周家燕 鄒建 陳衛(wèi)英 吳一超 陳奚潼 王倩 曾文靜 胡楠 楊軍

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南充 637002；2.安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安陽(yáng) 455000）

生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育以及衰老等生命活動(dòng)受到眾多基因的調(diào)控。然而，調(diào)控這些生理生化過(guò)程的基因大多屬于多基因家族成員，在調(diào)控同一生理生化過(guò)程中，部分基因之間存在明顯的功能冗余。MADS-box 家族中的SEPALLATA（SEP）基因在花瓣、雄蕊、心皮發(fā)育中具有決定作用［1］。然而，擬南芥中的SEP基因，包括SEP1（AGL2）、SEP2（AGL4）、SEP3（AGL9）和SEP4（AGL3），其發(fā)生單突變或雙突變不會(huì)引起明顯的表型變化，而sep1/sep2/sep3三突變體則會(huì)喪失花器官發(fā)育的確定性，導(dǎo)致所有花器官轉(zhuǎn)變?yōu)檩嗥?，在sep1/sep2/sep3/sep4四突變體中，不定花序的萼片被葉片所替代［2-3］。同時(shí)，Yoshida等［4］發(fā)現(xiàn)擬南芥AHG3（AtPP2CA）和ABI1均編碼蛋白磷酸酶2C（PP2C）蛋白，并參與ABA 信號(hào)的調(diào)節(jié)。然而擬南芥ahg3-1和abi1-1單突變體均表現(xiàn)出ABA 不敏感特性，而雙突變體ahg3-1/abi1-1的ABA 敏感性顯著強(qiáng)于其單突變體［4-5］。說(shuō)明MADSbox 和PP2C 等多基因家族中成員基因在調(diào)節(jié)相關(guān)生理生化過(guò)程中存在功能冗余［6-8］。在這種情況下，單個(gè)的基因突變或者敲除往往難以觀察到相應(yīng)的性狀，故不利于研究這些基因的生物學(xué)功能。

在研究多基因家族成員的基因功能時(shí)，往往需要利用單突變體并通過(guò)遺傳雜交構(gòu)建雙突變或多突變體的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)多基因功能研究。然而，這個(gè)過(guò)程復(fù)雜且周期較長(zhǎng)，需要耗費(fèi)大量的人力和物力，同時(shí)還受到突變體資源的嚴(yán)重限制。目前，研究人員主要通過(guò)各種正向遺傳學(xué)（forward genetics）和反向遺傳學(xué)（reverse genetics）手段解析植物的基因功能，RNAi 技術(shù)則是其中最為重要的技術(shù)手段之一［9］。RNAi 技術(shù)能有效地實(shí)現(xiàn)基因沉默，通過(guò)抑制基因表達(dá)水平來(lái)探究目標(biāo)基因的功能。該技術(shù)具有高效性、特異性和可遺傳等特點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于植物基因功能研究［10-14］。然而，傳統(tǒng)的RNAi 體系一般只能使1-2 個(gè)基因沉默［15］，很難讓多個(gè)基因同時(shí)沉默。雖然，有研究報(bào)道通過(guò)保守區(qū)廣泛脫靶來(lái)實(shí)現(xiàn)多基因干擾沉默，但是其特異性不強(qiáng)，而且靶向目標(biāo)具有隨機(jī)性和不確定性［16-18］。因此，構(gòu)建靶向精準(zhǔn)、高效和可控的多基因RNAi 體系，對(duì)于同時(shí)研究多基因功能，尤其是研究基因間的功能冗余和協(xié)同互作具有重要意義。

