張含智,李 鳳,康經(jīng)武(1.生命有機化學(xué)國家重點實驗室,中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所,上海 0003;.西安市食品安全檢測與風(fēng)險評估重點實驗室,西安文理學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710065;3.弈柯萊生物科技(上海)股份有限公司,上海 0041)

作為一種高效的液相分離技術(shù),毛細管電泳(CE)具有分離時間短、分離柱效高和樣品用量少等優(yōu)點[1-3]。毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(CE-MS)具有分離效率高、檢測靈敏度高、樣品消耗量少,并且可同時提供樣品的結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點,成為復(fù)雜樣品分離分析的強有力工具[4-6]。非水毛細管電泳(NACE)是毛細管電泳分離模式的一種延伸,能夠分離水溶性差或在水相介質(zhì)中分離效果較差的分析物[7,8]。同時由于NACE一般采用高揮發(fā)性、表面張力小的有機溶劑,電泳過程產(chǎn)生較小的電流和焦耳熱,也非常適合與高靈敏度的MS聯(lián)用。近年來,非水毛細管電泳-質(zhì)譜(NACE-MS)在復(fù)雜生物樣品、環(huán)境樣品、食品、手性藥物和農(nóng)藥制劑的分析中也受到廣泛關(guān)注[9,10]。與水相CE-MS相比,NACE-MS的背景電解質(zhì)(BGE)中大量的有機溶劑提高了電噴霧離子源(ESI)效率,能夠穩(wěn)定噴霧電流,降低背景噪聲的信號,提高檢測靈敏度。同時NACE-MS可以兼容多種有機溶劑、手性選擇劑或表面活性劑等,提高了CE的分離選擇性,擴大了CE-MS的應(yīng)用范圍[11,12]。Chen等[9]也利用實驗室自己發(fā)展的CE-MS接口技術(shù),開發(fā)了一種定量NACE-MS/MS分析方法,應(yīng)用于大黃中3種活性成分大黃素、大黃酚和蘆薈大黃的分析。Britz-McKibbin等[10]在利用NACE-MS技術(shù)進行血液中脂類代謝組學(xué)研究中,基于精確相對分子質(zhì)量和相對遷移時間實現(xiàn)了279種血脂特征成分分析,結(jié)果證明該技術(shù)極大地擴展了傳統(tǒng)水相CE-MS用于代謝組學(xué)研究的覆蓋范圍,可以構(gòu)建大規(guī)模脂質(zhì)組學(xué)研究的高效平臺。

近年來,CE和MS聯(lián)用系統(tǒng)的研究層出不窮,而接口技術(shù)的研制至關(guān)重要,目前主要的接口技術(shù)包括鞘流、液聯(lián)接和無鞘流接口等[13]。其中鞘流接口的靈活性使其被更廣泛的應(yīng)用,但鞘流組成的多變性以及對樣品的稀釋也限制了該技術(shù)的發(fā)展[14]。而無鞘流接口可更有效地提高分析靈敏度,最大限度地減少樣品稀釋。最近,我們課題組報道了一種無鞘流接口技術(shù),在分離毛細管末端通過氫氟酸蝕刻成對稱性錐形尖端,再包裹導(dǎo)電涂層金箔即制備成電噴霧電極。其中分離與電噴霧離子化在一根毛細管上實現(xiàn),該無鞘流CE-MS系統(tǒng)已成功應(yīng)用于生物堿類、小分子陰離子以及(糖)蛋白酶解產(chǎn)物的分離分析中[15]。

本文利用實驗室自己發(fā)展的無鞘流接口技術(shù),建立了同時分析5種酪氨酸激酶抑制劑(結(jié)構(gòu)式見圖1)的NACE-MS分析方法,用于拓展我們發(fā)展的無鞘流CE-MS聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用。首先利用NACE-UV優(yōu)化了毛細管電泳的分離條件,包括背景電解質(zhì)中的乙酸含量、鹽濃度及有機溶劑組成等。與水相CE-ESI-MS相比,NACE-MS分析時間更短、檢測靈敏度更高。同時NACE-MS系統(tǒng)的遷移時間在日內(nèi)、日間及接口批次之間的重復(fù)性良好,對上述物質(zhì)的絕對檢出限達到amol級別。此外,進一步將NACE-MS擴展至有機酸類化合物和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的分離分析中。

