夏彥昊 劉慧玲 江潔 吳斌

肝纖維化是一種響應(yīng)于多種慢性肝損傷的肝臟自我修復(fù)過(guò)程，當(dāng)損傷因素持續(xù)存在時(shí)則可能向肝纖維化甚至肝硬化進(jìn)展，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度增生并沉積，肝內(nèi)細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈現(xiàn)為大小不一的無(wú)規(guī)則樣再生結(jié)節(jié)［1-2］。肝星狀細(xì)胞分布于肝細(xì)胞基底側(cè)與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間，為纖維化細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，肝星狀細(xì)胞活化被認(rèn)為是肝纖維化形成的必要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［3-4］。當(dāng)肝臟受到纖維性損傷時(shí)，肝內(nèi)庫(kù)普弗等細(xì)胞通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、TNF-α、血小板生長(zhǎng)因子等為代表的細(xì)胞因子激活肝星狀細(xì)胞［5-6］。肝星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)維持了肝星狀細(xì)胞的持續(xù)激活［7］。

細(xì)胞支架蛋白Arrestins 家族成員β-arrestin1（ARRB1）是一種多功能適應(yīng)蛋白，其與磷酸化G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）結(jié)合以調(diào)控受體脫敏和內(nèi)吞，在許多細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用［8］。p38 屬于絲裂原激活蛋白激酶家族，作為一種可異位至細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子激活者，是多種細(xì)胞功能調(diào)控途徑的關(guān)鍵靶點(diǎn)［9］。既往研究發(fā)現(xiàn)，p38 的活化可誘導(dǎo)肝纖維化，包括血小板生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多種細(xì)胞因子通過(guò)p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活肝星狀細(xì)胞而促進(jìn)肝纖維化［10］。在本研究中，筆者利用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，從肝星狀細(xì)胞激活的角度，探究ARRB1 在肝纖維化中的作用，闡明ARRB1 和p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化從而促進(jìn)肝纖維化的機(jī)制。

材料與方法

一、材 料

1. 標(biāo)本的收集

收集臨床上肝硬化患者的肝穿刺活組織檢查（活檢）樣本，并收集肝血管瘤患者瘤旁正常肝組織作為對(duì)照。收集到的組織樣本迅速放入液氮后送至-80℃冰箱保存，以備提取蛋白質(zhì)。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)別的C57BL/6L 雄鼠12 只，6～8 周齡。所有小鼠于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行繁育、飼養(yǎng)并用于實(shí)驗(yàn)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)審批通過(guò)（批件號(hào)：IACUC-F3-16-0317）。

3. 主要試劑與抗體

CCl4（Sigma，德 國(guó)）、高 糖DMEM 培 養(yǎng) 基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）、TGF-β細(xì)胞因子（MCE，美國(guó)）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（Vector，中國(guó)）、HE 染液及天狼星紅染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、總蛋白提取裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA，Abcam，美國(guó)）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen Ⅰ，Abcam，美國(guó)）、GAPDH（CST，美國(guó)）、ARRB1（Abcam，美國(guó)）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK，CST，美國(guó)）、磷酸化p38（pp38）促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）（CST，美國(guó)）。

4. 細(xì)胞株

人源的正常肝星狀細(xì)胞系LX2 細(xì)胞由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室凍存保種。

5. 儀 器

二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific，美國(guó)）、顯微鏡（Leica，德國(guó)），SDSPAGE 電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀、PCR 儀（BIO-RAD，美國(guó)）。

二、方 法

1.建立肝纖維化小鼠模型及肝組織樣本采樣

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將12 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)表的方法分為對(duì)照組和模型組，每組6 只小鼠。模型組按經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型造模方式進(jìn)行造模，以濃度為20%的CCl4（CCl4∶橄欖油=1∶4 的比例稀釋）按照5 mL/kg 體質(zhì)量的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周2 次，持續(xù)8 周誘導(dǎo)肝纖維化。對(duì)照組僅予以相同劑量的橄欖油進(jìn)行腹腔注射。造模結(jié)束后，對(duì)小鼠腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后行頸椎脫臼處死。剖開(kāi)腹部暴露腹腔，取小鼠相同部位的肝葉，制備肝組織樣本。

