郭寶文， 朱俊英， 李 煦， 榮峻峰， 宗保寧

(中石化石油化工科學研究院有限公司，北京 100083)

含氮芳烴類化合物是一類重要的工業(yè)原料，廣泛應用于炸藥、農(nóng)藥、染料和醫(yī)藥等行業(yè)[1]。這類化學物質往往具有致癌性、致突變性和致畸性，一旦通過工業(yè)廢水或直接施用于土壤釋放到環(huán)境中，將對水生生物群產(chǎn)生不利影響，并對人類健康構成嚴重威脅[2-3]。王洪斌等[4]研究了硝基苯和間苯二酚對海洋微藻的毒理效應，發(fā)現(xiàn)硝基苯和間苯二酚對塔瑪藻和巴夫藻的生長具有一定的抑制作用。邱海源等[5]研究發(fā)現(xiàn)苯胺對鹽藻、三角褐指藻有明顯的毒性作用。苯胺、硝基苯作為典型的含氮芳烴類化合物，由于具有高度的生態(tài)生物毒性己經(jīng)被列入“中國環(huán)境優(yōu)先控制污染物黑名單”中[6]，在工業(yè)排水中要求嚴格控制其含量。此外，美國環(huán)境保護局(1994年)和歐共體聯(lián)合研究中心(2004年)也將其歸為“優(yōu)先控制的有毒、有機污染物”，進行了嚴格的立法管制[7]。

藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的基礎，對環(huán)境變化十分敏感，因此被用作生態(tài)風險評估的指標，以評估水中污染物的影響。利用廢水培養(yǎng)微藻可以將廢水中的氮、磷等物質轉化為可用于生物能源、動物飼料和高價值產(chǎn)品的生物質，因而被認為是一種有前途的廢水處理方式[8]。利用廢水養(yǎng)殖藻類可以達到雙重目的：一方面可以將廢水中的氮、磷去除并作為自身的營養(yǎng)物質；另一方面，生產(chǎn)的高價值生物質可以降低廢水處理的成本[9]。

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是一種典型的淡水藻類，在生態(tài)毒理學研究中經(jīng)常用作水生生物模型[10]。蛋白核小球藻蛋白質含量豐富、生長速度快，是理想的蛋白質來源。通過評估苯胺和硝基苯對蛋白核小球藻的毒性作用，根據(jù)污染物濃度、藻類生長以及氧化應激和脂質過氧化指標的變化，探索污染物對蛋白核小球藻的潛在毒性機制，并評估蛋白核小球藻對硝基苯和苯胺降解的影響。

1 實驗部分

1.1 藻種和試劑

蛋白核小球藻，中國石化石油化工科學研究院藻種庫提供。苯胺(C6H7N，純度> 99%)、硝基苯(C6H5NO2，純度>99%)、丙酮(C3H6O)分析純，購自北京伊諾凱科技有限公司。植物蛋白裂解液購自生工生物工程(上海)股份有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 藻種預培養(yǎng)

配制Basal培養(yǎng)基[11]，高溫、高壓滅菌后備用。無菌條件下，在250 mL三角瓶中加入150 mL培養(yǎng)基，接入藻種，置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。條件為：光照強度55 μmol/(m2·s)，光周期(光照時間/黑暗時間的比值)14 h/10 h，溫度(28±1) ℃，轉速150 r/min，初始pH值6.1。

1.3 生長抑制實驗

通過離心收獲處于指數(shù)生長期的蛋白核小球藻，并重新懸浮在無菌的新鮮Basal培養(yǎng)基中，葡萄糖質量濃度為10 g/L。分別加入苯胺(終質量濃度分別為10、50、100、300、500 mg/L)或硝基苯(終質量濃度分別為10、30、50、100 mg/L)進行實驗作為處理組，未加入苯胺或硝基苯作為空白組。每個梯度設置3個平行樣品，搖勻，置于光照培養(yǎng)箱與預培養(yǎng)相同的條件下培養(yǎng)48 h。

1.4 測定方法

1.4.1 藻生長測定

采用吸光度法對蛋白核小球藻生長進行測定，以接種時刻為初始時間，每12 h取適量藻液經(jīng)適當稀釋后使用上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn)的754紫外-可見分光光度計在波長680 nm下測定吸光值。蛋白核小球藻生物質質量濃度(C，g/L)通過單位體積藻液干重進行計算，具體取5 mL藻液于預先稱重的0.22 μm的纖維素濾膜上抽濾，去離子水沖洗3次后，置于105 ℃烘箱中烘3 h至恒重，減去空濾膜質量后即為5 mL藻液生物質質量濃度。

