馮玉儀，何楊成，金 海，何 艷，胡志文，羅 瓊，丘丹霞，柳建華

(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510000)

腫瘤微環(huán)境對于治療腫瘤具有重要作用。腫瘤組織內(nèi)血管結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞快速增長，導(dǎo)致腫瘤長期處于缺氧狀態(tài)，組織氧分壓(oxygen partial pressure，PO2)<10 mmHg[1]，影響藥物或放射治療效果；同時腫瘤微環(huán)境又與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等密切相關(guān)[2-3]。治療前評估腫瘤微環(huán)境缺氧情況有助于制定個體化治療方案。近年來，超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)快速發(fā)展，可實時、連續(xù)、多次觀察活體腫瘤組織內(nèi)的血流灌注情況，并能定量分析腫瘤組織血流灌注強度[4-6]；其定量參數(shù)包括峰增強(peak enhancement，PE)、曲線下面積(area under curve，AUC)、腫瘤組織原始曲線增強上升斜率(Grad)及達峰時間(time to peak，TTP)等。本研究觀察CEUS定量參數(shù)與腫瘤組織PO2間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 GE LOGIQ E9超聲診斷儀，內(nèi)置造影時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)分析軟件，配備ML6-15高頻線陣探頭。針式組織PO2測量儀主機購自上海塔望公司，PO2傳感器購自德國Presens公司。CEUS造影劑脂氟顯由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科研制，外觀為乳白色凝乳狀，核心氣體為全氟丙烷，平均粒徑2 μm，濃度為(4～9)×109/ml。微泡使用前由振蕩器振蕩45 s，CEUS用量為0.01 ml/kg體質(zhì)量。HIF-1α抗體(NB100-105)購自NOVUS公司。

1.2 動物模型 30只雌性新西蘭大白兔購自廣東省實驗動物中心，平均體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，在24～26℃和45%～55%濕度下飼養(yǎng)7天及以上再行接種。VX2腫瘤組織購自中山大學(xué)細(xì)胞庫，于室溫條件下將二代腫瘤組織切成小塊(1 mm3)，與無菌生理鹽水混合形成VX2腫瘤組織懸濁液，取5 ml肌內(nèi)注射至兔左后肢大腿外側(cè)淺肌層。在植入瘤塊后約第10天、腫瘤大小約10 mm時開始實驗。本研究方案由華南理工大學(xué)實驗動物委員會批準(zhǔn)。

1.3 超聲引導(dǎo)下置入組織PO2傳感器 經(jīng)耳緣靜脈注入2%戊巴比妥鈉20 mg/kg體質(zhì)量麻醉荷瘤兔，待兔角膜反射消失后進行實驗。側(cè)臥位保定荷瘤兔，于左后肢外側(cè)備皮、消毒、鋪巾，以二維超聲觀察腫瘤大小、回聲等基礎(chǔ)情況；選擇顯示腫瘤最大切面，于超聲引導(dǎo)下以組織PO2傳感器進行穿刺，使傳感器針尖位于腫瘤外周，保持針尖與探頭平行，并以針尖標(biāo)記觀察切面，固定超聲探頭(圖1)。

圖1 超聲引導(dǎo)下以組織PO2傳感器穿刺荷瘤兔左后肢外側(cè)腫瘤處，將針尖與探頭平行切面作為CEUS觀察切面

1.4 CEUS 選擇造影模式，調(diào)節(jié)增益至僅可見包膜，深度為腫瘤下緣約1 cm，將焦點置于腫瘤下緣；自耳緣靜脈注入造影劑，采集全程動態(tài)圖像，觀察腫瘤血流灌注(圖1)。

1.5 測定組織PO2待腫瘤組織內(nèi)造影劑廓清后，將PO2傳感器套管針移至靠近腫瘤中心的ROI，將針尖內(nèi)的PO2傳感器推出，約10 s待數(shù)值平穩(wěn)后進行取值；再將針尖和傳感器整體推進至遠(yuǎn)離腫瘤中心的ROI，待數(shù)值平穩(wěn)后進行取值，獲得2個ROI的組織PO2。

