO-20A，Shimadzu)；LC/MS(1200 series，Agilent Technology)；自動蛋白核酸純化儀(KTA purifier 100，GE Healthcare)；穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光儀(FLS920，Edinburgh)；共聚焦拉曼光譜儀(InVia，Renishow)；十二烷基二甲基氧化胺(LDAO，F(xiàn)luka)；DEAE-32(Whatman)；甲醇、丙酮和乙腈為色譜純試劑，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

Rps.palustrisCQV97菌株和Rba.azotoformansR7菌株，GenBank登錄號分別為EU882154和EU604757。按照文獻[6,11]方法配置培養(yǎng)基，于30 ℃、3 000 lx光照厭氧靜置培養(yǎng), 對數(shù)后期收獲菌體。

1.3 LH2的制備

LH2的制備采用硫酸銨分級分離結(jié)合DEAE-32陰離子交換層析法[12]。在KTA蛋白核酸純化儀上進行分子篩層析，層析柱為Sephacryl S-200(2.6 cm×125 cm，GE Healthcare)，以pH 8.0 TL(10 mmol/L Tris-HCl，體積分數(shù)為0.1%，LDAO)緩沖液作為洗脫液，流速為0.5 mL/min，檢測波長為280、380 和480 nm。

1.4 SDS-PAGE

采用Bradford方法進行蛋白質(zhì)的定量。利用吸收光譜和SDS-PAGE進行LH2純度鑒定[12]。

1.5 Car色素組分分析

-80 ℃真空冷凍干燥L(fēng)H2，用丙酮∶甲醇(體積比為7∶2)抽提其中光合色素，離心收集上清液，殘余物繼續(xù)加入提取劑重復(fù)上述抽提過程，合并提取液，氮氣吹干，用色譜純甲醇溶解，膜過濾，用HPLC進行色素組分分析。

HPLC測定采用反向C18柱(Shim-pack VP-ODS, 150 mm×4.6 mm，Shimadzu)，柱溫25 ℃，流動相為甲醇∶乙腈水溶液(體積比為95∶5)，流速0.7 mL/min，DAD檢測器檢測范圍為190～800 nm，檢測波長為475 nm。LC/MS法測定分子量，LC條件：柱溫30 ℃，等度洗脫，流速0.8 mL/min。MS條件：采用正離子模式，毛細管電壓5 500 ev，干燥氣流速12 L/min，干燥氣溫度350 ℃，霧化器壓力207 kPa，掃描范圍200～1 200 m/z。

1.6 光譜測定

在TL緩沖液中，室溫測定樣品的吸收光譜、熒光光譜和共聚焦拉曼光譜，測定方法參照文獻[13]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化特征比較

兩種LH2分離純化條件比較結(jié)果見表1。破細胞壁后上清液用體積分數(shù)為1%的LDAO增溶，增溶使溶液濁度逐漸下降，280 nm蛋白特征峰顯現(xiàn)，各色素吸收峰逐漸增強，表明色素蛋白復(fù)合體(PPC)與內(nèi)質(zhì)膜分離。R7和CQV97破壁上清液分別增溶2 h和12 h，BChl Qy帶不再增強，表明R7中LH2(A-LH2)與內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合弱，而CQV97中LH2(P-LH2)和內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合較強。增溶上清液經(jīng)40%、60%和80%(mg/mL)硫酸銨分級分離，獲得3個鹽析組分，OD800測定結(jié)果顯示，R7中各鹽析組分分別約占PPC總量的29.7%、55.6%和14.7%，根據(jù)吸收光譜判斷A-LH2主要集中在40%～60%(mg/mL)鹽析組分中；CQV97中各鹽析組分分別占PPC總量的12.7%、26.7%和60.6%，P-LH2主要集中在60%～80%(mg/mL)鹽析組分中，表明兩種LH2的表面電荷和親水程度不同，A-LH2所帶電荷少和疏水性強，P-LH2所帶電荷較多且親水性強。分別針對上述兩個富含LH2的鹽析組分進行DEAE-32陰離子交換層析進一步分離純化，A-LH2集中在較高的NaCl洗脫梯度，表明其表面所帶負電荷數(shù)量較多。經(jīng)離子交換層析獲得的LH2進一步進行分子篩層析，結(jié)果見圖1，A-LH2和P-LH2的洗脫體積分別為37.15 和37.83 mL，較小的洗脫體積暗示了A-LH2復(fù)合物的分子半徑略大于P-LH2。