為了構(gòu)建有效多基因的干擾體系，本文對(duì)載體pCAMBIA1301 進(jìn)行改造，構(gòu)建了有效的多基因干擾體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 載體。A 組PP2C 成員是ABA 信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，成員之間在調(diào)控ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中存在功能的冗余［4，8］。因此本文選取系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較為接近的PP2C 家族A組4 個(gè)基因，包括Solyc03g121880.2.1（SlPP2C1）、Solyc12g096020.1.1（SlPP2C2）、Solyc08g062650.2.1（SlPP2C3）和Solyc07g040990.2.1（SlPP2C4），作為分析對(duì)象，利用本文構(gòu)建的多基因干擾體系，構(gòu)建出四基因干擾載體。再通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入番茄中，獲得了四基因干擾的轉(zhuǎn)基因番茄植株，并分析了目標(biāo)基因的干擾效率和轉(zhuǎn)基因番茄種子對(duì)ABA 的敏感性，證明本文開(kāi)發(fā)的多基因干擾體系的有效性。本文為靶向精準(zhǔn)、高效和可控的多基因RNAi 提供重要工具和技術(shù)體系，對(duì)于同時(shí)研究多基因功能，尤其是研究基因間的功能冗余和協(xié)同互作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本文使用pCAMBIA1301 載體作為構(gòu)建多基因干擾載體體系的原始載體。使用Micro-Tom 番茄（Solanum lycopersicumcv.Micro-Tom）作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，用于多基因RNAi 體系的效用分析。實(shí)驗(yàn)材料均種植在溫度（25±2）℃，光強(qiáng)7 000 Lux，相對(duì)濕度80%，光周期14 h/10 h（晝/夜）的溫室中。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建多基因干擾體系 本文對(duì)pCAMBIA1301載體的多克隆位點(diǎn)（multiple clone site，MCS）區(qū)域進(jìn)行改造，構(gòu)建多基因干擾體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s。具體構(gòu)建步驟如下：

（1）pCAMBIA1301m 的構(gòu)建。首先設(shè)計(jì)一個(gè)包含CaMV 35s 啟動(dòng)子，PDK 內(nèi)含子和NOS 終止子的表達(dá)盒，并命名為RNAi-E-cassette。表達(dá)盒中設(shè)置3 個(gè)MCS，其中MCS1 位于CaMV 35s 啟動(dòng)子和PDK內(nèi)含子之間，含4 個(gè)限制性位點(diǎn)Hind III、XbaI、SalI 和PstI；MCS2 位于PDK 內(nèi)含子和NOS 終止子之間，含5 個(gè)限制性位點(diǎn)KpnI、XmaI、Eco53k I、SmaI 和SacI；MCS3 位于CaMV 35s 啟動(dòng)子5'端上游，含6 個(gè)限制位點(diǎn)SpeI、HpaI、StuI、EcoR I、ApaI和AscI。同時(shí)，對(duì)pCAMBIA1301 載體中T-DNA 區(qū)域內(nèi)的潮霉素抗性基因，用限制性酶AatII 和PspXI酶切去除，替換成卡拉霉素抗性基因。

接下來(lái)，在RNAi-E-cassette 表達(dá)盒MCS3 和NOS 終止子的3'端下游分別添加限制性位點(diǎn)SwaI和BamH I，將RNAi-E-cassette 改造成RNAi-E-cassette-E。并在RNAi-E-cassette-E 的上游5'端添加一段與pCAMBIA1301 同源的30 bp 序列ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG，在其下游3'端添加另一段30 bp 序列AGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT，形成一個(gè)新的表達(dá)盒片段，將其命名為RNAi-E-cassette-E2。

由于原始載體pCAMBIA1301 上隱藏的限制性位點(diǎn)SmaI 可能會(huì)影響表達(dá)盒的使用。為了去除SmaI 限制性位點(diǎn)，通過(guò)人工合成pCAMBIA1301 載體上9 941-10 800 的核酸片段（5'存在AatII 位點(diǎn)GACGTC，3' 存在BstXI 位點(diǎn)CCANNNNNNTGG），將其中9 985 位置的堿基G（位于SmaI 識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)）替換為C，并將其命名為Fragment-Delete-SmaI。隨后，利用限制性?xún)?nèi)切酶AatII 和BstXI 酶切除原始pCAMBIA1301 載體上的相應(yīng)序列，用Fragment-Delete-SmaI 片段替換，將新載體命名為pCAMBIA1301-Delete-SmaI。之后用限制性酶內(nèi)切酶EcoR I 和Hind III 切除pCAMBIA1301-Delete-SmaI 的MCS，再通過(guò)同源重組將RNAi-E-Cassette-E2 連接到pCAMBIA1301-Delete-SmaI 載體上，形成一個(gè)新載體，將其命名為pCAMBIA1301m。

（2）pCAMBIA1301s 的構(gòu)建。使用與pCAMBIA1301m 相同的方法構(gòu)建pCAMBIA1301s。首先構(gòu)建表達(dá)盒RNAi-E-cassette，隨后，將限制性酶切位點(diǎn)SwaI、PmeI 和BamH I 添加到NOS 終止子3' 下游，將RNAi-E-cassette 改造成RNAi-E-cassette-C。然后，在RNAi-E-cassette-C 上游5'端添加一段與pCAMBIA1301 同源的30 bp 序列ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG，在其下游3'端添加另一段30 bp 序列AGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGT，形成一個(gè)新片段，將其命名為RNAi-Ecassette-C2。再將RNAi-E-cassette-C2 連接到pCAMBIA1301-Delete-SmaI 載體上，獲得了一個(gè)新載體，將其命名為pCAMBIA1301s。

