張露 王俊斌 周海榮 高振遠(yuǎn)

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 安徽蚌埠 233000

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，總體5年生存率為30%～60%[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全世界范圍內(nèi)的新發(fā)結(jié)直腸癌病例約有136萬(wàn)，位居所有惡性腫瘤的第4位[2]。盡管當(dāng)前多學(xué)科綜合治療方案的普及與運(yùn)用使臨床上結(jié)直腸癌患者明顯獲益，但結(jié)直腸癌的死亡率總體仍呈上升趨勢(shì)；而復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌治療失敗的主要原因。細(xì)胞的粘附作用在癌細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮雙重作用。一方面，癌細(xì)胞之間的粘附力下降能夠促使癌細(xì)胞易于脫離原發(fā)病灶；另一方面，粘附作用能夠使癌細(xì)胞粘附在血管內(nèi)皮或轉(zhuǎn)移至靶器官，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移病灶的形成?？梢?jiàn)，癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的過(guò)程是粘附與去粘附的過(guò)程[3]。迄今為止，細(xì)胞間隙連接與細(xì)胞粘附的相關(guān)研究是癌細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞間隙連接是相鄰細(xì)胞之間的膜通道結(jié)構(gòu)，可以開(kāi)放或關(guān)閉，由跨細(xì)胞膜的連接蛋白(CX)構(gòu)成，通過(guò)調(diào)節(jié)小分子物質(zhì)與細(xì)胞代謝產(chǎn)物的通過(guò)，調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化。連接蛋白43(connexin43, CX43)作為細(xì)胞間隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)細(xì)胞的分化與增殖發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。本研究探討了CX43蛋白表達(dá)對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者短期療效和長(zhǎng)期預(yù)后的影響，為進(jìn)一步研究CX43在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 58例結(jié)直腸癌組織均來(lái)源于本院2015年1月～2017年4月期間收治的晚期結(jié)直腸癌患者，所有研究對(duì)象均經(jīng)病理學(xué)確診，并有完整的隨訪資料。58例結(jié)直腸癌組織其中男37例，女21例；年齡36～79歲，平均年齡(62.5±15.4)歲；直腸癌36例，結(jié)腸癌22例；癌腫位置，左半結(jié)腸 13例，右半結(jié)腸 9例。根據(jù)結(jié)直腸癌組織CX43蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分組，將CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性的病例設(shè)為陽(yáng)性組(33例)，表達(dá)陰性的病例設(shè)為陰性組(25例)。根據(jù)衛(wèi)生部《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010 年版)》[5]的診斷標(biāo)準(zhǔn)明確診斷為結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均行手術(shù)治療，組織病理檢查結(jié)果確診為結(jié)直腸癌；納入患者經(jīng)過(guò)影像學(xué)相關(guān)檢查后明確病情處于IV期，且所有病灶為可測(cè)量病灶；可行化學(xué)治療，無(wú)相關(guān)禁忌證；均行奧沙利鉑聯(lián)合5-FU衍生物(卡培他濱或替吉奧)方案治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有嚴(yán)重的內(nèi)科疾病，心、肝、腎功能不全；處于妊娠期或者哺乳期的患者；除結(jié)直腸癌外還有其他原發(fā)腫瘤；臨床資料不完整者；因嚴(yán)重不良反應(yīng)中途退出。納入本研究的臨床病理學(xué)標(biāo)本均經(jīng)患者簽字同意后使用，本研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2結(jié)直腸癌組織CX43蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色法，檢測(cè)患者結(jié)直腸癌組織中CX43蛋白的表達(dá)情況。待檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)10%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后進(jìn)入石蠟，待石蠟充分浸透組織后進(jìn)行包埋，制成組織蠟塊，修整蠟塊并固定于標(biāo)本臺(tái)上，經(jīng)切片機(jī)制成4μm厚連續(xù)切片。應(yīng)用3%過(guò)氧化氫甲醇處理30min，滅活標(biāo)本內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液沖洗后進(jìn)行微波抗原修復(fù)(20min)，磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加10%山羊血清(濃度為50μL)封閉抗原，37℃孵育60min，每張切片滴加CX43兔抗人多克隆抗體(1:100)50μL，4℃條件過(guò)夜。經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加生物素化二抗-鏈霉親合素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育60 min后經(jīng)顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，次日進(jìn)行光鏡下觀察。CX43蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色或棕褐色。參考Larid等[6]的方法進(jìn)行陽(yáng)性染色結(jié)果的判定。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 收集研究對(duì)象的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤分化程度、組織類型、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小。分析CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1.3.2CX43蛋白表達(dá)與臨床療效的關(guān)系 所有研究對(duì)象均給予奧沙利鉑聯(lián)合5-FU衍生物(卡培他濱或替吉奧)方案化療，具體：奧沙利鉑130mg/m2，一次靜滴；卡培他濱1000mg/m2，口服，2次/d或替吉奧 60mg/m2，口服，2次/d，均用藥14d休息7d。21d為一個(gè)治療周期，發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或疾病進(jìn)展后停藥。所有患者治療3個(gè)周期后進(jìn)行近期臨床療效的評(píng)定。依據(jù)實(shí)體瘤客觀療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7]將臨床療效分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)?？傆行蔕RR=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。疾病控制率DCR=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%。比較陽(yáng)性表達(dá)組、陰性表達(dá)組的臨床療效、疾病控制率。