表1 兩種紫細菌中LH2的分離純化條件比較

圖1 A-LH2(a)和P-LH2(b)的分子篩層析

2.2 吸收光譜測定

兩種LH2的吸收光譜如圖2所示。A-LH2具有典型的376、590、798和848 nm BChla吸收峰，以及典型的455、488和512 nm Car吸收峰，與文獻[14]Rhodobacter屬中LH2的吸收光譜相似，A798/A848也在0.65±0.03范圍內(nèi)。P-LH2具有376、590、803和855 nm BChla吸收峰，以及典型的480、510和531 nm Car吸收峰，與文獻[6]Rhodopseudomonas屬中LH2的吸收光譜相似，A803/A855約為0.93。比較吸收光譜可以判斷兩種LH2的主要差異有：(1)P-LH2中Qy帶發(fā)生了5～7 nm紅移，A800/A850比值不同；(2)Car特征峰不同，在A-LH2中為球形烯系Car，在P-LH2中為螺菌黃質(zhì)系Car，Car組成需要進一步分析。

圖2 純化的A-LH2(a)和P-LH2(b)吸收光譜

2.3 SDS-PAGE

兩種純化LH2的SDS-PAGE，見圖3。結(jié)果表明：P-LH2具有兩條電泳條帶，分子質(zhì)量分別為6 ku和10 ku，對應(yīng)Rps.palustrisLH2中的α和β多肽[6]。A-LH2呈現(xiàn)1條電泳條帶，分子質(zhì)量約為6 ku，與文獻報道LH2分子質(zhì)量約為6 ku的LH2的α和β兩個亞基相對應(yīng)[15]。電泳圖譜中除了LH2的α和β多肽之外沒有多余蛋白條帶出現(xiàn)，表明兩種LH2都達到了電泳純。

L1: A-LH2；L2: P-LH2；L3: Marker。

2.4 Car色素組分分析

A-LH2和P-LH2中色素提取液的HPLC洗脫曲線如圖4所示，A-LH2主要含有1個Car組分，H1；P-LH2主要含有4個Car組分，H2-H5。依據(jù)二極管陣列檢測器(DAD)檢測的吸收光譜(未顯示)及特征吸收峰(表2)分析，這5個洗脫峰中包含5種Car組分，采用LC-MS對5種不同的Car組分進行分子量測定，結(jié)果見表2。依據(jù)兩個菌株的色素代謝途徑、保留時間、特征吸收峰和MS數(shù)據(jù)等綜合分析，表明洗脫峰H1至H5分別為球形烯(spheroidene，共軛雙鍵N=10)、3,4-雙脫氫玫紅品(3,4-didehydrorhodopin，N=12)、玫紅品(rhodopin，N=11)、脫水紫菌紅醇(anhydrorhodovibrin，N=12)和番茄紅素(lycopene，N=11)。厭氧條件下Rba.sphaeroides2.4.1 LH2中Car以球形烯為主，同時含有球形烯酮和鏈孢紅素[16]，而本文A-LH2中只含有單一Car，簡單的Car組分對進一步開展球形烯在LH2中的光化學(xué)活性研究具有重要價值。在Rps.palustris2.1.6中LH2積累4種Car，螺菌黃質(zhì)含量約占Car總量的60%[17]，而本文P-LH2中3,4-雙脫氫玫紅品為主要Car，根據(jù)HPLC洗脫峰面積估算含量高達約46.5%，這可能與碳源調(diào)控Car合成有關(guān)，Rps.palustris2.1.6菌株采用琥珀酸鈉為碳源，CQV97則以乙酸鈉為碳源。

圖4 純化A-LH2(a)和 P-LH2(b)的類胡蘿卜素組成分析

表2 LH2中Car色素組分的HPLC分析和分子量測定

2.5 能量傳遞活性的測定

純化LH2的吸收光譜和熒光激發(fā)光譜在BChl Qx帶(590 nm)歸一化處理，如圖5所示。根據(jù)Cogdell的方法[18]，通過計算Car吸收峰值與激發(fā)峰值峰值比率的平均值，即求得LH2分子中Car到BChl的單線態(tài)能量傳遞效率，A-LH2和P-LH2中分別為78.7%和55.3%，在A-LH2中的能量傳遞效率比在P-LH2中的高。