（3）多基因盒干擾載體使用方法。本文構(gòu)建的多基因干擾體系由包括pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 兩個(gè)載體組成。兩個(gè)載體均可通過(guò)Hind III、PstI、SalI 和XbaI 酶切位點(diǎn)導(dǎo)入目標(biāo)基因的正向干擾片段，通過(guò)KpnI、XmaI、Eco53k I、SmaI 和SacI 酶切位點(diǎn)導(dǎo)入目標(biāo)基因的反向干擾片段，形成完整的目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒。隨后，用MCS3 區(qū)段內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)SpeI、HpaI、StuI和NOS 終止子3'端下游的限制性酶切位點(diǎn)PmeI、SwaI 將pCAMBIA1301s 上的完整的目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒切下，并連接到pCAMBIA1301m 的35S 啟動(dòng)子之前的SpeI、SwaI、HpaI、StuI 酶切缺口位置，形成雙表達(dá)盒的四基因干擾載體，同時(shí)載體保留下一個(gè)從pCAMBIA1301s 切下的表達(dá)盒接入的位點(diǎn)，以此實(shí)現(xiàn)連續(xù)構(gòu)建完整目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒的目的，因此有利于多基因同時(shí)干擾或共沉默。

1.2.2 干擾基因篩選及生物信息學(xué)分析 本文從番茄數(shù)據(jù)庫(kù)（https://solgenomics.net/）篩選到的13個(gè)PP2C基因，通過(guò)與擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/）中篩選得到的擬南芥PP2C基因構(gòu)建PP2C基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。本文用MEGA7.0 中的clustalW 對(duì)上述基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，并用Neighbor-Joining method 法進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建，Bootstrap 參數(shù)設(shè)為1 000；Model/Method 參數(shù)設(shè)為p-distance；Gaps/Missing Data Treatment 參數(shù)設(shè)為Pairwise delection。從中選擇具有較近的同源關(guān)系的4 個(gè)PP2C基因，并將它們重新命名：SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4，如表1所示。并通過(guò)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)的Conserved Domain Search Service（CD search），并結(jié)合MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）分析其PP2C 保守結(jié)構(gòu)域，以確定其是否為PP2C 家族成員。

表1 本文分析的4 個(gè)PP2C 基因的相關(guān)信息Table 1 Information of four PP2C genes used in this paper

1.2.3 四基因干擾載體的構(gòu)建 為了實(shí)現(xiàn)4 個(gè)PP2C基因被特異性干擾，同時(shí)避開(kāi)其基因家族的保守功能區(qū)域，本文選取這些基因近編碼區(qū)3'端區(qū)域內(nèi)的250-500 bp 片段作為干擾片段。采用Overlap PCR技術(shù)將SlPP2C1和SlPP2C2的干擾片段連接形成一個(gè)融合片段（A 片段），SlPP2C3和SlPP2C4的干擾片段連接形成另一個(gè)融合片段（B 片段）。然后，將A 片段和B 片段的正向和反向片段分別連接到多基因干擾載體體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s的正向和反向位點(diǎn)上，形成pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2 和pCAMBIA1301s ：35S∷SlPP2C3-4。接著用SpeI 和SwaI 將35S∷SlPP2C3-4 表達(dá)盒從載體pCAMBIA1301s：35S∷SlPP2C3-4 上切下來(lái)，連接到載體pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2 上，由此形成雙表達(dá)盒的pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4 載體。引物設(shè)計(jì)使用Primer5，在SlPP2C1和SlPP2C3干擾片段的F 引物5'端添加SacI 和SalI（酶切點(diǎn)ACGCGTCGACGAGCTC，同時(shí)在SlPP2C2和SlPP2C4干擾片段的R 引物5'端添加SmaI 和XbaI 酶切位點(diǎn)TCCCCCGGGTCTAGA，引物序列見(jiàn)表2。

1.2.4 番茄遺傳轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株鑒定 將構(gòu)建的四基因干擾載體pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4，借助農(nóng)桿菌GV3101 導(dǎo)入番茄Micro-Tom中，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。隨后，通過(guò)GUS 染色和PCR 對(duì)T0轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)。PCR 使用寡核苷酸Loop-JC-F 和Loop-JC-R 作為鑒定引物（表2）。去除T0代假陽(yáng)性植株后，將鑒定到的陽(yáng)性植株命名為35S∷SlPP2C1-2-3-4，并對(duì)陽(yáng)性植株分別種植、單株收種。T0代轉(zhuǎn)基因番茄種子經(jīng)1/2 MS 固體培養(yǎng)基（卡拉霉素，100 mg/L）抗性篩選后，種植在溫室中，繁育子代轉(zhuǎn)基因植株，用于進(jìn)一步的生理生化分析。

