李玲玲 黃海量

山東中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 山東濟(jì)南 250355

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是以關(guān)節(jié)軟骨退變、繼發(fā)性骨贅形成、軟骨下骨重塑和滑膜炎癥為特征的慢性骨關(guān)節(jié)病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍疼痛、腫脹、功能受限和關(guān)節(jié)畸形等[1]，嚴(yán)重影響著患者的健康和生活質(zhì)量。研究顯示，OA的發(fā)病率女性高于男性，農(nóng)村高于城市[2]。隨著人口預(yù)期壽命的延長(zhǎng)及社會(huì)進(jìn)入老齡化，其患病率和致殘率也逐漸升高。預(yù)計(jì)到2030年將有近4億人患有OA[3]，越來越多的患者承受肉體乃至精神上的痛苦與折磨，同時(shí)也給許多家庭和社會(huì)帶來了巨大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。

有研究認(rèn)為，OA的發(fā)生可能與年齡、性別、關(guān)節(jié)損傷、肥胖和代謝等多種因素有關(guān)，其病理生理機(jī)制及其復(fù)雜，多個(gè)生物學(xué)過程和多條信號(hào)通路參與了其損傷進(jìn)程，實(shí)驗(yàn)研究難以系統(tǒng)、整體分析信號(hào)通路和免疫浸潤(rùn)模式[5]?；诖耍狙芯坷蒙镄畔W(xué)的方法進(jìn)行通路富集分析和免疫浸潤(rùn)模式分析，并預(yù)測(cè)對(duì)OA有潛在治療作用的中藥，為OA發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供了一定參考和借鑒。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 以GEO中的GSE55235基因表達(dá)芯片為研究對(duì)象，共包括OA滑膜組織10例，正?；そM織10例。

1.2篩選差異表達(dá)基因 使用GEO2R在線分析工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，設(shè)定校正后P<0.05且|logFC|≥2，篩選OA滑膜組織和正常滑膜組織之間的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes, DEGs)。

1.3GO和KEGG分析 采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行基因本體功能富集分析(GO)和京都基因與基因組百科全書通路富集分析(KEGG)，選擇物種為“智人”，設(shè)定P<0.05。對(duì)GO富集前10的生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)三個(gè)部分，以及KEGG富集前20的信號(hào)通路使用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的篩選 將上述DEGs上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，設(shè)置物種為“智人”，蛋白最低相互作用分值為0.40，并隱藏離散的節(jié)點(diǎn)。將節(jié)點(diǎn)信息以“TSV”格式保存并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)，并利用cytoHubba插件按照度值篩選核心靶點(diǎn)。

1.5免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式分析 利用CIBERSORT算法對(duì)GSE55235基因表達(dá)芯片中人類免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積分析，計(jì)算22種免疫細(xì)胞的相對(duì)比例，設(shè)定P<0.05過濾樣本。使用R語言barplot函數(shù)和pheatmap包繪制正常組與OA組中免疫細(xì)胞組成的柱狀圖和熱圖，使用corrplot包對(duì)OA組中的免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析并繪制共表達(dá)熱圖，使用vioplot包分析正常組和OA組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異并繪制小提琴圖。

1.6核心基因的中藥預(yù)測(cè) 將篩選出的DEGs與Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(https://www.coremine.com/)相互映射篩選對(duì)OA有潛在治療作用的中藥。按照口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18從TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/)篩選其活性成分和靶點(diǎn)信息，使用UniProt(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，Cytoscape 3.8.2軟件用于構(gòu)建“中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1DEGs 共篩選出235個(gè)DEGs，其中上調(diào)DEGs101個(gè)和下調(diào)DEGs134個(gè)，火山圖見圖1。