(a)A-LH2；(b)P-LH2。1：吸收光譜；2：熒光激發(fā)光譜。

2.6 Car構(gòu)象分析

PPC中Car與蛋白亞基結(jié)合可以產(chǎn)生強的拉曼信號，這些拉曼信號可反映出Car的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象[19-20]。LH2中ν1譜帶反映Car共軛體系的大小，Car的共軛體系增大，ν1譜帶向低波數(shù)方向移動[19]。ν4譜帶與Car和αβ多肽的相互作用有關(guān)，若Car呈平面構(gòu)象，ν4譜帶較弱，若呈扭曲構(gòu)象，則信號增強[21]。圖6所示為兩種LH2的室溫拉曼光譜，與A-LH2相比，P-LH2中ν1譜帶從1 515 cm-1移動至1 506 cm-1，表明P-LH2的Car具有相對大的π-電子共軛體系，與Car組分的分析結(jié)果一致。ν4譜帶強度較高，表明P-LH2中Car呈扭曲構(gòu)象，而A-LH2結(jié)合的Car則呈平面構(gòu)象。

圖6 室溫下A-LH2(a)和P-LH2(b)的共聚焦拉曼光譜

3 討論

目前文獻將PPC從膜上解離下來的去垢劑主要包括LDAO、OG、β-OG、LDS、DodM等，不同菌種(株)使用的去垢劑種類、濃度和增溶時間也不一樣，這預(yù)示著不同物種LH2與內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合力存在差異。如果選擇相同去垢劑類型和使用濃度，則增溶時間的差異應(yīng)該能夠反映PPC和膜結(jié)合程度的差異。目前分離純化LH2的目的只是為了制備LH2樣品，并沒有闡明不同菌種(株)中LH2與內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合能力、表面電荷和疏水性等特征的差異。本文特色是通過增溶時間、鹽析濃度和離子交換層析洗脫鹽度比較分析了Rba.azotoformansR7和Rps.palustrisCQV97 LH2性質(zhì)的差異，為紫細菌LH2性質(zhì)分析提供了方法和研究思路。

在相同濃度LDAO(體積分數(shù)為1%)下，比較了LH2增溶時間。與P-LH2相比，A-LH2增溶時間短(2 h)，表明A-LH2與膜脂分子的相互作用較弱。中性鹽硫酸銨常用于蛋白質(zhì)鹽析分離，通常高濃度硫酸銨能將PPC全部沉淀下來，再進行LH2的精制。采用40%、60%和80%(mg/mL)硫酸銨進行PPC的分級分離，獲得了PPC的不同組分。A-LH2富含在較低濃度(40%～60%，mg/mL)的鹽析組分中，而P-LH2則富含在較高濃度(60%～80%，mg/mL)的鹽析組分中，說明A-LH2疏水性較強，易于鹽析沉淀。DEAE離子交換層析是根據(jù)蛋白表面負電荷數(shù)量進行蛋白分離，A-LH2的洗脫鹽度為0.15～0.2 mol/L NaCl，而P-LH2則在較低鹽度(0.05～0.1 mol/L NaCl)被洗脫，表明A-LH2表面負電荷較多，而P-LH2表面負電荷較少。此方法可用于紫細菌LH2表面電荷、疏水性和膜結(jié)合能力等性質(zhì)的比較分析，這種方法是否具有普適性有待更多菌株的驗證，尤其是性質(zhì)相近的LH2。

不同Rps.palustris菌株LH2含有5種或8種Car組分，主要Car組分為玫紅品[20,22]。研究表明，P-LH2含有4種Car，其中，3,4-雙脫氫玫紅品(共軛長度N=12)為主要組分，這與文獻[20]和[22]報道的不同。另P-LH2中的Car以卷曲構(gòu)象方式與LH2結(jié)合，且Car到BChl的能量傳遞效率為55.3%。這與文獻[20]報道相吻合。光照厭氧條件下，Rhodobactersphaeroides2.4.1的LH2主要組分Car是球形烯，也含有球形烯酮和鏈孢紅素等[16]。結(jié)果表明，A-LH2只檢測到球形烯Car，這與文獻[16]報道不同。單一Car組分的LH2光化學(xué)活性的研究更有利于解析Car種類LH2能量傳遞活性和光保護作用。普遍認為短共軛雙鍵的Car和平面構(gòu)象有利于LH2中Car到BChl的能量傳遞[20]。拉曼分析顯示出A-LH2中Car的共軛長度低于P-LH2中Car的共軛長度，這與Car組分分析結(jié)果相一致。A-LH2 Car為平面構(gòu)象，能量傳遞效率相對較高，而P-LH2中Car為卷曲構(gòu)象，能量傳遞效率相對較低，這與文獻[20]報道規(guī)律一致。分子篩層析表明，LH2分子半徑大小順序為Rhodospirullummolishianum(8聚體)