圖1 5種酪氨酸激酶抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the five tyrosine kinase inhibitors

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

毛細管電泳儀(Agilent公司),配置DAD檢測器;LCQ Fleet ion-trap質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司)。CE與質(zhì)譜儀經(jīng)實驗室研發(fā)的無鞘流接口實現(xiàn)聯(lián)用,質(zhì)譜圖通過配有Xcalibur系統(tǒng)的計算機采集,電噴霧電極距質(zhì)譜的位置可以通過x-y-z三維架調(diào)整。

舒尼替尼(sunitinib)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)(南京安格醫(yī)藥化工有限公司);千層紙素A(oroxylin A)、丹酚酸C(salvianolic acid C)、迷迭香酸(rosmarinic acid)(上海源葉生物科技有限公司);阿奇霉素(azithromycin)、紅霉素(erythromycin)(上海TCI公司);環(huán)孢素A(cyclosporin A)(浙江八達通生物化工)。甲醇、乙腈(德國Merck公司);乙酸、甲酸銨、乙酸銨、聚-N,N′-二甲基溴化己銨(海美溴銨,hexadimethrine bromide,HDB)、磺化葡聚糖(dextran sulfate,DS,Mr500 000)(美國Sigma-Aldrich公司);氫氟酸(HF)、二甲基亞砜(DMSO)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm),由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備(美國Millipore公司)。CE實驗中所需溶液使用前均由0.22 μm濾膜過濾。

1.2 樣品溶液配制

NACE-MS樣品溶液:準確稱取舒尼替尼、伊馬替尼、吉非替尼、達沙替尼、埃羅替尼溶解于含有5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合溶劑中,配制儲備液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,混合后稀釋至0.1 mg/mL備用;準確稱取千層紙素A、丹酚酸C、迷迭香酸,溶于含有5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合溶劑中,混合后稀釋至0.2 mg/mL備用;準確稱取阿奇霉素、紅霉素、環(huán)孢素A溶于含有5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合溶劑中,混合后稀釋至50 μg/mL備用。

CE-MS樣品溶液:準確稱取舒尼替尼、伊馬替尼、吉非替尼、達沙替尼、埃羅替尼溶解于含20 mmol/L甲酸銨的50%(v/v)乙腈水溶液中,配制儲備液的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,混合后稀釋至0.1 mg/mL備用。

1.3 實驗條件

1.3.1無鞘流接口的加工

自制的NACE-ESI-MS無鞘流接口的結(jié)構(gòu)如圖2a所示。無鞘流接口包括分離毛細管和金箔包裹的電噴霧噴針,分離毛細管末端經(jīng)氫氟酸刻蝕后形成對稱性尖端,包裹金箔后可以使毛細管尖端導(dǎo)電,成為噴霧電極,樣品在電場中離子化后進入質(zhì)譜檢測。該接口簡單且易制作,與鞘流接口相比,避免了鞘流液的稀釋,提高了檢測靈敏度。

圖2 (a)無鞘流NACE-ESI-MS系統(tǒng)示意圖及(b)氫氟酸刻蝕方法得到的對稱型石英毛細管噴針的SEM圖Fig.2 (a) Schematic diagrams of sheathless interface and NACE-ESI-MS system and (b) SEM image of the symmetrical fused silica capillary emitter observed by HF acid etching method NACE-ESI-MS:nonaqueous capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry.

無鞘流接口集分離與電噴霧電極于一體,關(guān)鍵在于制作金箔包裹的電噴霧噴針,該接口的制作過程包括如下兩個步驟[15]:(1)改良石英毛細管噴針制備方法:采取一種氫氟酸刻蝕熔融石英毛細管成噴針的方法,燒去毛細管末端5 mm聚酰亞胺涂層,浸到40%氫氟酸液面下約2 mm,內(nèi)部通氮氣,防止氫氟酸進入管內(nèi);通過掃描電鏡記錄刻蝕不同時間后毛細管尖端的狀況;(2)制備金箔包裹的電噴霧質(zhì)譜電極:將金箔(9.2 cm×9.2 cm)裁剪成大小合適的條狀(1.2 cm×1.5 mm),通過環(huán)氧膠裹覆在毛細管噴針上。制作成本及時間大幅度降低,每張金箔可用于制作近400根噴針,每根包裹時間在3 min以內(nèi)。