2. 染 色

HE 染色：將制備好的蠟塊進(jìn)行切片，經(jīng)脫蠟和水化之后，滴加蘇木素染核2 min，蒸餾水沖洗，在磷酸鹽緩沖液（PBS）中返藍(lán)，之后用伊紅染色30 s，蒸餾水沖洗后在顯微鏡下觀察染色效果，中性樹(shù)膠封片。

天狼星紅染色：將肝組織切片進(jìn)行天狼星紅染色試劑染色2 h，評(píng)價(jià)各組肝組織的形態(tài)學(xué)變化及膠原纖維含量的變化。顯微鏡下觀察拍照。

免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色：將制備好的蠟塊切片進(jìn)行脫蠟和水化處理后，在3%過(guò)氧化氫中孵育10 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)。將玻片放入pH 為9.0 的檸檬酸鈉緩沖液中高壓熱修復(fù)3 min，待室溫冷卻后取出玻片，室溫下于牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3 遍，之后二抗37 ℃孵育2 h。PBS 沖洗3 遍后DAB 顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。采用蘇木素染核后封片，拍照。

細(xì)胞α-SMA 免疫熒光染色：將LX2 細(xì)胞種在24 孔板內(nèi)并進(jìn)行不同的處理， 細(xì)胞貼壁爬片后吸去培養(yǎng)基， 預(yù)溫的PBS 輕輕洗滌3 次。4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS 洗滌3 次，加入封閉液，37 ℃， 60 min。傾去封閉液后加入α-SMA 一抗 4℃過(guò)夜。PBS 洗滌3 次后加入二抗室溫2 h， PBS 洗滌3 次。使用DAPI，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚進(jìn)行細(xì)胞核染色。PBS 洗滌3 次后熒光封片液封片后觀察。

3. 細(xì)胞總蛋白提取及蛋白免疫印跡

根據(jù)總蛋白提取裂解液說(shuō)明書(shū)提取肝臟總蛋白。取蛋白樣品進(jìn)行電泳，應(yīng)用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉2 h。一抗4℃孵育過(guò)夜，對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯像，采用ImageJ 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

4. LX2 正常人肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將LX2 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)處理時(shí)將細(xì)胞接種于6 孔板中，按照不同的實(shí)驗(yàn)需求予以TGF-β 細(xì)胞因子（10 ng/mL）或p38 MAPK 抑制劑（SB203580， 10 μmol）處理。

5.小干擾RNA（siRNA）沉默或質(zhì)粒過(guò)表達(dá)ARRB1 基因

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到50%的密度時(shí)，根據(jù)siRNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，沉默或過(guò)表達(dá)ARRB1 基因。轉(zhuǎn)染效率通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡進(jìn)行檢測(cè)。并在LX2細(xì)胞的ARRB1 基因被沉默或過(guò)表達(dá)的基礎(chǔ)上予以TGF-β 細(xì)胞因子（10 ng/mL）刺激或p38 MAPK 抑制劑（SB203580， 10 μmol）處理。

6. RT-qPCR

根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，測(cè)定RNA 純度與濃度，逆轉(zhuǎn)錄后測(cè)定目的基因的mRNA 表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0 和GraphPad prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)均以 表示，2 組比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，同一對(duì)象不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的相同指標(biāo)采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠肝纖維化模型的建立與評(píng)估

利用野生型C57BJ/6L 背景的雄性小鼠建立由CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型， HE 染色提示與正常小鼠相比，肝纖維化小鼠肝臟切片中出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn)和細(xì)胞排列紊亂。天狼星紅染色可見(jiàn)明顯的膠原纖維間隔形成。免疫組化染色證實(shí)肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA 信號(hào)經(jīng)CCl4誘導(dǎo)8 周后明顯增強(qiáng)（t = 15.010，P ＜ 0.001），且集中分布在膠原纖維沉積區(qū)域。進(jìn)一步的蛋白分析也顯示了肝纖維化指標(biāo)collagen Ⅰ及α-SMA 在模型組高表達(dá)（tcollagenⅠ=8.435，tα-SMA=8.435，P 均＜ 0.05）。以上結(jié)果展示了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的病理學(xué)改變，提示肝星狀細(xì)胞活化及collagen Ⅰ分泌，說(shuō)明造模成功。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和模型組肝纖維化的評(píng)估

