蔡 翔 ， 王美君 ， 徐 芬 ， 梁小奇 ， 梁 華 ， 石 怡 ， 周安東 ， 蔡夢茵 △

（1中山大學附屬第三醫(yī)院內分泌與代謝疾病學科，廣東 廣州 510630；2廣東省糖尿病防治重點實驗室，廣東 廣州 510630）

糖尿病在中國已經成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，至2017年，中國糖尿病患病率已達11.2%［1］。糖尿病患者中，大約40%的病人伴有糖尿病腎病（diabetic kidney disease， DKD）。如今，DKD已經成為慢性腎臟疾病的首要原因，給家庭和社會帶來巨大的經濟負擔［2］。

DKD的發(fā)病機制復雜，遺傳因素、氧化應激和炎癥等均參與了DKD的發(fā)生發(fā)展［3］。近年來，越來越多的研究表明自噬功能障礙參與了DKD的發(fā)生發(fā)展，恢復自噬功能起著有效的腎臟保護作用［4］。作為治療糖尿病的新型藥物，鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2抑 制 劑（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor，SGLT2i）受到廣泛關注。SGLT2i在DKD中的腎臟保護作用顯著，大型隨機雙盲對照試驗CREDENCE顯示，SGLT2i卡格列凈（canagliflozin）可有效降低2型糖尿病合并腎臟病患者腎衰竭的風險［5］。然而，SGLT2i腎臟保護功能的分子機制尚未完全明確，既往研究顯示，改善自噬功能可能參與其中［6］，但SGLT2i調控自噬的具體機制尚未完全闡明。

沉默信息調節(jié)蛋白1（sirtuin1， SIRT1）是一種去乙?；?，在維持葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)和改善胰島素抵抗上發(fā)揮重要作用［7］。SIRT1是自噬的正向調控蛋白［8］， DKD中，SIRT1表達下降可導致腎臟細胞自噬功能的損傷［9］。既往研究證實，SIRT1和叉頭框蛋白O3α（FOXO3α）在DKD中下調，激活SIRT1進而上調FOXO3α的表達，可以改善氧化應激或促進FOXO3α下游自噬基因的轉錄，從而改善DKD［10-11］。已有研究顯示，SIRT1的上調參與了SGLT2i在DKD的腎臟保護作用［12］，但 SIRT1-FOXO3α信號通路是否參與了卡格列凈對腎臟細胞的自噬調節(jié)作用尚待研究。腎臟纖維化是糖尿病腎病主要的病理改變之一，而腎臟纖維化是導致終末期腎功能衰竭的最終共同途徑［13］。既往研究顯示，自噬功能受損促進腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，一方面，在自噬調控關鍵蛋白beclin-1敲減的小鼠模型中，自噬功能受損直接導致原代腎臟系膜細胞I型膠原蛋白表達升高［14］；另一方面，自噬活性的下降也可以通過減少TGF-β的降解而導致腎小管TGF-β的累積，進而促進腎臟間質纖維化的發(fā)生［15］。在糖尿病腎病患者的腎臟標本中，研究人員檢測到腎臟纖維化與自噬功能受損有關［16］。既往研究觀察到，提高腎臟細胞的自噬功能可以改善糖尿病腎病腎臟纖維化［17-19］。因此，調節(jié)自噬功能成為治療腎臟纖維化的靶點之一。

本研究通過體外細胞實驗，檢測卡格列凈對高糖干預的小鼠腎小球系膜細胞（SV40 Mes13）自噬功能和纖維化指標的調節(jié)作用，并探究SIRT1-FOXO3α信號通路是否參與其中。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