1.3.2CE-MS條件

彈性石英毛細管柱:70 cm×50 μm I.D.,360 μm O.D.(Polymicro Technologies,USA);分離電壓:12 kV;壓力進樣:2.5 kPa×2.5 s;電噴霧電壓2.2 kV。NACE-MS緩沖液:含2%乙酸和5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合溶劑;CE-MS緩沖液:含20 mmol/L甲酸銨的50%(v/v)乙腈水溶液(pH 3.0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 無鞘流接口的制作

制作接口時,氫氟酸會浸潤毛細管外管壁,在液面以上的毛細管表面形成彎月形刻蝕層,該刻蝕層厚度從下到上逐漸變薄,即在包有聚酰亞胺涂層的毛細管處最薄。液面以下的毛細管被刻蝕掉后,會逐漸依據(jù)刻蝕層厚度刻蝕液面以上的毛細管。由于刻蝕速度不同,當液面以上的毛細管消失后,會在包有聚酰亞胺涂層的毛細管處自動得到成對稱型的尖端,如圖2b所示,壁厚減小,內(nèi)徑并沒有變化,外徑縮小至約5 μm,電泳時從毛細管流出的液體可以及時接觸到導(dǎo)電涂層產(chǎn)生電噴霧。刻蝕時間會因去掉聚酰亞胺涂層的毛細管長度而有所變化,一般在120～180 min。由于對稱型尖端是自動刻蝕得到,制備的電噴霧噴針具有很高的重復(fù)性,可批量制作;噴針內(nèi)徑不受影響,不會干擾分離行為。

2.2 NACE-MS條件的優(yōu)化

本文選擇5種酪氨酸激酶抑制劑的混合物作為測試樣品,采用HDB-DS對毛細管內(nèi)壁進行動態(tài)雙涂層修飾,并考察了BGE溶劑組成、酸及鹽的含量等因素對NACE分離的影響。

2.2.1BGE條件的選擇

在NACE中,電泳緩沖液中有機溶劑的種類和含量對動態(tài)涂層的穩(wěn)定性及電滲流的調(diào)控具有明顯影響。對于有機溶劑的選擇,需要考察黏度(η)、介電常數(shù)(ε)、表面張力系數(shù)(γ)、質(zhì)子自遞常數(shù)(pKauto)、極性及沸點等參數(shù)的影響。其中,黏度和介電常數(shù)是影響電泳淌度(μeq)和電滲流(μeo)的重要因素,如公式(1)、(2)所示。如果改變了溶劑種類,分析物離子的溶劑化半徑、ε和η也隨之改變。同時μeq和μeo會隨著ε/η比值的增大而增大,為提高分析速度應(yīng)選擇ε/η比值較大的有機溶劑。對比分析各類常見溶劑的η和ε值,乙腈是非常適合作為NACE的良好溶劑。

(1)

(2)

其中,q,分析物電荷;r,分析物的Stokes半徑;ε,溶劑的介電常數(shù);ζion,分析物離子的zeta電勢;ζwall毛細管壁的zeta電勢;η,溶劑的黏度。

圖3 (a)甲醇、(b)乙酸及(c)乙酸銨含量對NACE分離5種酪氨酸激酶抑制劑的影響Fig.3 Effect of (a) methanol,(b) acetic acid and (c) ammonium acetate contents on the NACE separation for the five tyrosine kinase inhibitors Background electrolyte (BGE):a.acetonitrile-methanol containing 5 mmol/L ammonium acetate and 2%(v/v) acetic acid;b.acetonitrile-methanol (80∶20,v/v) containing 5 mmol/L ammonium acetate and acetic acid;c.acetonitrile-methanol (80∶20,v/v) containing 2%(v/v) acetic acid and ammonium acetate. Peak identifications:1.sunitinib;2.imatinib;3.gefitinib;4.dasatinib;5.erlotinib.