圖1 DEGs的火山圖

2.2GO和KEGG富集分析 DEGs共富集到194個(gè)GO條目(P<0.05)，其中生物過程(BP)143個(gè)，細(xì)胞組成(CC)21個(gè)和分子功能(MF)30。分別選取BP、CC和MF富集前10條目繪制條形圖結(jié)果，見圖2。BP涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附和凋亡過程等；CC涉及質(zhì)膜、胞外區(qū)和細(xì)胞外間隙等；MF涉及蛋白質(zhì)同源二聚化活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合和相同蛋白結(jié)合等。同時(shí)，KEGG富集分析得到37條信號(hào)通路(P<0.05)，富集前20條通路的氣泡圖如圖3所示。與OA相關(guān)的信號(hào)通路主要有TNF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。

圖2 DEGs的GO富集分析

圖3 DEGs的KEGG富集分析

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)和核心基因 采用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了DEGs的PPI，見圖4，包括203個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)和751次相互作用，平均度值為7.4。利用Cytoscape軟件中cytoHubba插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，以度值排前10的DEGs作為PPI中的核心基因，見圖5。

圖4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 核心差異表達(dá)基因

2.4OA免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分布組間差異 通過CIBERSORT反卷積方法計(jì)算并最終獲得14個(gè)可信樣本，橫坐標(biāo)軸左邊4個(gè)為對(duì)照組，其余10個(gè)為OA組。OA組與正常組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異分析結(jié)果見圖6， OA組織中B細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與對(duì)照組存在顯著差異，見圖7(P<0.05)。

圖6 OA組和對(duì)照組22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)組成

圖7 OA組與正常組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異

2.5骨關(guān)節(jié)炎免疫細(xì)胞相關(guān)性分析 免疫細(xì)胞占比的相關(guān)性分析結(jié)果,見圖8，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)，紅色代表正相關(guān)。結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞與活化的CD4+記憶性T細(xì)胞(r=0.72)、靜息的樹突狀細(xì)胞呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.7)，靜息的CD4+記憶性T細(xì)胞與M1型巨噬細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞呈較強(qiáng)正相關(guān)(r均=0.69)?；罨姆蚀蠹?xì)胞與靜息的肥大細(xì)胞呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r=-0.7)，初始B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r=-0.65)。

圖8 OA免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

2.6中藥預(yù)測(cè)結(jié)果 通過Coremine Medical數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)具有潛在治療OA作用的中藥，見表1，其中郁金、姜黃和黃芩是頻次前3的中藥，故選取3味中藥構(gòu)建中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖9。圖中橢圓為郁金、姜黃和黃芩的有效活性成分，中間黃色長(zhǎng)方形為三者的共同作用靶點(diǎn)，綠色長(zhǎng)方形為非共同作用靶點(diǎn)。郁金、姜黃和黃芩的有效活性成分共同參與ESR1、F10、HSP90AA1、PRKACA、PGR、PTGS1、CHRM3、CHRM1、NCOA2、ADRA1A、CHRM2、CHRNA7、NR3C2、PPARG、AKR1B1等基因的調(diào)控。

表1 具有潛在治療OA作用的中藥

圖9 中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3 討論

隨著高通量基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從微陣列獲得的基因表達(dá)譜已被廣泛用于篩查與各種疾病進(jìn)展相關(guān)的基因和通路[6]。本研究利用GSE55235基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)篩選出OA患者和健康對(duì)照組之間的DEGs共235，其中IL6、IL1β、MMP-9、PTGS2、VEGFA、CXCL8、JUN、MYC等為核心差異基因。IL6和IL1β是最為常見的促炎細(xì)胞因子，有研究顯示細(xì)胞因子IL-6、IL-1β可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的炎癥和凋亡，抑制聚集蛋白聚糖的表達(dá)，刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，從而促進(jìn)OA疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。MMPs是一個(gè)鋅依賴性的蛋白水解酶家族，主要通過分解膠原和蛋白多糖等參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在OA關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及軟骨細(xì)胞破壞的病理過程中起著重要作用[8]。MMP-9又可以通過增加促炎介質(zhì)如TNF-α 和IL-1的表達(dá)加劇局部炎癥，導(dǎo)致軟骨加速退化和軟骨下骨過度生長(zhǎng)等[9]。此外，MMP-9和PTGS2 (Cox-2)在激活時(shí)可以通過降解和裂解膠原蛋白II和軟骨特異性蛋白多糖參與OA軟骨的降解[10]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)在晚期OA升高，VEGF可上調(diào)軟骨細(xì)胞中MMP-1、MMP-3、MMP-13的表達(dá)，下調(diào)關(guān)鍵細(xì)胞外基質(zhì)成分(包括聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白)的表達(dá)，加速軟骨退變的進(jìn)程[11]。VEGF還可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-6、CXC趨化因子IL-8的產(chǎn)生，VEGF除了促血管生成活性外，還具有強(qiáng)大的促炎癥作用[12]。JUN是激活蛋白1(AP-1)的一個(gè)亞基，后者參與軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)，Gao X等[13]研究認(rèn)為，JUN參與了破骨細(xì)胞的分化。MYC通過滅活MAPK信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，防止OA的疾病進(jìn)展[14]。