小鼠SV40 Mes13細胞購自中國科學院細胞庫；攜帶SIRT1shRNA的慢病毒購自上海吉凱基因化學有限公司；自噬雙標腺病毒mRFP-GTP-LC3購自上海漢恒生物科技有限公司；D-葡萄糖、DMEM液體培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；核蛋白提取試劑盒購自Beyotime；兔抗SIRT1、FOXO3α、p62、微管相關蛋白1輕鏈 3B（LC3B）及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗αSMA抗體，COL1A1和COL3A1抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）偶聯(lián)的Ⅱ抗購自Abcam；Trizol購自Invitrogen；PrimeScript? RT Master Mix逆轉錄試劑盒和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均購自TaKaRa；所用引物由廣州天一輝遠基因科技有限公司設計合成，見表1。垂直電泳-轉膜裝置和化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

2 主要方法

2.1 SV40 Mes13細胞的培養(yǎng)和分組 取小鼠腎小球系膜細胞SV40 Mes13細胞種植于6孔板中，分為3組，分別用5.6 mmol/L葡萄糖（NG）、30 mmol/L葡萄糖（HG）［20］及 100 nmol/L卡格列凈［21］和30 mmol/L 葡萄糖共干預48 h。

2.2 敲減SIRT1的SV40 Mes13細胞系構建 取生長良好的SV40 Mes13細胞接種于6孔板內，細胞密度達到30%時，用表達SIRT1短發(fā)夾RNA （shRNA）序列的慢病毒載體或空載慢病毒作為對照轉染SV40 MES13細胞，并按照說明書在病毒轉染12 h后進行細胞換液，換上新鮮培養(yǎng)液。病毒轉染72 h后對SV40 Mes13細胞采用Western blot檢測SIRT1表達情況，驗證慢病毒干擾效率。確認慢病毒轉染成功后進行后續(xù)實驗。

2.3SIRT1敲減后SV40 Mes13細胞培養(yǎng) 慢病毒轉染SV40 Mes13細胞36 h后，將細胞分別置于NG、HG或HG和100nmol/L卡格列凈共干預3種條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.4 細胞核漿蛋白分離 用PBS清洗細胞后，用細胞刮收集細胞，得到的細胞懸液經100×g離心得到細胞沉淀，按照試劑盒說明書依次加入試劑盒中的細胞漿蛋白抽提試劑A和細胞漿蛋白抽提試劑B，于4 ℃、15 000×g離心得到的上清為漿蛋白，最后向沉淀中加入試劑盒中的細胞核蛋白抽提試劑，每3 min高速渦旋混勻一次，30 min后于4 ℃、15 000×g離心，得到的上清保存為核蛋白。分別將得到的漿蛋白和核蛋白置于-80 ℃保存，用于后續(xù)Western blot實驗。

2.5 Western blot 用細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，蛋白上樣量為30 μg。用12.5% PAGE凝膠進行電泳分離蛋白，后采用280mA恒流進行轉膜，轉膜時間為80 min。轉膜結束后，將PVDF摸放入5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1 h后分別加入相應的Ⅰ抗：兔抗 LC3B 抗體（1∶500）、兔抗 p62抗體（1∶1 000）、兔抗SIRT1抗體（1∶1 000）、兔抗FOXO3α抗體（1∶1 000）、兔抗 α-SMA 抗體（1∶1 000）、兔抗COL1A1抗體 （1∶1 000）、兔抗 COL3A1抗體（1∶1 000）和兔抗β-actin抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶10 000）常溫孵育60 min后，使用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)觀察蛋白質條帶。

2.6 自噬雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3轉染實驗觀察細胞內自噬流 將慢病毒轉染成功后的SV40 Mes13細胞接種于培養(yǎng)皿中，待細胞鋪滿30%時采用自噬雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3轉染細胞，按照說明書觀察細胞轉染情況并進行換液［22］。腺病毒轉染36 h后將細胞分組，分別給予NG、HG或HG和100 nmol/L卡格列凈共干預48 h。干預結束后，用0.4%多聚甲醛固定細胞，在熒光顯微鏡下觀察。每孔取5個視野觀察并拍照。紅、綠熒光合并后可觀察到黃色斑點為自噬體，紅色斑點為自噬溶酶體，記錄每組每個細胞黃色斑點和紅色斑點的數(shù)目，進行統(tǒng)計分析。