實驗中,首先嘗試采用含有2%(v/v)乙酸和5 mmol/L乙酸銨的乙腈溶液作為BGE分離5種酪氨酸激酶抑制劑,見圖3a,伊馬替尼和吉非替尼無法實現(xiàn)基線分離。隨著甲醇含量的增加,如加入20%甲醇時,即BGE為含有2%(v/v)乙酸和5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合溶劑時,各分析物的分離效果得到改善,進一步增加至40%甲醇,對吉非替尼與達沙替尼的分離度沒有明顯改善。甲醇作為一種質(zhì)子化極性溶劑,加入到背景電解質(zhì)中,改變了分析物離子的溶劑化狀態(tài),增加了離子與溶劑的氫鍵作用,提高了分離選擇性。然而甲醇的ε/η值較乙腈小,CE分離的電滲流減小,分析時間延長。綜合考慮,選擇加入20%甲醇。

不同乙酸含量對5種酪氨酸激酶抑制劑分離的影響如圖3b所示。實驗表明,當含5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)溶液中不加入乙酸時,5種抑制劑基本無分離。各分析物的分離度隨著乙酸含量的增加而逐漸變大,加入2%的乙酸,相較于加入1%乙酸的分離情況,吉非替尼和達沙替尼實現(xiàn)了基線分離。由于所選擇的抑制劑含有較多的氮原子,乙酸的加入使待測物的質(zhì)子化程度增加,大大提高了分離度。但乙酸的加入同時抑制了μeq和μeo,使得出峰時間略有增加。在保證分離度的基礎(chǔ)上,為縮短分析時間,本實驗選擇在緩沖溶液中加入2%乙酸。

根據(jù)CE-UV對5種抑制劑的分離情況,為避免鹽濃度過大造成離子抑制,我們確定了用于NACE-MS聯(lián)用時的背景電解質(zhì)溶液組成,選擇乙酸銨濃度為5 mmol/L,為達到基線分離,采用乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合有機溶劑,其中含有2%的乙酸。為盡量減少因有機溶劑揮發(fā)而造成背景電解質(zhì)的變化并提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性,應(yīng)根據(jù)峰形及時更換緩沖液。

圖4 (a)NACE-ESI-MS與(b)水相CE-ESI-MS分離5種激酶抑制劑的電泳圖Fig.4 Electropherograms of the five kinase inhibitors by (a) NACE-ESI-MS and (b) aqueous CE-ESI-MS Conditions:capillary,70 cm×50 μm I.D.,360 μm O.D.;applied separation voltage,12 kV;ESI voltage,2.2 kV;hydrodynamic injection,1 kPa×2.0 s.BGE:a.2%(v/v) acetic acid and 5 mmol/L ammonium acetate in acetonitrile-methanol (80∶20,v/v);b.20 mmol/L ammonium formate in 50% acetonitrile aqueous solution (pH 3.0).The mass concentrations of analytes are all 10 μg/mL. Peak identifications are the same as those in Fig.3.

2.2.2NACE-MS與水相CE-MS分離情況的比較

我們對比了NACE-MS與水相CE-MS對5種激酶抑制劑的分離效果,其基峰色譜圖如圖4所示。實驗中,以電中性化合物DMSO測試了非水相和水相的電滲流大小,其中NACE的電滲流為170 nL/min,而CE的電滲流為80 nL/min。這表明非水相中的遷移速度大于水相中的遷移速率。這是因為乙腈黏度較低,具有高的ε/η值,因此具有較高的電泳淌度,從而可以縮短分析時間。同時實驗發(fā)現(xiàn),在兩種不同的介質(zhì)中,5種抑制劑的出峰順序也發(fā)生了變化,這可能是因為分析物與緩沖溶液存在不同的相互作用,包括氫鍵、離子對及(締合)偶極-偶極相互作用等。

與水相CE相比,NACE中有機溶劑改善了色譜峰形,如化合物伊馬替尼在水相CE-ESI-MS中的峰形較差,這可能是由于較長的分析時間造成后期噴霧不穩(wěn)定。相同進樣條件下,NACE-MS的信號強度是水相CE-MS的10倍,說明NACE的方法具有更高的檢測靈敏度。分析原因可能是:一方面NACE中采用較低的鹽濃度,降低了高濃度離子對樣品信號的抑制作用;另一方面,乙腈和甲醇較低的表面張力使得產(chǎn)生的噴霧更穩(wěn)定,且樣品去溶劑化過程更快,形成更小的帶電液滴,從而提高了質(zhì)譜檢測靈敏度。