1.2.5 RT-qPCR 檢測(cè)與干擾效率分析 為檢測(cè)目標(biāo)基因的干擾效率，取T1（T1-1、T1-2、T1-3、T1-4）和T2（T2-1、T2-2、T2-3 和T2-4）代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄的成熟葉片，用野生型（WT）番茄葉片作對(duì)照，用QIAGEN RNeasy Plant mini 試劑盒（Qiagen，德國(guó)）提取總RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa，日本）將總RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)干擾植株中各PP2C基因的表達(dá)水平。將上述cDNA 為模板，以SlUBI（Solanum lycopersicum Ubiquitin，NM_001346406.1）作為內(nèi)參基因（引物序列見(jiàn)表2），用TB Green TM Premix EX Taq TM II（TaKaRa，日本）進(jìn)行RT-qPCR 分析，以探究多基因干擾植株的干擾效率。使用金斯瑞（https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqmanprimer-design-tool）在線設(shè)計(jì)RT-qPCR 引物（引物序列見(jiàn)表2）。使用CFX96 Real-Time PCR 儀（Bio-rad，美國(guó)），RT-qPCR 程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，39 次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCt統(tǒng)計(jì)分析。RT-qPCR 定量分析時(shí)，將WT 中基因的相對(duì)表達(dá)值設(shè)置為1，用轉(zhuǎn)基因植株中基因的相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示其基因的表達(dá)水平。

表2 本文使用的所有引物Table 2 All primers used in this study

1.2.6 干擾后的番茄轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA 敏感性檢測(cè) 本文以種子萌發(fā)率為指標(biāo)，分析轉(zhuǎn)基因番茄種子的ABA 敏感性。首先設(shè)置不同的ABA 濃度梯度，篩選番茄野生型（WT）種子對(duì)ABA 敏感的最適濃度：選取600 顆飽滿的番茄WT 種子接種在含有不同ABA 濃度梯度的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，觀察和統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況。ABA 設(shè)置4 個(gè)濃度梯度，分別為1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 和10 μmol/L，用雙蒸水（Mock）處理作對(duì)照。每個(gè)梯度設(shè)置4 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理30 顆種子。以種子胚根露白為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)9 d。

隨后，將上述實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的最適濃度（5 μmol/L ABA）用于處理轉(zhuǎn)基因植株種子，雙蒸水（Mock）作為對(duì)照。新采收的T1代轉(zhuǎn)基因株系（T1-1、T1-2 和T1-3）種子用ABA 處理，萌發(fā)條件同上，以WT 種子為對(duì)照。通過(guò)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率，計(jì)算相對(duì)萌發(fā)率（相對(duì)萌發(fā)率=ABA（5 μmol/L）處理的種子萌發(fā)率/無(wú)ABA 處理種子萌發(fā)率），獲得干擾后的番茄種子對(duì)ABA 的敏感性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建多基因載體體系

為了實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)干擾，本文對(duì)原始載體pCAMBIA1301（圖1-A）進(jìn)行改造，構(gòu)建了多基因干擾體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 載體（圖1-B-C）。載體pCAMBIA1301 的T-DNA 區(qū)域位于兩個(gè)轉(zhuǎn)座邊界Right Border repeat T-DNA（RB）（2 350-2 374 bp）和Left Border repeat T-DNA（LB）（8 628-8 652 bp）之間，包含一個(gè)LacZ 基因和兩個(gè)35S 啟動(dòng)子，其中LacZ 基因用于藍(lán)白斑篩選，一個(gè)35S增強(qiáng)啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)潮霉素抗性基因表達(dá)，另一個(gè)35S 啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)GUS 基因表達(dá)。T-DNA 區(qū)域外含有一個(gè)卡那霉素抗性基因標(biāo)簽。pCAMBIA1301被廣泛用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，然而該載體只能實(shí)現(xiàn)單基因干擾，具有較大的局限性。而本文改造形成的多基因干擾體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 載體（圖1-B-C），能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)干擾的目的，有利于同時(shí)分析多個(gè)基因的功能。