2.7 RNA提取和RT-qPCR檢測 用Trizol提取細胞RNA。參考試劑盒說明書，將RNA用PrimeScript RT Master Mix逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA后，再使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行RT-qPCR反應，參照試劑盒說明書配制反應體系。采用2-△△Ct方法分析計算目的基因的相對表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)并繪制統(tǒng)計分析圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，用單因素方差分析檢測多組之間的差異，進一步兩兩比較使用Tukey檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 卡格列凈改善高糖干預下SV40 Mes13細胞的自噬功能

Western blot結果顯示，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細胞自噬底物p62蛋白水平上升，LC3B-II/LC3B-I下降（P＜0.05），100 nmol/L卡格列凈與HG共干預48 h后，SV40 Mes13細胞p62蛋白水平較HG組下降，LC3B-II/LC3B-I較HG組上升（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Canagliflozin （Cana） improved autophagy in SV40 Mes13 cells under high glucose （HG） condition. Western blot analysis for p62 and LC3B expression in SV40 Mes13 cells treated with normal glucose （NG； 5.6 mmol/L glucose）， HG （30 mmol/L glucose） and HG with Cana （100 nmol/L）. Mean±SD. n=4. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖1 卡格列凈改善高糖環(huán)境下SV40 Mes13細胞的自噬水平

2 卡格列凈上調高糖干預下SV40 Mes13細胞中SIRT1與FOXO3α的表達水平

用Western blot檢測3組細胞中SIRT1與FOXO3α達情況。結果顯示，與NG組相比，HG組中SV40 Mes13細胞中SIRT1和FOXO3α蛋白水平下降， 100 nmol/L卡格列凈與HG共干預48 h后，SIRT1與FOXO3α的蛋白水平較HG組上調（P＜0.05），見圖2。RT-qPCR結果顯示，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細胞中FOXO3α及FOXO3α下游與自噬靶基因BNIP3水平下降，100 nmol/L卡格列凈與HG共干預48 h后，F(xiàn)OXO3α和BNIP3 mRNA水平較HG組上調（P＜0.05），見圖3。

3 卡格列凈上調SV40 Mes13 細胞中FOXO3α核轉位的作用依賴于SIRT1

用攜帶SIRT1shRNA的慢病毒轉染SV40 Mes13細胞，敲減SIRT1，以進一步明確SIRT1在卡格列凈上調FOXO3α中的作用。Western blot結果顯示，與空載病毒對照組相比，SIRT1敲減組中SIRT1蛋白表達量降低大于 75%（P＜0.05），說明敲減SIRT1的SV40 Mes13細胞系構建成功。對照組中，卡格列凈上調HG干預下FOXO3α蛋白核漿比及FOXO3α和BNIP3水平（P＜0.05），敲減SIRT1后，卡格列凈上調HG干預下FOXO3α蛋白核漿比、FOXO3α和BNIP3的作用消失（P＞0.05），見圖4、5。

4 卡格列凈改善SV40 Mes13細胞自噬水平的作用依賴于SIRT1

Western blot結果顯示，SIRT1敲減組，卡格列凈與HG共干預后，SV40 Mes13細胞p62蛋白及LC3BII/LC3B-I水平與HG組相比無統(tǒng)計學差異，卡格列凈改善SV40 Mes13細胞自噬功能的作用消失（P＞0.05），見圖6。自噬雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3實驗結果顯示，空載病毒對照組中，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細胞中黃色斑點增多，紅色斑點相對減少，即自噬溶酶體減少，自噬小體增多；卡格列凈與HG共干預48 h后，SV40 Mes13細胞中黃色斑點相對HG組減少，紅色斑點增多，自噬溶酶體增多，自噬流得到改善。而敲減SIRT1后，卡格列凈改善自噬流的作用消失，見圖7。

