盧 磊 陳睿毅 楊 陽 竺奇慧 胡偉華 李海東 徐冬冬

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 舟山 316022; 2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 舟山 316021;3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 舟山 316021)

染色體多倍化可以改變魚類的生物學(xué)性狀, 是魚類遺傳改良的重要技術(shù)手段。其中, 三倍體魚類是目前研究最多和最受關(guān)注的。由于具有低育或不育特征, 三倍體魚類不僅在促進生長、防止養(yǎng)殖逃逸帶來的生態(tài)風(fēng)險等方面具有重要的應(yīng)用價值,而且在生殖細胞移植、基因編輯育種等遺傳操作的研究與應(yīng)用中也極具價值。目前, 國內(nèi)外學(xué)者已在多種淡水和海水魚類中培育出三倍體群體, 如虹鱒(Oncorhynchus mykss)[1]、大黃魚(Larimichthys crocea)[2]、鯰(Parasilurus asotus)[3]和黃顙魚(Pelteogagrus fulvidraco)[4]等。研究表明, 三倍體魚類往往具有不同于二倍體的生物學(xué)性狀, 如在生長、性腺發(fā)育、繁殖及肌肉品質(zhì)等方面, 三倍體魚類與其二倍體可能會存在明顯差異。因此, 有必要對于三倍體魚類的生長發(fā)育特征進行比較分析, 為其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

黃姑魚(Nibea albiflora)隸屬石首科(Sciaenidae), 黃姑魚屬(Nibea), 具有生長快、抗逆性強等優(yōu)點, 經(jīng)過20余年的繁育和養(yǎng)殖技術(shù)開發(fā), 已經(jīng)成為我國沿海網(wǎng)箱、池塘養(yǎng)殖的重要品種。黃姑魚的性成熟周期較短(1—2齡), 屬于分批多次產(chǎn)卵類型, 采用人工控制技術(shù)可以實現(xiàn)其常年繁殖。因此黃姑魚三倍體在石首魚類的生殖細胞移植、基因編輯育種等方面具有較大的應(yīng)用潛力; 并且其在生長、出肉率等方面可能具有優(yōu)勢, 有望提高養(yǎng)殖效益。

三倍體魚類的性腺發(fā)育與其生長、發(fā)育、繁殖等生物學(xué)習(xí)性密切相關(guān), 成為研究學(xué)者關(guān)注的首要問題。三倍體與二倍體魚類性腺發(fā)育的差異因種而異, 雖然大多數(shù)的三倍體性腺表現(xiàn)出不育或低育, 但在一些淡水魚類中也發(fā)現(xiàn)了三倍體可育的現(xiàn)象[5,6]。在石首魚科的大黃魚[2]和箕作黃姑魚(Nibea mitsukurii)[7]中, 已經(jīng)建立了三倍體的誘導(dǎo)方法,并初步分析了三倍體的生長、成活及性腺發(fā)育等特征。如林琪等[2]發(fā)現(xiàn)大黃魚的三倍體較二倍體的性腺發(fā)育緩慢, 卵巢和精巢始終處于性原細胞階段。日本學(xué)者Takeuchi等[7]發(fā)現(xiàn)三倍體的箕作黃姑魚的生殖腺指數(shù)較二倍體降低, 雖能產(chǎn)生少量的配子, 但其后代不能存活。因此, 不同魚種三倍體的誘導(dǎo)條件、性腺發(fā)育特征等存在明顯差異。本研究通過冷休克誘導(dǎo)黃姑魚三倍體, 并通過組織學(xué)和基因表達分析了性腺發(fā)育和育性特征, 以期為其后續(xù)的遺傳改良和生殖細胞移植應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗親魚和精子、卵子收集

試驗用親魚來自浙江省海洋水產(chǎn)研究試驗場(舟山, 西軒島), 在室內(nèi)水泥池強化培育, 待到性成熟時向雌魚的體腔注射促黃體釋放激素-A2(寧波第二激素廠)進行人工催產(chǎn)。采用腹部擠壓法分別收集雌魚的卵子和雄魚的精子, 收集的精子和卵子分別放入干燥的燒杯中備用。

1.2 三倍體誘導(dǎo)

采用干法授精, 將采集的精液滴入卵中, 輕輕搖動混勻, 然后加入少量海水進行受精。三倍體誘導(dǎo)方法參考黃姑魚雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)方法[8], 在受精2.5min后浸入3℃的海水進行冷休克處理, 處理時間為10min, 其后將冷休克處理的受精卵轉(zhuǎn)移到1000 L養(yǎng)殖桶內(nèi)充氣培養(yǎng)。實驗期間, 受精卵孵化溫度為21—22℃, 仔魚到幼魚的培育溫度為22—24℃。