多基因干擾體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 載體的目標(biāo)基因表達(dá)盒中均包含MCS3、MCS1 和MCS2 三個(gè)多克隆位點(diǎn)，MCS1 區(qū)段內(nèi)包含黏性末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)Hind III、PstI、SalI 和XbaI，用于導(dǎo)入目標(biāo)基因的正向干擾片段；MCS2區(qū)段中具有黏性末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)KpnI、XmaI 和SacI，以及平末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)Eco53k I和SmaI，用于導(dǎo)入目標(biāo)基因的反向干擾片段。載體pCAMBIA1301m 的MCS3 區(qū)段包含限制性酶切位點(diǎn)粘性末端限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)SpeI 以及平末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)SwaI、HpaI 和StuI，作為下一個(gè)表達(dá)盒載入的接口。載體pCAMBIA1301s 的MCS3 區(qū)段包含的粘性末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)SpeI 以及平末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)HpaI 和StuI，并在NOS 終止子3'端具有平末端限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)PmeI 和SwaI，用于切取pCAMBIA1301s 載體上完整的表達(dá)盒（圖1-B-C）。

多基因干擾載體體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s 使用時(shí)，需要在目標(biāo)基因正向干擾片段上，添加MCS1 區(qū)段內(nèi)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)；在反向片段上添加MCS2 區(qū)段內(nèi)對(duì)應(yīng)的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，才能形成一個(gè)完整的干擾表達(dá)盒。在實(shí)際操作時(shí)，需要從PmeI 和SwaI 中選取一個(gè)平末端限制性?xún)?nèi)切酶，與粘性末端限制性?xún)?nèi)切酶SpeI 組合，才能完整切取pCAMBIA1301s 上的干擾表達(dá)盒，再連接pCAMBIA1301m 上，從而實(shí)現(xiàn)將兩個(gè)表達(dá)盒串聯(lián)于同一個(gè)干擾載體的目的，同時(shí)，也保證在載體pCAMBIA1301s 上始終保留有限制性?xún)?nèi)酶切位點(diǎn)SpeI、HpaI 和StuI，作為下一個(gè)新的表達(dá)盒載入的接口，利于多個(gè)表達(dá)盒重復(fù)添加和串聯(lián)。該多基因干擾體系能有效實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因同時(shí)干擾，是同時(shí)研究多個(gè)基因的功能以及分析功能冗余基因的有效工具（圖1-D）。

圖1 多基因沉默載體系統(tǒng)Fig.1 Multi-genes silencing system

2.2 干擾基因篩選及生物信息學(xué)分析

為了驗(yàn)證多基因干擾體系的有效性，選用ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)核心元件PP2C 家族基因作為靶標(biāo)進(jìn)行多基因干擾。從番茄數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到13 個(gè)PP2C基因，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示，13 個(gè)PP2C基因均屬于A 組的PP2C 家族基因，其中4 個(gè)基因Solyc03g121880.2.1、Solyc12g096020.1.1、Solyc08g062650.2.1 和Solyc07g040990.2.1 具有較近的同源關(guān)系，這4 個(gè)基因可能在功能上具有一定關(guān)聯(lián)（圖2-A）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這4 個(gè)基因均具有完整的PP2Cc 超家族所特有的3 個(gè)保守區(qū)域（圖2-BC）。因此，選擇這4 個(gè)基因作為多基因干擾系統(tǒng)有效性檢驗(yàn)的靶標(biāo)基因，并將Solyc03g121880.2.1、Solyc12g096020.1.1、Solyc08g062650.2.1 和Solyc07g040990.2.1 分別命名為SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4。

圖2 四個(gè)PP2C 基因的生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of four PP2C genes

2.3 四基因干擾載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性篩選

利用多基因干擾載體體系構(gòu)建了四基因干擾載體pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4（圖3-A）。該載體中包含兩個(gè)完整干擾表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒介導(dǎo)SlPP2C1和SlPP2C2的融合干擾片段表達(dá)，讓SlPP2C1和SlPP2C2基因表達(dá)沉默，第二個(gè)表達(dá)盒介導(dǎo)SlPP2C3和SlPP2C4的融干擾片段表達(dá)，實(shí)現(xiàn)SlPP2C3和SlPP2C4基因沉默。因此，該四基因干擾載體能實(shí)現(xiàn)對(duì)4 個(gè)基因SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3、SlPP2C4的同時(shí)干擾。