1.3.3CX43蛋白表達(dá)與晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系分析 所有研究對(duì)象隨訪時(shí)間≥60個(gè)月。比較兩組無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)、總生存期(OS)。PFS定義為：從接受術(shù)后化療開(kāi)始，到患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間。OS定義為：從接受術(shù)后化療開(kāi)始，到患者死亡的時(shí)間或末次隨訪時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用(Mean±SD)表示，兩組獨(dú)立資料、正態(tài)方差齊資料組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以例數(shù)或百分比表示。檢驗(yàn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 CX43蛋白表達(dá)情況與結(jié)直腸癌分化程度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，與性別、年齡、組織類型、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。CX43表達(dá)陽(yáng)性的患者其癌組織分化程度為高、中分化的比率明顯高于CX43表達(dá)陰性的患者(P<0.05)。CX43表達(dá)陽(yáng)性的患者Dukes分期情況與CX43表達(dá)陰性的患者之間存在明顯差異，即CX43陽(yáng)性患者Dukes分期為A+B期的比率顯著高于CX43表達(dá)陰性的患者(χ2=7.707，P=0.006)，Dukes分期為C+D期的比率顯著低于CX43表達(dá)陰性的患者(χ2=7.707，P=0.006)，CX43表達(dá)陽(yáng)性的患者中，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者比率明顯低于CX43表達(dá)陰性的患者(P<0.05)，Ki67高表達(dá)的患者比率顯著高于CX43表達(dá)陰性的患者(P<0.05)。

表1 CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.2CX43蛋白表達(dá)與化療療效的關(guān)系 58例晚期結(jié)直腸癌患者接受奧沙利鉑聯(lián)合5-FU衍生物化療后，CR 0例， PR30例，SD15例，PD13例，DCR為77.59%(45/58)。其中CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性組DCR為87.88%，CX43蛋白表達(dá)陰性組DCR為64.00%，CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性組總有效率高于CX43蛋白表達(dá)陰性組，兩組患者化療總有效率差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 CX43蛋白表達(dá)與化療療效的相關(guān)性[例(%)]

2.3CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系分析 設(shè)置隨訪截止日期為2022年4月，總體5年生存率為32.76%(19/58)。CX43蛋白表達(dá)陰性組出現(xiàn)終點(diǎn)事件(死亡)21例，CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性組18例。CX43蛋白表達(dá)陰性組中位PFS為24個(gè)月(95%CI：19.104～28.896)；CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性組為43個(gè)月(95%CI：41.442～51.528)。陽(yáng)性組中位PFS長(zhǎng)于陰性組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.974，P<0.001)，見(jiàn)圖1。CX43蛋白表達(dá)陰性組中位OS為51個(gè)月(95%CI：46.135～55.865)；CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性組為56個(gè)月(95%CI：51.369～59.116)。陽(yáng)性組中位OS長(zhǎng)于陰性組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.295，P=0.038)，見(jiàn)圖2。