2.3 NACE-MS的方法學(xué)評價

以上述5種抑制劑的測試為例,考察了該無鞘流接口的穩(wěn)定性和重復(fù)性,如表1所示。結(jié)果表明,其日內(nèi)、日間RSD值分別小于0.5%和0.8%,與水相CE-ESI-MS的0.8%和2.7%相比,該接口在非水相的分析模式下具有更加穩(wěn)定的性能。同時對實驗室自制的3根無鞘流接口的柱間重復(fù)性也進行了測試,RSD均小于2.6%,得到了令人滿意的結(jié)果。柱間的差異性較小,說明該無鞘流接口有希望作為一種商品化的接口技術(shù)用于更廣泛的CE-ESI-MS聯(lián)用系統(tǒng)。

表1 5種酪氨酸激酶抑制劑的檢出限及遷移時間的重復(fù)性Table 1 LODs of the five tyrosine kinase inhibitors and repeatabilities (RSDs) of migration time

圖5 NACE-ESI-MS分離酸類化合物的電泳圖及質(zhì)譜圖Fig.5 Electropherogram and mass spectra of acid compounds separation by NACE-ESI-MS

2.4 NACE-MS對其他有機離子化合物的分析考察

生物體內(nèi),有很多陰離子化合物如部分藥物及其代謝物、有機酸及酸性糖鏈等。這些物質(zhì)在體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮了很關(guān)鍵的作用。目前,無鞘流CE-MS在該方面的報道極少,這是因為陰離子化合物一般在質(zhì)譜負離子模式下分析,而噴霧的穩(wěn)定性較差,給分離鑒定增加了難度。在本工作中,基于實驗室自主開發(fā)的無鞘流接口,探索一種穩(wěn)定的背景電解質(zhì)體系,進一步將NACE-ESI-MS用于陰離子化合物的分析中。我們選擇了3種酸性化合物千層紙素A、丹酚酸C和迷迭香酸為檢測對象,以含5 mmol/L乙酸銨的乙腈-甲醇(80∶20,v/v)為背景電解質(zhì),NACE-ESI-MS電泳圖如圖5所示。在質(zhì)譜負離子模式檢測,其[M-H]-的質(zhì)譜圖如圖5所示。實驗結(jié)果表明,NACE-ESI-MS用于酸性化合物的分離基線平穩(wěn),說明質(zhì)譜負電壓的檢測模式下,該無鞘流接口可以得到穩(wěn)定的電噴霧,證明我們開發(fā)的NACE-ESI-MS系統(tǒng)適用于陰離子型化合物的檢測。

進一步將NACE-MS的應(yīng)用范圍擴展至一些難溶性化合物的分析中,選取了3種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素化合物阿奇霉素、紅霉素和環(huán)孢素A,將其溶于乙腈-甲醇(80∶20,v/v)混合溶劑中,NACE-ESI-MS的相關(guān)譜圖見圖6,阿奇霉素和紅霉素的基峰是[M+H]+的分子離子峰,而環(huán)孢素A的基峰為[M+NH4]+,可能是電噴霧過程中環(huán)孢素A結(jié)合銨根離子的能力強于氫離子。

圖6 NACE-ESI-MS分離抗生素類化合物的電泳圖和質(zhì)譜圖Fig.6 Electropherogram and mass spectra of antibiotic compounds separation by NACE-ESI-MS

3 結(jié)論

本文成功實現(xiàn)了無鞘流NACE-ESI-MS聯(lián)用系統(tǒng)對于5種酪氨酸激酶抑制劑(舒尼替尼、伊馬替尼、吉非替尼、達沙替尼、埃羅替尼)的分析。與水相CE-ESI-MS相比,兩者的分離選擇性不同,但前者具有一定的優(yōu)勢。結(jié)果表明,NACE-ESI-MS特別適合于分離水溶性差而易溶于有機溶劑的物質(zhì),同時具有更快的分析速度、更高的分離效率和更加穩(wěn)定的性能。隨著進一步深入的研究,NACE-MS的優(yōu)異性能會更多地顯現(xiàn)出來,它將成為水相CE-MS和HPLC-MS等技術(shù)的一種重要補充手段,在更多的領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。