為進(jìn)一步深入了解OA相關(guān)的生物途徑和信號(hào)通路，對(duì)篩選出的235個(gè)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果表明，參與OA的生物過程主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附和凋亡過程等，這些生物過程無疑與OA疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。KEGG 分析結(jié)果表明，與OA相關(guān)的信號(hào)通路主要有TNF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。TNF信號(hào)通路可以介導(dǎo)KOA炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致滑膜增生和炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB和MAPK均可以通過協(xié)調(diào)多層信號(hào)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致基質(zhì)降解酶、促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[15-16]。OA患者破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的重塑之間的平衡會(huì)逐漸失調(diào)，增強(qiáng)的破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收也是OA的潛在病理機(jī)制[17]。Toll樣受體和NOD樣受體能各自通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)以刺激不同的效應(yīng)分子的表達(dá)，共同作用于炎癥過程[18]。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果顯示，OA組織中B細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)。肥大細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要傳感器和效應(yīng)細(xì)胞，可以誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放和先天免疫細(xì)胞的募集[19]，并通過抑制成骨細(xì)胞活性(如 IL-1、TNF)和/或促進(jìn)破骨細(xì)胞生成(如組胺、TNF、IL-6)來調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)骨代謝[20]。免疫細(xì)胞相關(guān)性分析顯示，M1型巨噬細(xì)胞與活化的CD4+記憶性T細(xì)胞(r=0.72)和靜息的樹突狀細(xì)胞呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.7)，靜息的CD4+記憶性T細(xì)胞與M1型巨噬細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞呈較強(qiáng)正相關(guān)(r=0.69)。巨噬細(xì)胞可以根據(jù)環(huán)境刺激獲得不同的表型，M1型巨噬細(xì)胞主要促進(jìn)炎癥的發(fā)生，可以分泌IL-1β、IL-18、IL-6等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨退化和骨贅形成，而M2型巨噬細(xì)胞主要負(fù)責(zé)抗炎和組織修復(fù)[21]，所以能使M1轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型的藥物也將是治療OA的有效方法。OA屬中醫(yī)“痹癥”、“骨痹”、“痿癥”范疇，證屬本虛標(biāo)實(shí)、本痿標(biāo)痹[22-23]。通過Coremine Medical數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了對(duì)OA有潛在治療作用的中藥，其中郁金、姜黃和黃芪具有較高頻次，并構(gòu)建了中藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。有研究顯示黃芩的有效成分黃芩素可以通過保護(hù)軟骨下骨、抑制血管生成和滑膜增殖來緩解OA[24]。郁金和姜黃均為姜黃屬植物，其中根莖為姜黃、塊根為郁金，具有抗炎、抗氧化、抗癌等多重生物活性[25]。

綜上所述，本研究以GEO中的GSE55235基因表達(dá)芯片為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)的方法篩出235個(gè)DEGs，通過富集分析，發(fā)現(xiàn)OA疾病的發(fā)生發(fā)展與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞粘附、凋亡等生物過程和TNF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B等信號(hào)通路密切相關(guān)。其次，通過CIBERSORT算法和Coremine Medical數(shù)據(jù)庫分析了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式，并預(yù)測(cè)了具有潛在治療OA作用的中藥，為OA發(fā)病機(jī)制和藥物治療提供了新的見解和思路。