1.3 DNA相對含量測定

分別取二倍體組和冷休克處理組的初孵仔魚,蒸餾水沖洗后加入磷酸緩沖液搗碎, 過260目篩絹、DAPI染色后, 用流式細胞儀Partec cell counter analysis檢測DNA相對含量[8]。

1.4 染色體核型分析

分別取5月齡的二倍體組和三倍體組的實驗魚,采用活體腹腔注射0.1%的植物凝集素, 注射劑量為0.5 mL/100 g, 注射12h后, 向魚體腹腔中注射0.5%的秋水仙堿, 注射劑量為0.5 mL/100 g, 在注射3h后解剖取腎臟組織, 剪刀剪碎腎臟組織后用尼龍紗布過濾收集腎臟細胞, 于0.075 mol/L KCl室溫下低滲30min, 用卡諾氏固定液(甲醇﹕乙酸=3﹕1)在4℃固定3次, 每次固定30min, 最后采用冷片法滴片, 室溫干燥后置于15%吉姆薩染液中染色, 玻片干燥后經(jīng)顯微鏡拍照計數(shù)。

1.5 性腺組織切片

分別在2、3、4、6、8、10和12月齡取冷休克處理組和二倍體組的黃姑魚, 解剖取出性腺組織,每次取樣在10尾以上, 稱量記錄體長、體重和性腺重。采用波恩固定液固定性腺, 然后脫水、包埋,制作組織切片, HE染色后經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察并拍照, 參考相關(guān)文獻確定黃姑魚性腺發(fā)育時期[9]。

1.6 基因表達分析

樣品采集及cDNA獲取采集的性腺組織置于RNA保存液中。采用總RNA提取試劑盒(Solarbio, 總RNA提取試劑盒)提取性腺組織的總RNA,然后采用PrimescriptMTRT試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

qPCR分析使用的熒光定量引物來自于本實驗室設(shè)計的4對引物[10](表1)。反應(yīng)體系為20 μL,內(nèi)含2 μL的cDNA模板, 6.8 μL的無酶水, 0.4 μL的前引物, 0.4 μL的后引物, 0.4 μL的ROX Reference Dye Ⅰ, 10 μL的2×SYBY Premix ExTapTMⅡ。qPCR反應(yīng)程序為: 95℃ 30s; 95℃ 5s, 60℃ 30s, 33個循環(huán), 然后再 95℃ 15s; 60℃ 30s; 95℃ 15s。每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù), 基因相對表達量采用 2–??Ct方法進行計算。

表1 qPCR分析的基因及其特異性引物Tab.1 qPCR Validation genes and their specific primers

1.7 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計各組的受精率、孵化率和生殖腺指數(shù)GSI(gonadosomatic index), 各參數(shù)計算公如下:GSI=性腺重/體重×100, 受精率(%)=受精卵數(shù)/總卵數(shù)×100, 孵化率(%)=初孵仔魚數(shù)/受精卵數(shù)×100。采用Graphpadprism9.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用獨立樣本t檢驗比較對照組數(shù)據(jù)與處理組數(shù)據(jù)之間的差異時, 所有百分數(shù)都進行反正弦平方根轉(zhuǎn)換。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 受精率和孵化率

對二倍體和冷休克處理組的受精率和孵化率進行統(tǒng)計分析(圖1), 二倍體和冷休克處理組受精率分別為(88.59±2.51)%和(70.31±4.49)%(圖1A), 孵化率分別為(75.68±6.94)%和(21.5±6.63)%(圖1B),冷休克處理組的受精率和孵化率均顯著低于二倍體(P＜0.05)。

圖1 黃姑魚二倍體組和冷休克處理組的受精率與孵化率比較Fig.1 Comparisons of fertilization rate and hatching rate in the diploid and cold shock treatment groups of yellow drum

2.2 倍性鑒定

DNA相對含量冷休克處理組和二倍體組的DNA含量如圖2, 二倍體組的峰值在1024, 冷休克處理組的峰值在1536, 冷休克處理組的DNA含量為二倍體的1.5倍。經(jīng)流式細胞儀檢測了30尾冷休克處理組的初孵仔魚, 其DNA含量均為二倍體的1.5倍, 表明三倍體的比例為100%。

圖2 黃姑魚二倍體組和冷休克處理組的流式細胞儀分析結(jié)果Fig.2 The flow cytometer analysis of DNA content in the diploids and cold shock treatment groups of yellow drum

染色體的核型分析如圖3所示, 二倍體染色體數(shù)目為48條(圖3A), 三倍體的染色體數(shù)目為72條(圖3B), 三倍體黃姑魚的染色體數(shù)目為二倍體的1.5倍。

圖3 黃姑魚二倍體(A)和三倍體(B)的染色體核型分析Fig.3 Karyotype analysis of the diploid (A) and triploid (B)yellow drum