通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，將四基因干擾載體pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4，導(dǎo)入Micro-Tom番茄，獲得四基因干擾番茄。隨后，用GUS 染色和PCR 法對(duì)四基因干擾的轉(zhuǎn)基因番茄的T0代植株進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。GUS 染色法鑒定結(jié)果顯示，T0代的T0-1、T0-2、T0-3 和T0-4 植株的葉片為藍(lán)色（圖3-B），而WT 植株葉片為白色。PCR 法驗(yàn)證結(jié)果顯示4 株T0植株均有清晰的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期結(jié)果基本一致（圖3-C）。鑒定結(jié)果說(shuō)明4 個(gè)目標(biāo)基因干擾片段均已成功轉(zhuǎn)入番茄體內(nèi)，T0-1、T0-2、T0-3 和T0-4 均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

圖3 SlPP2Cs 干擾載體構(gòu)建及陽(yáng)性植株檢測(cè)Fig 3 Construction of SlPP2 Cs silencing vector and detection of positive plants

2.4 目標(biāo)基因干擾效率檢測(cè)

為了探究多基因干擾系統(tǒng)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因番茄中SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4基因的干擾效率，本文用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)了這4 個(gè)基因在T1和T2代植株中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在T1（T1-1、T1-2、T1-3 和T1-4）和T2（T2-1、T2-2、T2-3 和T2-4）代四基因干擾番茄中SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于WT，這些基因均被顯著抑制，其干擾效率均高于70%（圖4-A-B），證明經(jīng)過(guò)改造后的多基因干擾體系對(duì)目標(biāo)基因具有良好的干擾效果，且T1和T2代的干擾效率基本一致。

2.5 轉(zhuǎn)基因番茄ABA敏感性分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證多基因干擾體系的效用性，分析了T2代轉(zhuǎn)基因番茄35S∷SlPP2C1-2-3-4 種子萌發(fā)對(duì)脫落酸的敏感性。結(jié)果顯示，與雙蒸水（Mock）處理相比，不同濃度ABA 處理均能抑制WT 番茄種子的萌發(fā)，而且ABA 濃度越高抑制作用越強(qiáng)（圖5-A）。雙蒸水處理的WT番茄種子從第1天開(kāi)始萌發(fā)，在4 d 時(shí)達(dá)到最大萌發(fā)率0.948±0.039，其后不再變化。1 μmol/L 與2 μmol/L 的ABA 處理的WT 番茄種子的萌發(fā)率變化趨勢(shì)與雙蒸水處理的趨勢(shì)基本一致，在第1 天時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，之后分別在第4 天和第5 天達(dá)到最大萌發(fā)率0.906±0.071 和0.948±0.021。而5 μmol/L 和10 μmol/L 的ABA 處理的WT 番茄種子的萌發(fā)明顯延遲，分別在接種后第2 和3 天才開(kāi)始萌發(fā)，其中5 μmol/L 的ABA 處理組在第9 天達(dá)到最大萌發(fā)率0.948±0.021，而10 μmol/L 的ABA 處理組到第9天也未達(dá)到峰值。結(jié)果表明，ABA 處理能抑制WT番茄種子的萌發(fā)，其中5 μmol/L 的ABA 濃度是顯著抑制WT 番茄種子萌發(fā)的最低有效濃度。因此，本文選擇5 μmol/L 為最佳ABA 處理濃度用于進(jìn)一步分析多基因干擾植株種子萌發(fā)對(duì)ABA 的敏感性。

使用5 μmol/L 的外源ABA 處理WT 番茄和T2代的多基因干擾番茄T2-1、T2-2 和T2-3 的種子，用雙蒸水處理作為對(duì)照。結(jié)果顯示雙蒸水處理的T2-1、T2-2 和T2-3 的種子萌發(fā)率與WT 無(wú)顯著差異；5 μmol/L 的ABA 能顯著抑制WT 番茄種子的萌發(fā)，其萌發(fā)率遠(yuǎn)低于雙蒸水處理的WT 種子萌發(fā)率。而ABA 處理轉(zhuǎn)基因番茄T2-1、T2-2 和T2-3 的種子萌發(fā)率顯著高于ABA 處理的WT 種子（圖5-B）。為了更為直觀地分析轉(zhuǎn)基因番茄種子ABA 敏感性變化的效率，本文計(jì)算了相對(duì)萌發(fā)率（相對(duì)萌發(fā)率=5 μmol/L ABA 處理萌發(fā)率/雙蒸水處理萌發(fā)率），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因番茄相對(duì)萌發(fā)率遠(yuǎn)高于WT 相對(duì)萌發(fā)率。這些結(jié)果表明番茄的4 個(gè)PP2C的目標(biāo)基因被同時(shí)干擾后，其種子在萌發(fā)方面表現(xiàn)出明顯的ABA 不敏感性（圖5-C）。證明本文經(jīng)過(guò)改造的多基因干擾載體系統(tǒng)能很好地實(shí)現(xiàn)多基因的同時(shí)干擾，可用于解析基因間功能冗余和研究多個(gè)基因的功能。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA 敏感性檢測(cè)Fig.5 Sensitivity test of transgenic RNAi plants to exogenous ABA