為了評價硝基苯和苯胺對蛋白核小球藻生長的抑制作用，根據(jù)Zhang等[12]提供的公式計算生長抑制率(Id,%)。抑制率計算公式如式(1)所示。

(1)

式中：C0和Ci分別為空白組和處理組培養(yǎng)48 h的微藻生物質質量濃度，g/L。使用AAT BioQuest提供的EC50在線計算器(https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator/)計算蛋白核小球藻對苯胺和硝基苯的半最大效應濃度(EC50)[13]。

1.4.2 光合色素含量測定

取適量藻液經(jīng)離心去掉上清液，加入2 mL質量分數(shù)80%丙酮于4 ℃暗處理24 h。再次離心后，將微藻提取液適當稀釋后使用分光光度計在663、645和470 nm波長處測量提取液的吸光值。使用式(2)～式(4)計算光合色素葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)的質量分數(shù)[14]。

(2)

(3)

(4)

式中：w(Chl a)、w(Chl b)、w(Car)分別為葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質量分數(shù)，mg/g；A663、A645、A470分別為光合色素提取液在波長663、645、470 nm下的吸光度；F為稀釋倍數(shù)；V為所取藻液體積，mL；m為所取藻液干重，g。

1.4.3 葉綠素熒光參數(shù)測定

為進一步研究苯胺、硝基苯對蛋白核小球藻光合活性影響，取5 mL藻液暗適應5 min后，使用德國Walz公司生產(chǎn)的DUAL-PAM葉綠素熒光儀對Fv、Fm、F0和Fs測量，并通過計算獲得Fv/Fm和YⅡ。計算如式(5)～式(6)所示。

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

(5)

YⅡ=(Fm-Fs)/Fm

(6)

式中：Fv/Fm為光合作用系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學量子產(chǎn)量；YII為光化學有效量子產(chǎn)量；F0為暗適應狀態(tài)下的最小熒光產(chǎn)量(也稱為初始熒光)；Fm為暗適應狀態(tài)下的最大熒光產(chǎn)量；Fv為可變熒光，是F0與Fm的差值。Fs為穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量。

1.4.4 抗氧化酶活性檢測

微藻培養(yǎng)物在4 ℃下離心收獲細胞。收集的細胞在PBS緩沖液中進行清洗和復蘇。復蘇的藻細胞置于寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn)的JY-ⅡN超聲波細胞粉碎儀中200 W下破碎10 min。破碎處理后，將細胞勻漿于4 ℃下10000 r/min離心5 min，上清液用于總蛋白、抗氧化酶和丙二醛(MDA)的測定。采用試劑盒測定總蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和丙二醛(MDA)含量。SOD、POD和MDA的測定結果均按照總蛋白含量進行歸一化處理，以消除測定結果的偏差。

1.4.5 蛋白質提取和分析

在實驗結束時從空白組和處理組中取5 mL藻液，經(jīng)5000 r/min離心5 min，去上清液后加5 mL植物蛋白的裂解液，于超聲波細胞破碎儀中200 W下破碎10 min，5000 r/min離心5 min后取上清液待測。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定微藻中蛋白質含量。

1.4.6 苯胺和硝基苯含量測定

為探究微藻對苯胺、硝基苯降解的影響，分別在含質量濃度100 mg/L苯胺和30 mg/L硝基苯的培養(yǎng)基中接種蛋白核小球藻，以不接種微藻作為對照組，在1.3節(jié)中所述條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間每12 h收集培養(yǎng)液，離心后，上清液用于苯胺和硝基苯含量檢測。采用安捷倫公司生產(chǎn)的1260 Infinity Ⅱ HPLC高效液相色譜進行分析，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL，所使用的色譜柱為反向C-18柱(250 mm×5 mm)，柱溫30 ℃。流動相為甲醇和水的混合物，體積比為40∶60，流速為1 mL/min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)圖使用軟件Origin 2021繪制，實驗數(shù)據(jù)均為3個平行樣的平均值±標準偏差。實驗數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 24進行顯著性差異分析，顯著性水平p<0.05。

