張鳳一 高洪蓮 邱 宇 崔鈺瑩 李 童 王亞彤 張 磊

在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)中，未發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)因相對性缺氧而導致病理性新生血管增加，其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已經(jīng)被證明是ROP發(fā)病的主要因素[1-2]。玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物是目前治療ROP的重要方法，對新生血管的抑制作用明顯[3]。但也有研究表明，玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物后視網(wǎng)膜細胞可通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β2、結(jié)締組織生長因子(CTGF)等細胞因子的表達加速纖維血管膜的形成[3]。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，抗VEGF藥物在形覺剝奪性近視(FDM)豚鼠模型中會使視網(wǎng)膜中多巴胺(DA)含量進一步下降[4]。而DA是視網(wǎng)膜中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對視網(wǎng)膜正常發(fā)育、抑制近視有著重要影響[5]。有研究顯示，DA本身即具有抗新生血管的作用，DA通過激活多巴胺D2受體(DRD2)來抑制VEGF介導的微血管通透性、增殖和遷移[6-9]。但外源性DA是否對視網(wǎng)膜新生血管有治療作用鮮有研究進行證實。本研究擬通過建立氧誘導視網(wǎng)膜病變(OIR)小鼠模型，并給予DA治療，觀察其對視網(wǎng)膜新生血管的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器DA、Quinpirole(DRD2激動劑)、異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-Dextran，相對分子質(zhì)量2×106)(美國Sigma公司)；Spiperone(DRD2抑制劑)、山羊抗小鼠IgG(英國Abcam公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(中國Solarbio公司)；Q-PCR試劑盒(中國艾科瑞生物)；鼠單抗VEGF抗體(美國Santa公司);OCT冰凍切片包埋劑(美國Sakura公司)；自制動物實驗艙；測氧儀(建德分析儀器二廠,CY-12C)；冰凍切片機(CM1950，德國Leica公司)；正置熒光顯微鏡(BX51T,日本Olympus公司)。

1.1.2 實驗動物及分組180只健康清潔級7 d齡C57BL/6J小鼠，購于斯貝福生物技術(shù)有限公司，雌雄不限，體重(4.38±0.58)g。飼養(yǎng)環(huán)境：自然照明下12 h/12 h晝夜循環(huán)，維持環(huán)境溫度為22～25 ℃，濕度為50%～70%，小鼠自由攝水、攝食。采用隨機數(shù)字表法將180只小鼠隨機分為空白組、OIR組、NaCl組、DA組、Quinpirole組、Spiperone組，每組30只。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批準號：20210808-78)，實驗動物的喂養(yǎng)和使用嚴格遵循濱州醫(yī)學院動物管理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立小鼠出生的當天記為0 d齡，參照Smith等[10]報道的造模方法，新生小鼠在正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)至7 d齡時，OIR組、NaCl組、DA組、Quinpirole組、Spiperone組共150只小鼠及其哺乳母鼠放至密閉的動物實驗艙中，艙內(nèi)O2體積分數(shù)穩(wěn)定在(75±2)%，溫度為(23±2)℃，濕度為(55±2)%，每日光照12 h。在氧艙中飼養(yǎng)時為避免母鼠死亡，需每隔24 h開艙更換一次母鼠，開艙時間控制在10 min以內(nèi)。待小鼠12 d齡時將小鼠及其哺乳母鼠放回正常環(huán)境飼養(yǎng)5 d。空白組小鼠始終在正常環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.2 藥物干預(yù)及取材根據(jù)分組于小鼠12 d齡時給予相應(yīng)的干預(yù)措施。NaCl組、DA組、Quinpirole組小鼠右眼玻璃體內(nèi)分別注射8.5 g·L-1NaCl、15 mmol·L-1的DA溶液、602 μmol·L-1的Quinpirole溶液各1 μL； Spiperone組小鼠右眼玻璃體內(nèi)注射濃度為154 μmol·L-1的Spiperone溶液1 μL，30 min后再注射15 mmol·L-1的DA溶液1 μL；OIR組不做藥物干預(yù)。待小鼠17 d齡時，行后續(xù)實驗。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織的病理學觀察每組隨機選取6只小鼠頸椎脫臼處死，摘取右側(cè)眼球，固定后經(jīng)常規(guī)脫水、OCT包埋后，制成8 μm切片，每組小鼠隨機選取20張切片行HE染色，隨機選取6張切片于400倍光學顯微鏡下觀察小鼠視網(wǎng)膜情況，并對突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)進行計數(shù)。