3 討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，受眾多基因的調(diào)控，其中往往涉及多基因家族的成員，但其部分成員之間常存在功能冗余［19］。在解析植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中這些基因功能和調(diào)控關(guān)系時(shí)，通常會(huì)使用基因敲除或過(guò)表達(dá)等技術(shù)［1，20］。然而，基因間的功能冗余導(dǎo)致單基因敲除的遺傳效應(yīng)難以被檢測(cè)，從而限制了對(duì)這些基因的生物學(xué)功能的全面認(rèn)識(shí)［19］。因此，多基因操作體系對(duì)于探究基因的功能及其相互之間的功能冗余具有重要意義。傳統(tǒng)基因功能分析，如誘變法構(gòu)建突變體等手段，雖然較為有效，但由于誘變具有不確定性、冗余基因的多突變體獲得極為困難、研究周期漫長(zhǎng)等缺點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了冗余基因的功能研究［21］。目前，RNAi 等技術(shù)作為研究基因表達(dá)調(diào)控和鑒定基因功能的重要技術(shù)，具有效率高和特異性強(qiáng)的特征［22-24］，被廣泛運(yùn)用于擬南芥［25］、大豆［26］、蕓薹［27］等植物的研究。但是，傳統(tǒng)的RNAi 體系通常針對(duì)單基因干擾，對(duì)于研究多基因控制的植物性狀具有局限性。因此，多基因干擾體系的構(gòu)建對(duì)于同時(shí)研究植物的多個(gè)基因的功能具有重要意義，尤其對(duì)于研究冗余基因的功能極為重要。

本文以pCAMBIA1301 為基礎(chǔ)改造獲得的多基因干擾載體體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s，在結(jié)構(gòu)上均包含3 個(gè)多克隆位點(diǎn)MCS3、MCS1 和MCS2。該體系能通過(guò)MCS1 和MCS2 分別導(dǎo)入目標(biāo)基因的正向和反向干擾片段，構(gòu)建完整的目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒。pCAMBIA1301m 的多克隆位點(diǎn)MCS3包含黏性末端酶切位點(diǎn)SpeI，以及平末端HpaI、SwaI 和StuI，該多克隆位點(diǎn)為pCAMBIA1301s載體上酶切獲得的目標(biāo)基因表達(dá)盒提供接入位點(diǎn)。而pCAMBIA1301s 載體MCS3 上包含酶切位點(diǎn)SpeI、HpaI 和StuI，并在NOS 終止子下游區(qū)域包含平末端酶切位點(diǎn)SwaI 和PmeI，能有效保證pCAMBIA1301s 載體上的目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒被完整切下，并與pCAMBIA1301m 的MCS3 上的接入位點(diǎn)有效對(duì)接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒串聯(lián)于同一個(gè)干擾載體上。此外，pCAMBIA1301s上完整的目標(biāo)基因干擾表達(dá)盒被切取，并連接到pCAMBIA1301m 上后，仍然保留了酶切位點(diǎn)SpeI 和HpaI 和StuI，作為下一個(gè)表達(dá)盒接入的位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)表達(dá)盒的重復(fù)添加和多次串聯(lián)，對(duì)于研究多基因同時(shí)干擾具有重要意義。