2 結果與討論

2.1 苯胺和硝基苯對蛋白核小球藻生長的影響

圖1為不同質量濃度的苯胺和硝基苯下蛋白核小球藻的生長曲線。由圖1可以看出：與不添加苯胺、硝基苯的樣品相比，添加質量濃度低于100 mg/L的苯胺或低于10 mg/L的硝基苯對蛋白核小球藻的生長沒有明顯的抑制作用；與此相反，質量濃度高于100 mg/L的苯胺和高于30 mg/L的硝基苯的加入顯著抑制了蛋白核小球藻的生長，并且抑制作用隨苯胺、硝基苯質量濃度的增加而增強，表現(xiàn)出明顯的劑量-效應關系。許多研究表明含氮芳烴類污染物對微藻毒性表現(xiàn)出劑量-效應關系，如Krishna等[15]研究了紡織染料亞甲基藍對普通小球藻和鈍頂螺旋藻的毒性，結果表明，隨著染料濃度的增加，生長抑制率成比例增加；Du等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的硝基苯(10 mg/L)處理對漢氏裸藻的生長沒有明顯的抑制作用，硝基苯質量濃度50 mg/L下在2 d內對藻細胞生長表現(xiàn)出輕度的抑制，2 d后抑制逐漸消失；質量濃度100 mg/L硝基苯脅迫顯著抑制了漢氏裸藻的生長。研究中，蛋白核小球藻暴露于質量濃度100 mg/L的苯胺24 h和48 h后生長抑制率分別為25.5%和2.4%，暴露于質量濃度10 mg/L的硝基苯24 h和48 h后生長抑制率分別為11.4%和3%。生長抑制作用主要表現(xiàn)在對數(shù)生長期，蛋白核小球藻對苯胺和硝基苯的48 h半最大效應濃度(EC50)分別為648.6和47.1 mg/L，表明蛋白核小球藻對苯胺的耐受劑量要顯著高于硝基苯。

OD680—Algal cell density圖1 暴露于不同質量濃度苯胺和硝基苯下蛋白核小球藻的生長曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa exposed to different concentrations of aniline and nitrobenzene(a) Aniline； (b) NitrobenzeneCulture conditions: Light intensity 55 μmol/(m2·s); Light/Dark cycle time 14 h/10 h; T=(28±1) ℃

2.2 苯胺和硝基苯對蛋白核小球藻光合色素含量的影響

光合色素(葉綠素a、b和類胡蘿卜素)在光能的吸收和轉化中起著重要作用。當藻類暴露在有毒物質中時，會對藻類中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的合成產(chǎn)生負面影響[15]。因而，在這種環(huán)境脅迫條件下，微藻的色素含量通常被用作敏感參數(shù)[17-18]。筆者評估了蛋白核小球藻暴露于不同質量濃度苯胺和硝基苯的光合色素含量變化情況，結果如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可知：光合色素含量隨培養(yǎng)時間的延長而呈下降趨勢；高質量濃度苯胺(大于100 mg/L)和硝基苯(大于30 mg/L)抑制了蛋白核小球藻光合色素含量的合成，處理48 h后葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量明顯下降。光合色素含量的減少是植物和藻類中的一種常見的脅迫反應，這可能是由類囊體脂過氧化和PSⅡ復合體的降解引起的[19]。

圖2 暴露于不同質量濃度苯胺下蛋白核小球藻中光合色素含量的變化Fig.2 Changes of photosynthetic pigment content in Chlorella pyrenoidosa exposed to different concentrations of aniline(a) Chlorophyll a (Chl a)； (b) Chlorophyll b (Chl b)； (c) Carotenoids (Car)Conditions: Dark adaptation time 24 h; T=4 ℃

圖3 暴露于不同質量濃度硝基苯下蛋白核小球藻中光合色素含量的變化Fig.3 Changes of photosynthetic pigment content of Chlorella pyrenoidosa exposed to different concentrations of nitrobenzene(a) Chlorophyll a (Chl a)； (b) Chlorophyll b (Chl b)； (c) Carotenoids (Car)Conditions: Dark adaptation time 24 h; T=4 ℃