二、ARRB1 在肝纖維化組織中表達(dá)升高

對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化的小鼠肝組織切片進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，肝纖維化小鼠的ARRB1 表達(dá)明顯升高（t = 10.200， P ＜0.001）。進(jìn)一步在mRNA 水平檢測(cè)ARRB1 也證實(shí)了其在肝纖維化組織中高表達(dá)。與免疫組織化學(xué)染色及RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果相一致，ARRB1 蛋白水平在模型組也呈上升趨勢(shì)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者進(jìn)一步在肝硬化患者肝組織樣本中檢測(cè)了ARRB1 的表達(dá)，也提示其表達(dá)較正常肝組織升高。以上結(jié)果提示ARRB1 在肝纖維化組織中表達(dá)升高。見(jiàn)圖2。

圖2 ARRB1 在肝纖維化組織中的表達(dá)

三、TGF-β 誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化和ARRB1表達(dá)

基于肝纖維化小鼠中肝星狀細(xì)胞活化和ARRB1 表達(dá)升高，筆者利用人肝星狀細(xì)胞LX2進(jìn)一步探究肝星狀細(xì)胞活化與ARRB1 表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，TGF-β 刺激6、12、24 h 后， LX2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA 表達(dá)在蛋白水平均逐漸上升。α-SMA 免疫熒光染色也提示LX2 細(xì)胞活性在TGF-β 刺激下呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)。ARRB1 的蛋白和mRNA 表達(dá)水平在TGF-β 刺激下呈現(xiàn)與α-SMA相似的變化趨勢(shì)。以上結(jié)果證實(shí)肝星狀細(xì)胞在TGF-β 誘導(dǎo)活化的同時(shí)伴隨著ARRB1 表達(dá)增加，且ARRB1 的表達(dá)水平與細(xì)胞活化程度呈正相關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 TGF-β 誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化和ARRB1 表達(dá)

四、p38 信號(hào)在肝纖維化中活化增強(qiáng)

在同批CCl4造模小鼠中，相對(duì)于對(duì)照組，模型組總的p38 信號(hào)無(wú)明顯變化，但磷酸化增強(qiáng)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 57.420，P ＜ 0.001）。肝硬化患者肝組織樣本和正常人肝組織樣本的蛋白分析顯示出相同的p38 信號(hào)改變。肝組織切片免疫組化染色中，也可見(jiàn)沿肝星狀細(xì)胞所處膠原纖維間隔分布的pp38 信號(hào)。以上結(jié)果提示p38 信號(hào)在肝纖維化中活化增強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

圖4 p38 信號(hào)在肝纖維化中的作用

五、ARRB1 通過(guò)活化p38 信號(hào)激活肝星狀細(xì)胞

為了進(jìn)一步探究ARRB1 和p38 信號(hào)在肝星狀細(xì)胞活化中的作用，筆者團(tuán)隊(duì)首先對(duì)LX2 細(xì)胞行ARRB1 siRNA 轉(zhuǎn)染，ARRB1 沉默后明顯抑制了TGF-β 誘導(dǎo)的LX2 細(xì)胞活化，其活化標(biāo)志物α-SMA 水平明顯降低（F = 270.900，P ＜ 0.001），且伴隨著pp38 的抑制，但不改變總體p38 的水平。接著筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)LX2 細(xì)胞行ARRB1 過(guò)表達(dá)處理，ARRB1-HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染明顯上調(diào)了ARRB1、α-SMA和pp38 水平。在ARRB1 過(guò)表達(dá)的基礎(chǔ)上筆者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步行SB203580 處理，其下調(diào)了ARRB1介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活性和pp38 水平，但不影響ARRB1 表達(dá)。以上結(jié)果表明ARRB1 可以通過(guò)活化p38 信號(hào)來(lái)激活肝星狀細(xì)胞。見(jiàn)圖5。