1.6 TIC分析 以二維超聲確定組織PO2傳感器所在ROI的位置，通過設(shè)備內(nèi)置造影分析軟件進行TIC分析，分別獲得2個ROI的血流灌注PE[PE=PI(peak intensity)-BI(base intensity)]、AUC、Grad及TTP(圖2)。以0≤PE<10 dB為低灌注，10 dB≤PE<20 dB為中灌注，PE≥20 dB位高灌注。

圖2 荷瘤兔腫瘤ROI區(qū)域TIC分析圖

1.7 免疫組織化學(xué)染色 剝除腫瘤組織后以甲醛固定，行石蠟包埋、切片，按照說明書對腫瘤組織進行HIF-1α免疫組織化學(xué)染色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計分析軟件。以Pearson相關(guān)性分析評價CEUS PE、AUC及Grad與腫瘤組織PO2的相關(guān)性；采用Spearman相關(guān)性分析評價TTP與PO2的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二維超聲 兔VX2腫瘤包膜完整，邊界較清晰，平均長徑(10.96±0.95)mm，短徑(5.13±0.99)mm，內(nèi)部回聲多呈均勻?qū)嵸|(zhì)性低回聲；部分腫瘤內(nèi)可見點狀強回聲鈣化灶，少數(shù)可見不規(guī)則無回聲區(qū)。

2.2 CEUS 兔VX2腫瘤CEUS呈“快進快出”模式，大部分在動脈期呈整體顯著增強，部分腫瘤內(nèi)因液化壞死而呈現(xiàn)充盈缺損；其TIC上升支陡直，快速達峰，后迅速下降，約2 min廓清。腫瘤內(nèi)ROI的PE值范圍為1.10～27.65 dB，壞死區(qū)PE值接近0；CEUS中，10個腫瘤ROI呈低灌注，35個呈中灌注，15個呈高灌注(圖3A～3C)。

2.3 腫瘤組織PO2腫瘤組織內(nèi)PO2分布不均，鄰近血管區(qū)域PO2較高，遠(yuǎn)離血管區(qū)域PO2下降明顯。60個腫瘤組織ROI 的PO2范圍為0.39～10.49 mmHg，平均(3.98±2.62)mmHg(圖3D～3F)，壞死區(qū)域的組織PO2約為0。

2.4 HIF-1α免疫組織化學(xué)檢查 經(jīng)HIF-1α免疫組化染色后, VX2腫瘤組織中的棕褐色代表陽性表達。腫瘤組織內(nèi)存在不同程度缺氧，且缺氧區(qū)域分布不均勻(圖3G～3I)。

圖3 荷瘤兔腫瘤CEUS、PO2及HIF-1α的免疫組織化學(xué)結(jié)果 A～C.分別為CEUS圖示腫瘤組織呈低、中、高灌注(黃圈)，PE值分別為2.04、15.93及25.75 dB；D～F.分別對應(yīng)圖A～C中黃圈區(qū)域組織的PO2，其測值分別為0.39、4.88及7.72 mmHg；G～I.分別為低、中、高灌注腫瘤組織HIF-1α免疫組織化學(xué)染色圖(×20)

2.5 CEUS定量參數(shù)與腫瘤組織PO2的相關(guān)性 60個腫瘤組織ROI的 PE范圍為1.10～27.65 dB，平均(15.19±6.25)dB；AUC范圍為10.36～769.50 mm2，平均(315.10±202.90)mm2；Grad范圍為0.05～2.71，平均1.02±0.50；TTP范圍為6.68～56.52 s，平均(16.41±6.54)s。相關(guān)性分析顯示，CEUS所示 PE、AUC及Grad與腫瘤組織PO2均呈正相關(guān)(r=0.822、0.638、0.445，P均<0.05)，TTP與PO2無明顯相關(guān)性(P=0.693)。