2.3 苯胺和硝基苯對蛋白核小球藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

葉綠素熒光參數(shù)是評價微藻細胞光合作用活性的重要指標，在正常生理條件下非常穩(wěn)定[20-21]。通過測定PSⅡ的葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm和YⅡ)，研究了蛋白核小球藻對苯胺、硝基苯的光生理響應，結果見圖4。由圖4可知：質量濃度低于100 mg/L的苯胺處理后Fv/Fm變化較平穩(wěn)；YⅡ呈先升后降的趨勢，總體保持在0.2以上；然而，質量濃度高于100 mg/L苯胺處理后，F(xiàn)v/Fm和YⅡ在培養(yǎng)期間呈下降趨勢，且苯胺濃度越高，對蛋白核小球藻影響越大。硝基苯處理組與之類似，蛋白核小球藻在質量濃度高于50 mg/L硝基苯處理后Fv/Fm和YⅡ均明顯降低，且隨硝基苯含量升高，其熒光活性越低。與空白組相比，質量濃度為100 mg/L苯胺和30 mg/L硝基苯處理48 h后Fv/Fm分別下降了4.02%和57.47%，YⅡ分別下降了8.80%和53.42%。Fv/Fm的降低表明高濃度苯胺、硝基苯可能對蛋白核小球藻PSⅡ的電子傳遞能力有抑制作用。由于YⅡ值與類囊體膜中的電子傳遞相對應，可以將苯胺、硝基苯誘導的YⅡ降低歸因于類囊體膜中與電子傳遞鏈相關的光合作用光化學過程的抑制[22]。

Fv/Fm—The maximum optical quantum yield； YⅡ—The actual light quantum yield圖4 暴露于不同質量濃度苯胺和硝基苯下蛋白核小球藻的熒光活性Fig.4 Fluorescence activity of Chlorella pyrenoidosa exposed to different concentrations of aniline and nitrobenzene(a) Aniline Fv/Fm； (b) Aniline YⅡ； (c) Nitrobenzene Fv/Fm； (d) Nitrobenzene YⅡConditions: Dark adaptation time 5 min; T=25 ℃

2.4 苯胺和硝基苯對蛋白核小球藻抗氧化能力的影響

苯胺、硝基苯可能會導致光合作用電子傳遞受阻，從而導致電子積累。過多的電子可以與分子氧反應形成活性氧(ROS)，隨后產(chǎn)生氧化應激[23]。為了減少氧化損傷，植物體內有一個防御系統(tǒng)，主要負責清除過量的自由基來抵抗氧化損傷，以此來維持體內環(huán)境的穩(wěn)定[24]。暴露于不同質量濃度苯胺下蛋白核小球藻的抗氧化酶活性和丙二醛含量變化如圖5所示。由圖5可知：抗氧化酶活性隨著苯胺質量濃度的增加而提高；其中經(jīng)質量濃度500 mg/L苯胺處理48 h后，SOD和POD活性分別是空白組的4.45和6.93倍。SOD和POD的活性同時升高表明，蛋白核小球藻抗氧化酶參與消除氧化應激過程中產(chǎn)生的過量ROS[25]。MDA水平可以指示脂質氧化的水平，隨著苯胺質量濃度的增加，MDA含量增加(見圖5(c))，苯胺處理48 h后與空白組結果相比增加47.82～432.30百分點。綜上，抗氧化酶仍不足以完全清除過量的ROS，從而導致氧化損傷，過量的ROS可以與大分子作用并促使膜脂質過氧化[26-27]。

SOD—Superoxide dismutase； POD—Peroxidase； MDA—Malondialdehyde圖5 苯胺質量濃度對蛋白核小球藻48 h抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.5 Effect of aniline mass concentration on antioxidant system of Chlorella pyrenoidosa in 48 h(a) SOD activity； (b) POD activity； (c) MDA contentConditions: Ultrasonic crushing 200 W; Crushing time 10 min; T=4 ℃

暴露于不同質量濃度硝基苯下蛋白核小球藻的抗氧化酶活性和丙二醛含量變化如圖6所示。由圖6可知，與空白組相比，不同質量濃度硝基苯處理48 h后，蛋白核小球藻SOD和POD活性及MDA含量均明顯升高。然而，質量濃度100 mg/L硝基苯處理后SOD、POD活性較50 mg/L硝基苯處理后有所降低。表明相對較高的硝基苯濃度可能抑制細胞的SOD和POD活性。

SOD—Superoxide dismutase； POD—Peroxidase； MDA—Malondialdehyde圖6 硝基苯質量濃度對蛋白核小球藻48 h抗氧化系統(tǒng)影響Fig.6 Effect of nitrobenzene mass concentration on antioxidant system of Chlorella pyrenoidosa in 48 h(a) SOD activity； (b) POD activity； (c) MDA contentConditions: Ultrasonic crushing 200 W; Crushing time 10 min; T=4 ℃