圖5 ARRB1 和p38 信號(hào)在肝星狀細(xì)胞的作用

討 論

肝纖維化是一種復(fù)雜的可逆的病理過(guò)程，由各種肝損傷引起，其特征在于肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積累，目前缺乏有效的治療手段［1-2］。肝星狀細(xì)胞的激活被認(rèn)為是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)和重要靶點(diǎn)，然而對(duì)它們的細(xì)胞生物學(xué)認(rèn)知仍知之甚少。本研究利用CCl4建立的小鼠肝纖維化模型和人源性肝星狀細(xì)胞LX2 探索肝纖維化的發(fā)生機(jī)制。

ARRB1 最初被確定為GPCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)終止子，但既往的證據(jù)表明，ARRB1 也可用作支架蛋白，并通過(guò)促進(jìn)信號(hào)分子和支架在GPCR 激活時(shí)相互作用來(lái)充當(dāng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)傳感器［11-12］。GPCR激活后，招募ARRB1 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并與磷酸化的GPCR 結(jié)合，阻礙GPCR 與G 蛋白的結(jié)合進(jìn)而阻斷信號(hào)的傳遞（脫敏），ARRB1 通過(guò)這些結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，與其他很多相關(guān)分子形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，在炎癥形成、腫瘤發(fā)生、增殖轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，其也被證實(shí)在肺纖維化、腎纖維化、多發(fā)性硬化癥和原發(fā)性膽汁性肝硬化等多種纖維化疾病中扮演著重要角色［12-13］。與上述研究相一致，在肝硬化患者肝組織和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝組織中，筆者團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)ARRB1 表達(dá)的增加，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了ARRB1 表達(dá)與肝星狀細(xì)胞活化的關(guān)系，其與細(xì)胞的活化程度呈正相關(guān)。因此，ARRB1 可能作為重要的肝星狀細(xì)胞活性的調(diào)控因素參與整個(gè)肝纖維化過(guò)程。

p38 途徑是MAPK 家族主要的3 條經(jīng)典途徑之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、分化和凋亡過(guò)程，p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，包括炎癥、纖維化和癌癥等病變［14-15］。近年來(lái)大量的研究從分子生物學(xué)層面揭示了p38 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化中的作用并闡明了其分子機(jī)制，可能與脂肪酸激活轉(zhuǎn)錄共激活因子 Yes 關(guān)聯(lián)蛋白1 及TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)［15-16］。在此研究中，筆者團(tuán)隊(duì)在患者和小鼠的肝纖維化組織中發(fā)現(xiàn)p38 總量均較正常肝組織無(wú)明顯變化，但其磷酸化明顯增強(qiáng)，且pp38 信號(hào)主要集中在纖維化組織中的肝星狀細(xì)胞活化區(qū)域，為肝星狀細(xì)胞活性和p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系提供了證據(jù)。

p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與一系列炎癥、免疫及表觀遺傳學(xué)相關(guān)的修飾［9，17］。SB203580 是其特異性抑制劑。過(guò)去的報(bào)道表明除GPCR 途徑外，ARRB1還參與很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的驅(qū)動(dòng) ，如核因子κB、MAPK 和內(nèi)皮素-1 等［18-20］。在ARRB1 和p38 MAPK的關(guān)系研究中，筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在肝星狀細(xì)胞LX2中ARRB1 表達(dá)的抑制伴隨著細(xì)胞活性及p38 磷酸化水平的降低。本研究進(jìn)一步確定了ARRB1 與p38 的上下游關(guān)系，闡明ARRB1 可以促進(jìn)p38 磷酸化水平而p38 活性不能反過(guò)來(lái)影響ARRB1 表達(dá)。

綜上所述，ARRB1 作為關(guān)鍵的靶點(diǎn)，其在肝纖維化中表達(dá)升高，通過(guò)活化p38 激活了肝星狀細(xì)胞，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究為靶向ARRB1 和p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗纖維化治療策略提供了新的理論依據(jù)。