2.3 三倍體性腺發(fā)育

性腺外部形態(tài)及生殖腺指數(shù)如圖4所示,在10月齡和12月齡時, 三倍體精巢和卵巢的GSI顯著低于二倍體(圖4B)。二倍體的精巢和卵巢較為飽滿, 已經(jīng)接近性成熟, 而三倍體的性腺外部形態(tài)明顯不同于二倍體, 精巢和卵巢發(fā)育較二倍體緩慢(圖4A)。

圖4 黃姑魚二倍體和三倍體的性腺外部形態(tài)及生殖腺指數(shù)比較Fig.4 External morphology of gonads and the gonadosomatic index of the diploid and triploid yellow drum

精巢發(fā)育如圖5所示, 2月齡時, 二倍體和三倍體的精巢正處于Ⅰ期, 此時在二倍體和三倍體性腺組織切片中可見精小葉內(nèi)充滿大量的精原細胞(圖5A、E)。6月齡時, 二倍體的精巢處于Ⅳ期,三倍體的精巢處于Ⅲ期, 此時在二倍體精巢組織切片中可見大量成熟的精子、精母細胞和少量的精原細胞(圖5B), 在三倍體精巢組織切片中可見大量精母細胞和少量的精原細胞(圖5F)。10月齡時, 二倍體的精巢已接近于Ⅴ期, 三倍體的精巢仍處于Ⅲ期, 此時在二倍體精巢組織切片中可見精小葉充滿了精子(圖5C)。在三倍體精巢組織切片中可見大量的精母細胞和少量的精原細胞(圖5G)。12月齡時, 二倍體的精巢處于Ⅴ期, 精巢內(nèi)可見大量游離的精子沿著精細小管準(zhǔn)備匯入中央導(dǎo)管, 但是仍存在一些處于不同發(fā)育的生殖細胞(圖5D); 三倍體的精巢則處于Ⅲ期, 精巢中可見大量精母細胞和少量精原細胞(圖5H)。

圖5 二倍體和三倍體精巢發(fā)育的組織學(xué)比較Fig.5 Histological comparison of testis development between diploids and triploids

卵巢發(fā)育如圖6所示, 2月齡時, 二倍體和三倍體的卵巢處于Ⅰ期, 此時, 在二倍體卵巢組織切片中可見卵巢腔和大量的卵原細胞(圖6A), 在三倍體卵巢組織切片中可見大量的卵原細胞(圖6E)。6月齡時, 二倍體的卵巢處于Ⅱ期, 卵巢組織切片中可見大量的第Ⅱ時相卵母細胞(圖6B); 三倍體的卵巢則處于Ⅰ期, 卵巢組織切片中可見大量的卵原細胞(圖6F)。10月齡時, 二倍體的卵巢處于Ⅲ期, 卵巢組織切片可見第Ⅲ時相卵母細胞(圖6C); 三倍體的卵巢仍處于Ⅰ期, 但在其卵巢組織切片中可見少量分散的第Ⅱ時相卵母細胞(圖6G)。12月齡時, 二倍體的卵巢處于Ⅴ期, 卵巢組織切片中可見大量完成卵黃發(fā)生的卵母細胞(圖6D), 三倍體的卵巢仍停滯在Ⅰ期, 其卵巢組織切片中僅可見少量分散的第Ⅱ期時相卵母細胞(圖6H)。

圖6 二倍體和三倍體卵巢發(fā)育的組織學(xué)比較Fig.6 Histological comparison of ovary development between diploids and triploids

二倍體和三倍體生殖相關(guān)基因的表達比較如圖7所示, 10和12月齡時, 三倍體精巢的dmrt1和vasa基因表達量均顯著低于二倍體(圖7A—D); 三倍體卵巢的cyp19a基因表達量也顯著低于二倍體(圖7E、G), 而二倍體卵巢中的vasa表達量高于三倍體, 但二者沒有顯著差異(圖7F、H)。

圖7 二倍體和三倍體黃姑魚的dmrt1基因、vasa基因和cyp19a基因表達分析Fig.7 The expression analysis of dmrt1, vasa and cyp19a in the diploid and triploid yellow drum

3 討論

在目前的研究中, 淡、海水魚類常用冷休克或熱休克處理的方法誘導(dǎo)三倍體, 這兩種方法的選擇與魚種有關(guān), 如冷水性魚類虹鱒采用熱休克處理獲得了三倍體[1], 而暖溫性魚類如大黃魚、箕作黃姑魚等則采用冷休克誘導(dǎo)三倍體[2,7]。黃姑魚隸屬于暖溫水性魚類, 其雌核發(fā)育研究中采用了冷休克處理, 故而本研究也選擇了冷休克處理誘導(dǎo)三倍體。