在之前的報(bào)道中，He 等［28］和Wang 等［29］在動(dòng)物多基因沉默的研究中，先后開(kāi)發(fā)了可用于多個(gè)siRNA 同時(shí)表達(dá)的pSOK、BSG 和FAMSi 系統(tǒng)，逐步克服了構(gòu)建周期長(zhǎng)，表達(dá)效率低，操作復(fù)雜和經(jīng)驗(yàn)依賴(lài)性高的難題，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)siRNA 表達(dá)盒的快速組裝和表達(dá)，并廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的多基因功能研究，為開(kāi)發(fā)基于siRNA 的基因治療技術(shù)提供了重要工具，也為本研究提供了重要的經(jīng)驗(yàn)參考。目前，在植物的基因功能研究中，急需類(lèi)似的多基因干擾系統(tǒng)，但暫未見(jiàn)報(bào)道。此前，陳任等［30］基于根瘤農(nóng)桿菌（A.tumefaciens）Ti 質(zhì)粒pBI121 和大腸桿菌（E.coli）質(zhì)粒pUC18，構(gòu)建了適用于植物的多基因表達(dá)系統(tǒng)pKAFCR80 和pKAFCR100，克服了植物基因表達(dá)載體酶切位點(diǎn)有限和目的片段插入困難等技術(shù)難題。陳立志［31］利用Cre/loxP 多基因載體重組技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)，將椰子的3 個(gè)基因FatB3、LPAAT和KASI進(jìn)行操作，構(gòu)建了兩基因組合載體FatB3-LPAAT和FatB3-KASI，及三基因組合載體FatB3-LPAAT-KASI，實(shí)現(xiàn)了2 個(gè)或3 個(gè)基因的同時(shí)過(guò)表達(dá)。然而，這些載體系統(tǒng)均為過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)植物的多基因干擾。本研究所構(gòu)建的多基因干擾載體體系，在植物中有效地實(shí)現(xiàn)了多個(gè)基因的同時(shí)干擾。此外，該系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、高效、不易受酶切位點(diǎn)限制等優(yōu)點(diǎn)，有效地解決了冗余基因的功能研究中，多突變體獲得困難和研究周期漫長(zhǎng)的難題。

體系的效用性是載體系統(tǒng)應(yīng)用價(jià)值的核心要素，是載體系統(tǒng)廣泛應(yīng)用的前提。He 等［28］和Wang等［29］開(kāi)發(fā)的pSOK、BSG 和FAMSi 系統(tǒng)，通過(guò)體內(nèi)和體外的生物功能驗(yàn)證，鑒定其體系的效用性，并在動(dòng)物基因功能研究中成功應(yīng)用。陳任等［30］報(bào)道，將3 個(gè)甜葉菊葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，轉(zhuǎn)移到pKAFCR80 和pKAFCR100 載體系統(tǒng)中，并通過(guò)菌落PCR 鑒定了單基因、雙基因和三基因表達(dá)載體被成功構(gòu)建。陳立志［31］將載體FatB3-LPAAT、FatB3-KASI和FatB3-LPAAT-KASI轉(zhuǎn)移到擬南芥中，通過(guò)PCR 技術(shù)成功鑒定到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，RT-qPCR 分析這些基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量，并分析了這些基因?qū)雽?duì)脂肪酸含量的影響，驗(yàn)證了其系統(tǒng)的有效性。本研究改造獲得的多基因干擾載體體系，對(duì)4 個(gè)基因SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4構(gòu)建了四基因干擾載體。通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)敕押?，獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株35S∷SlPP2C1-2-3-4。進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因番茄植株的干擾效率和轉(zhuǎn)基因番茄ABA 敏感性，結(jié)果顯示多基因干擾后的T1和T2代轉(zhuǎn)基因番茄植株株系中，4 個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)水平均顯著低于WT 番茄，干擾效率均高于70%。SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4同時(shí)干擾顯著改變了T2代轉(zhuǎn)基因番茄種子萌發(fā)對(duì)ABA 的敏感性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄種子在ABA 處理?xiàng)l件下的萌發(fā)率和相對(duì)萌發(fā)率均顯著高于WT。結(jié)果表明該多基因干擾體系，能夠有效實(shí)現(xiàn)多基因的同時(shí)干擾，具有特異性和高效性。本研究通過(guò)一系列的驗(yàn)證，不僅鑒定了該體系的效用性，并在植物基因功能研究中進(jìn)行了應(yīng)用實(shí)踐。

本研究改造的多基因干擾載體，能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)單、雙以及多基因的同時(shí)干擾，能夠有效應(yīng)用于多基因功能研究，并解析基因間功能冗余。該多基因干擾體系為植物的基因功能研究和基因間的功能冗余解析提供了重要的方法和分子工具。

4 結(jié)論

對(duì)pCAMBIA1301 載體進(jìn)行改造，形成多基因干擾載體體系pCAMBIA1301m 和pCAMBIA1301s，利用該體系對(duì)番茄中的PP2C 家族4 個(gè)基因SlPP2C1、SlPP2C2、SlPP2C3和SlPP2C4構(gòu)建四基因干擾載體SlPP2C1-2-3-4。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得四基因干擾的轉(zhuǎn)基因番茄植株35S∷PP2C1-2-3-4。T1和T2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中的4 個(gè)目標(biāo)基因的干擾效率均高于70%，并且顯著改變了T2代轉(zhuǎn)基因番茄種子萌發(fā)對(duì)ABA的敏感性。