圖1 結(jié)直腸癌患者PFS生存分析

圖2 結(jié)直腸癌患者OS生存分析

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程本質(zhì)上是正常細(xì)胞表型變化的過(guò)程，生物、物理、化學(xué)等因素均為促使人體正常細(xì)胞在分子水平變化的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是多因素參與的過(guò)程，一般分為如下幾個(gè)步驟[8]：原發(fā)病灶中的腫瘤細(xì)胞脫落，發(fā)生浸潤(rùn)、遷移，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并隨血流到達(dá)遠(yuǎn)處血管；穿過(guò)血管，通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)定位于組織或器官。因此有觀點(diǎn)提出，阻斷以上腫瘤細(xì)胞的粘附、降解與移動(dòng)過(guò)程，就有可能發(fā)揮理想的抑制腫瘤病灶轉(zhuǎn)移的作用。

伴隨對(duì)CX43基因研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細(xì)胞中的CX43基因表達(dá)呈下調(diào)狀態(tài)[9]。Kim EY等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)，正常胃黏膜上皮細(xì)胞存在CX43 mRNA高表達(dá)的狀態(tài)，而胃癌細(xì)胞中的CX43基因僅呈微弱的表達(dá)。Wu DP等[11]對(duì)乳腺癌標(biāo)本的CX43表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示正常乳腺組織中CX43蛋白是主要的間隙連接蛋白，而乳腺癌患者普遍存在CX43蛋白缺乏的現(xiàn)象。Wang S等[12]在研究中比較了正常組織與結(jié)直腸癌組織中的CX43蛋白表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明正常組織中的CX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為100%，而結(jié)直腸癌組織中的CX43蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為55.0%。本研究由于客觀條件的限制，未對(duì)正常組織和結(jié)直腸癌組織中的CX43表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與比較，僅對(duì)CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征進(jìn)行了分析，分析結(jié)果顯示，CX43蛋白表達(dá)情況與結(jié)直腸癌分化程度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，分化程度越低、Dukes分期越高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CX43蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越低。說(shuō)明CX43蛋白表達(dá)下降可能是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要事件，CX43蛋白可能具有明顯的抑癌作用。在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中伴隨著Ki67的表達(dá)，有研究表明檢測(cè)結(jié)直腸癌組織Ki67可能對(duì)判斷結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病情進(jìn)展有一定的價(jià)值[13]。Ki67陽(yáng)性的患者3年、5年生存率明顯降低，對(duì)Ki67進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評(píng)估有一定的輔助意義。本次研究中CX43表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者中，Ki67高表達(dá)的患者比率顯著高于CX43表達(dá)陰性的患者(P<0.05)。充分證實(shí)了以上觀點(diǎn)。

5-FU衍生物聯(lián)合奧沙利鉑是目前臨床常用的結(jié)直腸癌化療方案，經(jīng)證實(shí)能夠顯著提高患者的生活質(zhì)量，值得臨床推廣使用[14-15]。本研究通過(guò)分析CX43蛋白表達(dá)與化療療效的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的總有效率顯著高于CX43蛋白表達(dá)陰性組(93.93%：36.00%)，這提示CX43蛋白表達(dá)水平的降低有可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者化療療效的降低。而預(yù)后生存分析的研究結(jié)果則提示，CX43蛋白表達(dá)陽(yáng)性組中位PFS、中位OS均明顯長(zhǎng)于陰性組。在一定層面上證實(shí)了CX43蛋白表達(dá)水平降低與結(jié)直腸癌預(yù)后較差之間的密切關(guān)系。

綜上所述，CX43蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、短期療效、長(zhǎng)期預(yù)后等均有密切關(guān)系。CX43蛋白表達(dá)異?？赡苁墙Y(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要影響因素，但目前引起CX43基因水平下調(diào)的機(jī)制尚未完全清楚，關(guān)于CX43的具體抑癌作用機(jī)制尚需深入研究。