2.5 苯胺和硝基苯對蛋白核小球藻蛋白質含量的影響

圖7顯示了采用不同質量濃度苯胺和硝基苯處理蛋白核小球藻48 h后蛋白質含量。由圖7可知，處理組與空白組間蛋白質含量存在顯著差異(p<0.05)，且隨著苯胺和硝基苯濃度的增加，蛋白質含量顯著下降。其中，500 mg/L苯胺和100 mg/L硝基苯處理后蛋白質含量較空白組減少60.04%和70.20%。微藻在脅迫作用下可能會導致蛋白質含量發(fā)生變化。Gita等[28]發(fā)現(xiàn)，普通小球藻暴露于不同濃度的紡織染料時，蛋白質水平會顯著降低。Hu等[29]還報道，在較高濃度的偶氮染料RP2B下，魚腥藻的蛋白質合成受到抑制。研究中，蛋白核小球藻也表現(xiàn)出相同的變化。

a, b, c, d indicate significant differences (p<0.05).圖7 不同質量濃度苯胺、硝基苯對蛋白核小球藻處理48 h后的蛋白質含量Fig.7 Protein content of Chlorella pyrenoidosa exposed to different concentrations ofaniline and nitrobenzene after 48 h of treatment(a) Aniline； (b) NitrobenzeneConditions: Ultrasonic crushing 200 W; Crushing time 10 min; T=4 ℃

2.6 蛋白核小球藻對苯胺和硝基苯去除影響

目前，關于含氮芳烴的生物降解研究主要集中在一些細菌上，一些研究表明，某些含氮芳烴降解菌可以通過氧化或還原途徑降解這些化合物[30]。此外，也有一些報道表明，單細胞藻類對酚類、DDT、六六六、偶氮、石油等有機物都具有明顯的富集與降解能力[31]。對培養(yǎng)液中苯胺和硝基苯含量進行檢測，結果見圖8。苯胺、硝基苯通常狀態(tài)下是非常穩(wěn)定的，由圖8可以看出：在不加入微藻的對照組中培養(yǎng)48 h，苯胺質量濃度下降5.63%，硝基苯質量濃度下降9.01%；而加入蛋白核小球藻培養(yǎng)48 h后，苯胺質量濃度下降了40%，與對照組相比顯著降低；硝基苯質量濃度下降了12.9%，與對照組相比變化不明顯。結果表明，蛋白核小球藻有助于苯胺的去除。藻類吸收水體中有毒化學物質已有報道，其過程包括生物轉化、富集和降解作用。有研究表明，在漆酶和NR酶作用下狐尾藻可以將TNT分解為無毒無害的物質[32]。在蛋白核小球藻存在下培養(yǎng)48 h，苯胺含量顯著降低，但蛋白核小球藻對苯胺的去除機理還需進一步研究。

圖8 不同處理時間(t)下蛋白核小球藻對苯胺、硝基苯質量濃度(ρ)的影響Fig.8 Effect of chlorella pyrenoidosa on the mass concentration (ρ) of aniline and nitrobenzene under different treatment time (t)(a) Aniline； (b) NitrobenzeneConditions: V(Methanol)∶V(Water)=40∶60; Flow rate 1 mL/min; T=30 ℃

3 結 論

(1)不同質量濃度苯胺和硝基苯會對蛋白核小球藻產(chǎn)生不同程度的毒害作用。蛋白核小球藻對苯胺的48 h半最大效應濃度(EC50)是硝基苯的13.8倍，蛋白核小球藻對苯胺的耐受性高于硝基苯。質量濃度高于100 mg/L的苯胺和高于30 mg/L的硝基苯處理對蛋白核小球藻的生長、光合活性、色素和蛋白質含量均有顯著抑制作用。

(2)高濃度的苯胺、硝基苯會抑制光合活性，阻遏光合電子傳遞，造成氧化脅迫。通過檢測抗氧化酶活性及MDA含量，發(fā)現(xiàn)一定劑量的苯胺和硝基苯會提高蛋白核小球藻抗氧化酶活性，這對清除ROS起一定作用，但高濃度苯胺和硝基苯仍會導致細胞膜脂過氧化，造成氧化損傷。

(3)含氮芳烴類化合物作為有毒污染物，難以被生物降解。通過對培養(yǎng)液中苯胺、硝基苯含量的檢測，發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻存在下會促進苯胺的去除。這為含氮芳烴類廢水治理提供了一條新的思路。