1.2.4 視網(wǎng)膜鋪片使用40 g·L-1多聚甲醛制備濃度為50 g·L-1的FITC-Dextran造影液。每組隨機選取3只小鼠經(jīng)腹腔注射20 g·L-1水合氯醛麻醉，待疼痛反射消失后固定四肢，眼科剪打開胸腔，暴露心臟，頭皮針針頭自左心尖插入左心室并推入主動脈，小心剪開右心耳，緩慢推注FITC-Dextran造影液1 mL，肝臟、結(jié)膜等組織變?yōu)辄S綠色為灌注成功。立即摘除眼球，在40 g·L-1多聚甲醛中固定3 h。在體式顯微鏡下沿角鞏膜緣剪下角膜及虹膜組織，娩出晶狀體和玻璃體，去除鞏膜，以視盤為中心，將杯狀視網(wǎng)膜放射狀剪為4瓣，平鋪于載玻片上，滴少量甘油后加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察，用Photoshop軟件計算新生血管面積。

1.2.5 Q-PCR檢測每組隨機選取10只小鼠頸椎脫臼法處死，分離出視網(wǎng)膜，按照試劑盒說明提取視網(wǎng)膜組織中總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)程序為42 ℃孵育2 min，37 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s，然后進行PCR擴增。VEGF上游引物為5’-ACTGGACCCTGGCTTTACTG-3’，下游引物為5’-GCAGTAGCTTCGCTGGTAGA-3’；GAPDH上游引物為5’-TGTCTCCTGCGACTTCAACA-3’，下游引物為5’-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3’。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。使用2-ΔΔCt法計算VEGF mRNA相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測每組剩余小鼠均行頸椎脫臼法處死，收集視網(wǎng)膜后于冰上研磨并加裂解液裂解30 min，轉(zhuǎn)移至EP管，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，BCA法測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸15 min，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，50 g·L-1BSA室溫封閉2 h，加入一抗(VEGF稀釋度為11000；GAPDH稀釋度為110 000)，4 ℃孵育過夜，TBST沖洗3次，每次10 min，加入二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，每次10 min，化學發(fā)光顯影，ImageJ軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算VEGF蛋白相對表達量，實驗獨立重復 3次。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織切片中突破內(nèi)界膜的新生血管生長情況光學顯微鏡下可見，空白組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜平整，少有新生血管內(nèi)皮細胞突入玻璃體，未發(fā)現(xiàn)與內(nèi)界膜相連的伸入到玻璃體的新生血管。OIR組、NaCl組與Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中可見較多突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞，或單獨出現(xiàn)，或成簇出現(xiàn)，并可見視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下的細胞增生，排列紊亂。與NaCl組相比，DA組小鼠視網(wǎng)膜可見少數(shù)突破內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞，DA組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜欠平整，突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞稍減少。Quinpirole組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)清晰，突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞明顯減少，僅見少量的新生血管內(nèi)皮細胞(圖1)。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜HE染色 A:空白組；B:OIR組；C:NaCl組；D:DA組；E:Quinpirole組；F:Spiperone組。紅箭頭示侵入內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核。

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)空白組、OIR組、NaCl組、DA組、Quinpirole組、Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)分別為(1.48±0.54)個、(51.09±1.20)個、(51.46±4.10)個、(31.12±1.61)個、(16.94±1.04)個、(50.59±1.63)個，各組間總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=644.738,P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)明顯高于空白組(P<0.05)；NaCl組、Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)與OIR組相比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；DA組小鼠視網(wǎng)膜中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)較OIR組明顯減少(P<0.05)；Quinpirole組小鼠視網(wǎng)膜中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)較DA組明顯減少(P<0.05)。

2.3 視網(wǎng)膜鋪片空白組小鼠的視網(wǎng)膜血管呈均勻網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布，血管分支清晰可見，視網(wǎng)膜中央未見無灌注區(qū)及熒光滲漏區(qū)，未見異常的病理性新生血管；OIR組、NaCl組、Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜可見大片的熒光滲漏區(qū)及迂曲擴張的病理性新生血管，血管走行極度紊亂。DA組小鼠視網(wǎng)膜大血管的迂曲情況好轉(zhuǎn)，病理性新生血管減少，血管結(jié)構(gòu)較清晰。Quinpirole組小鼠視網(wǎng)膜新生血管明顯減少，血管走行漸規(guī)則，熒光滲漏區(qū)明顯減少，血管網(wǎng)較清晰(圖2)。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜FITC-Dxtran血管造影 A:空白組；B:OIR組；C:NaCl組；D:DA組；E:Quinpirole組；F:Spiperone組。紅箭頭示病理性新生血管及熒光滲漏區(qū)。

2.4 各組小鼠視網(wǎng)膜中新生血管面積空白組、OIR組、NaCl組、DA組、Quinpirole組、Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中新生血管面積占視網(wǎng)膜血管總面積的百分比分別為0、(0.52±0.12)%、(0.51±0.01)%、(0.42±0.03)%、(0.26±0.03)%、(0.53±0.07)%，各組間總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與OIR組相比，NaCl組和Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中新生血管面積占比差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05);與OIR組相比，DA組小鼠視網(wǎng)膜中新生血管面積占比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與DA組相比，Quinpirole組小鼠視網(wǎng)膜中新生血管面積占比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA的相對表達量空白組、OIR組、NaCl組、DA組、Quinpirole組、Spiperone組間小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA的相對表達量總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與空白組相比，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01)；與OIR組相比，NaCl組和Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)；DA組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA相對表達量明顯低于OIR組(P<0.01)；Quinpirole組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA相對表達量明顯低于DA組(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF mRNA的相對表達量 *P<0.05，**P<0.01。