參考雌核發(fā)育的誘導(dǎo)參數(shù)[8], 黃姑魚三倍體的誘導(dǎo)選擇在受精后2.5min以3℃的海水進行10min的冷休克處理, 獲得了較高的受精率(70.31±4.49)%和孵化率(21.5±6.63)%, 且三倍體比例達到100%。箕作黃姑魚的誘導(dǎo)則采用在受精后5min以10℃處理15min,孵化率達到(16.4±10)%[7]。本研究所采用的冷休克誘導(dǎo)方法和參數(shù)與大黃魚三倍體相似, 但孵化率高于大黃魚三倍體[11]。魚卵的質(zhì)量及冷休克參數(shù)是影響誘導(dǎo)效果的主要因素。其中, 冷休克起始時間是三倍體能否誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵[7], 而采用適宜的溫度和持續(xù)時間則能減少對胚胎傷害[4]。

魚類倍性鑒定常用細胞學(xué)、流式細胞儀和染色體核型分析等方法[2,7], 由于流式細胞儀和染色體核型分析的方法具有高效、簡便等特點, 本研究采用這兩種方法檢測黃姑魚的倍性。經(jīng)過在初孵仔魚和幼魚階段的檢測, 其三倍體比例為100%, 表明本研究所采用的誘導(dǎo)參數(shù)能夠成功誘導(dǎo)黃姑魚三倍體。Takeuchi等[7]采用冷休克誘導(dǎo)箕作黃姑魚三倍體, 其比例也可達到100%。人工誘導(dǎo)的多倍體的染色體基因組可能存在不穩(wěn)定性, 在發(fā)育過程中部分個體可能出現(xiàn)染色體丟失導(dǎo)致倍性降低[6],因此對于人工誘導(dǎo)的黃姑魚三倍體還需要持續(xù)的倍性監(jiān)測, 以此確定三倍體基因組的穩(wěn)定性。

三倍體的性腺發(fā)育是研究學(xué)者首先關(guān)注的問題, 性腺成熟指數(shù)GSI是用來評價魚類性腺發(fā)育成熟度的指標(biāo)之一。在本研究中, 10月齡和12月齡二倍體雄魚和雌魚的性腺成熟指數(shù)均是三倍體的2倍以上, 三倍體的性腺發(fā)育明顯較二倍體緩慢。在箕作黃姑魚[7]和鯽[11]等魚類中也發(fā)現(xiàn)三倍體的性腺成熟指數(shù)明顯低于二倍體。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)三倍體黃姑魚的精巢和卵巢發(fā)育較二倍體滯后, 三倍體的卵巢主要由卵原細胞組成, 而精巢主要由精母細胞組成。在大黃魚中也發(fā)現(xiàn)三倍體精巢由少量的精母細胞組成和大量的性原細胞組成, 三倍體卵巢由少量的卵母細胞組成和大量的性原細胞組成[2]。

本研究進一步分析生殖相關(guān)基因表達, 從分子水平比較二倍體和三倍體的性腺發(fā)育差異。vasa基因是生殖細胞的標(biāo)記基因, 主要在魚類的生殖細胞中表達[13]。通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn), 二倍體精巢中的vasa表達量約為三倍體的3倍, 而二倍體卵巢中的vasa表達量也高于三倍體。在湘云鯽中研究發(fā)現(xiàn)二倍體精巢中的vasa基因表達量顯著高于三倍體紅鯽, 而三倍體卵巢中的vasa基因表達量與二倍體紅鯽無顯著差異[14]。Cyp19a是雌魚的體細胞標(biāo)記基因, 主要在卵巢的顆粒細胞(Granulosa cells)等表達[18], 通過基因表達分析發(fā)現(xiàn), 黃姑魚三倍體卵巢中的cyp19a表達量約為二倍體的1/5。Dmrt1基因主要在魚類的生殖細胞表達和支持細胞等表達[15—17], 通過基因表達分析發(fā)現(xiàn), 黃姑魚三倍體精巢中dmrt1的表達量則為二倍體的1/3倍。三倍體黃姑魚的生殖相關(guān)基因表達較二倍體明顯下降,表明其生殖細胞及支持細胞的發(fā)育受到三倍化的影響, 從而導(dǎo)致性腺發(fā)育滯后。

綜上, 本研究通過冷休克處理成功誘導(dǎo)了黃姑魚三倍體, 三倍體的性腺發(fā)育較二倍體滯后, 育性明顯降低。在魚類生殖細胞移植中, 不育受體的制備至關(guān)重要。通過染色體三倍化降低育性, 是制備生殖細胞移植受體的重要途徑。因此, 黃姑魚三倍體有望成為石首魚類的生殖細胞移植的受體, 在石首魚類性別控制育種、基因資源保存及瀕危物種保護等方面極具應(yīng)用價值。對于三倍體黃姑魚的其他生物學(xué)性狀, 如生長、出肉率和肌肉品質(zhì)等還需要進一步研究, 為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。