3 討論

現(xiàn)有評估腫瘤組織缺氧程度方法主要分為直接測量法和間接測量法；前者又包括氧電極極譜法及熒光淬滅法，氧電極極譜法會消耗組織內(nèi)氧氣，無法重復(fù)測量。本研究采用的熒光淬滅法基于氧分子對熒光物質(zhì)的淬滅效應(yīng)進行測量，不消耗氧氣，但僅適用于淺表腫瘤，且有創(chuàng)，探針會破壞腫瘤微環(huán)境而不能重復(fù)測量[7]。間接測量法種類繁多，主要檢測缺氧指標(biāo)，如缺氧特異性熒光探針法[8]、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α免疫組織化學(xué)染色法[9]等；還包括影像學(xué)檢測血流灌注，如利用18F標(biāo)記FMISO PET掃描[10-11]、動態(tài)對比增強MRI(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)[11-12]、灌注CT[13]，以及利用氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白不同的光學(xué)性質(zhì)，通過光聲成像測定組織中氧飽和度的光聲成像系統(tǒng)等[14]。

治療腫瘤具有氧依賴性，常常需要在不損傷組織的前提下獲取腫瘤的氧合信息；而腫瘤組織PO2與血流灌注、組織耗氧等因素息息相關(guān)，血流灌注豐富區(qū)域缺氧程度相對輕，反之亦然[15]，故定量分析腫瘤血流灌注情況可反映腫瘤微環(huán)境缺氧情況。在評估腫瘤微環(huán)境氧合情況的眾多方法中，缺氧特異性熒光探針法、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α免疫組織化學(xué)染色法僅能針對術(shù)后標(biāo)本進行檢測；光聲成像受腫瘤深度限制。相比之下，無創(chuàng)成像技術(shù)用于初步評估腫瘤缺氧情況及程度具有巨大發(fā)展空間，CEUS可實時評估活體腫瘤內(nèi)缺氧情況，是安全、簡便、成本低且有效評估腫瘤內(nèi)缺氧情況的方法，可重復(fù)性佳，易于推廣，有助于臨床根據(jù)腫瘤缺氧情況制定個體化治療方案，以改善患者預(yù)后。

CEUS可動態(tài)、連續(xù)觀察不同器官或腫瘤組織的血流灌注模式，通過定量分析CEUS曲線圖可獲得不同區(qū)域的血流灌注強度?？紤]到腫瘤血流分布不均，本研究對每個瘤灶隨機采集2個ROI，以評估其血流灌注情況，結(jié)果顯示腫瘤PE值范圍為1.10～27.65 dB(包括壞死區(qū)域)。為觀察腫瘤血流灌注與組織PO2的關(guān)系，本研究測量CEUS取樣相同區(qū)域腫瘤組織的PO2，發(fā)現(xiàn)其PO2范圍為0.39～10.49 mmHg；相關(guān)性分析顯示，CEUS 所示腫瘤組織PE與相應(yīng)區(qū)域PO2的相關(guān)系數(shù)為0.822，AUC、Grad與相應(yīng)區(qū)域PO2的相關(guān)系數(shù)分別為0.638和0.445，均呈正相關(guān)，與DCE-MRI[11-12]及灌注CT[13]觀測結(jié)果相符。以上結(jié)果提示，定量分析CEUS曲線可為CEUS無創(chuàng)、精準(zhǔn)評估腫瘤PO2提供科學(xué)依據(jù)；AUC、Grad與PO2的相關(guān)性稍弱，可能原因在于TIC參數(shù)中，AUC、Grad反映造影全過程，而PO2則為選定時間點的測值，也可能與樣本量小有關(guān)。

本研究的局限性：①不同造影劑組織灌注時間存在差異，而本研究未能利用多種造影劑對組織氧合進行對比評估；②未能對腫瘤區(qū)域缺氧情況免疫組織化學(xué)結(jié)果與組織PO2測值進行點對點對比；③僅針對淺表腫瘤組織監(jiān)測其PO2。有待后續(xù)進一步完善。

綜上所述，CEUS定量參數(shù)PE、AUC及Grad與腫瘤組織PO2呈正相關(guān)；通過CEUS TIC分析和進一步擬合PE-PO2曲線方程，可推測腫瘤組織氧合情況，評估腫瘤組織是否缺氧及其程度。