2.6 各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的相對表達量Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的相對表達量明顯升高(P<0.01);與OIR組相比，NaCl組和Spiperone組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05);與OIR組相比，DA組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的相對表達量明顯降低(P<0.05);與DA組相比，Quinpirole組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的相對表達量明顯降低(P<0.01)(圖4)。

圖4 Western blot檢測各組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF蛋白的相對表達量 *P<0.05，**P<0.01。

3 討論

ROP中，VEGF誘導的受體磷酸化是啟動下游信號通路導致血管生成或相關(guān)病理生理結(jié)果的關(guān)鍵步驟[1]。相對性缺氧增加了視網(wǎng)膜中VEGF的表達，過度分泌的VEGF通過與內(nèi)皮細胞結(jié)合并磷酸化VEGFR-2，使新生血管長入玻璃體并導致局部毛細血管滲漏，嚴重時可導致視網(wǎng)膜脫離[11]。ROP患者接受抗VEGF治療后仍出現(xiàn)殘余視力喪失及高發(fā)的近視率[1]，一方面可能是ROP影響了中央視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的成熟，脈絡(luò)膜成熟障礙無法為視網(wǎng)膜提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，導致光感受器受到長期損害[12]。另一方面可能是抗VEGF藥物降低了視網(wǎng)膜DA的水平，使視網(wǎng)膜無法維持正常的視覺發(fā)育，導致高發(fā)的近視率[4]。

DA屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，其受體存在于全身各器官和細胞中，具有多種生物學效應(yīng)，如延緩近視進展、調(diào)節(jié)眼壓、治療弱視、影響新生血管生成、抗腫瘤等，且不良反應(yīng)較少[13-15]。DA通過5種受體亞型發(fā)揮作用，分為兩個家族：D1樣受體(D1和D5)和D2樣受體(D2、D3和D4)[5]。大量研究表明，DA的抗新生血管作用主要是通過D2受體來實現(xiàn)的[6-8,16-18]，DA不僅可以通過刺激D2受體來抑制腫瘤的病理性血管生成[19]，而且對創(chuàng)面生理性血管生成也有負面影響，特異性D2受體拮抗劑的治療可以顯著增加創(chuàng)面血管生成[9]。Hoeppner等[20]研究表明，DA和DRD2治療可以通過抑制VEGF的表達、受體磷酸化及其下游信號通路減少小鼠肺癌模型中的新生血管形成。

本研究選擇建立OIR模型，觀察注射DA及相關(guān)藥物后視網(wǎng)膜中VEGF的水平，及病理性新生血管的變化。鑒于視網(wǎng)膜含有豐富的抗壞血酸[21]，我們沒有使用抗壞血酸作為DA的抗氧化劑，而是選擇了可以有效溶解藥物的8.5 g·L-1NaCl[13]。關(guān)于藥物濃度，新生小鼠玻璃體的體積約2 μL[22]，參考文獻[13,23]計算出注射所需藥物濃度。根據(jù)文獻[13]，我們選擇在注射Spiperone藥物30 min后注射DA溶液。本研究結(jié)果表明，DA組較OIR組小鼠新生血管面積占比減少，且VEGF mRNA和蛋白的相對表達量均呈現(xiàn)相應(yīng)下降趨勢，這與Sinha等[18]的研究結(jié)果一致。Quinpirole激活DRD2后新生血管面積占比進一步減少，VEGF mRNA和蛋白的相對表達量均較DA組進一步下降，而Spiperone組小鼠在抑制DRD2后再注射DA，其新生血管面積占比及VEGF mRNA和VEGF蛋白的相對表達量與OIR組相比差異均無統(tǒng)計學意義。這說明DA減少新生血管形成的作用機制可能是通過激活DRD2使VEGF mRNA和蛋白的相對表達量下降實現(xiàn)的。Cristina等[24]研究結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，DRD2基因敲除小鼠腦垂體中VEGF mRNA和蛋白的表達增加，而在野生型小鼠中，延長DRD2拮抗劑氟哌啶醇的治療時間，可以促進腦垂體中VEGF的表達，這也說明了VEGF表達和DRD2呈負相關(guān)。

綜上所述，DA能夠抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成，其作用機制是通過激活DRD2來實現(xiàn)的。DA及Quinpirole在抑制視網(wǎng)膜新生血管的同時，也能夠為視網(wǎng)膜的正常視覺發(fā)育提供DA，但其是否具有濃度依賴性以及最佳給藥方式、給藥時間及具體機制仍需進一步研究。目前對ROP的治療主要以抑制新生血管為主，而DA在抑制新生血管的同時還能夠支持視網(wǎng)膜的正常發(fā)育[25]，為治療ROP提供了新思路。