5 卡格列凈改善SV40 Mes13細胞纖維化的作用依賴于SIRT1

Figure 2. Canagliflozin （Cana） up-regulated SIRT1 and FOXO3α in SV40 Mes13 cells under high glucose （HG） environment. Western blot analysis for SIRT1 and FOXO3α expression in SV40 Mes13 cells treated with normal glucose（NG）， HG or HG with Cana. Mean±SD. n=4. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖2 卡格列凈上調高糖環(huán)境下SV40 Mes13細胞SIRT1和FOXO3α蛋白表達

Figure 3. Canagliflozin （Cana） up-regulated the mRNA levels of FOXO3α （A） and BNIP3 （B） in SV40 Mes13 cells under high glucose （HG） environment. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs normal glucose（NG） group； #P＜0.05 vs HG group.圖3 卡格列凈上調高糖環(huán)境下SV40 Mes13細胞中FOXO3α及BNIP3的mRNA表達水平

在空載病毒對照組中，與NG組相比，HG組SV40 Mes13細胞纖維化指標α-SMA、COL1A1和COL3A1蛋白水平上升，α-SMA與COL1A1 mRNA水平上升（P＜0.05）；100 nmol/L卡格列凈與HG共干預48 h后，α-SMA、COL1A1和COL3A1蛋白水平較HG組下降，α-SMA與COL1A1水平較HG組下降（P＜0.05），SIRT1敲減后，卡格列凈干預組纖維化指標蛋白水平及mRNA水平與HG組相比無顯著差異（P＞0.05），見圖8。

討 論

DKD作為一種糖尿病并發(fā)癥，已成為我國終末期腎病的首要病因。系膜細胞等腎臟固有細胞的自噬功能受損參與到了 DKD 的發(fā)生發(fā)展中［4，19，23］。因此，改善腎臟細胞的自噬功能對延緩DKD進展起著十分關鍵的作用。SGLT2i在DKD中腎臟保護作用顯著，恢復腎臟細胞自噬功能是其可能的腎臟保護機制之一［6］。已有多項研究證實SGLT2i促進腎臟細胞自噬。既往研究報道，高糖條件下，達格列凈激活人腎小管細胞AMPK，并抑制mTOR，改善細胞自噬［24］。Lee等［25］觀察到，在STZ誘導的DKD小鼠模型腎臟以及高糖干預的人腎小管細胞中，恩格列凈通過激活AMPK增強細胞自噬。卡格列凈是首個在腎臟終點研究中被證實腎臟硬終點獲益的降糖藥［5］，但目前關于其調節(jié)腎臟細胞自噬功能的研究尚少。在本研究中，我們觀察到在高糖環(huán)境中，小鼠腎系膜細胞系SV40 Mes13細胞自噬功能受損，而卡格列凈可以促進SV40 Mes13細胞自噬。

Figure 4. Canagliflozin （Cana） up-regulated FOXO3α nuclear translocation in SV40 Mes13 cells in a SIRT1-dependent manner.Western blot analysis of SIRT1， nuclear FOXO3α and cytoplasmic FOXO3α in SV40 MES13 cells transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA and treated with normal glucose （NG）， high glucose （HG） and HG with Cana.Mean± SD. n=3. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖4 卡格列凈促進SV40 Mes13細胞FOXO3α核轉位的作用依賴于SIRT1

Figure 5. Canagliflozin （Cana） up-regulated the mRNA expression of FOXO3α （A） and BNIP3 （B） in a SIRT1-dependent manner.Mean±SD. n=4. *P＜0.05 vs normal glucose （NG） group； #P＜0.05 vs high glucose （HG） group.圖5 卡格列凈上調SV40 Mes13細胞FOXO3α和BNIP3的作用依賴于SIRT1

Figure 6. The effect of canagliflozin（Cana） on improving autophagy in SV40 Mes13 cells was dependent on SIRT1. Western blot analysis of p62 and LC3B in SV40 Mes13 cells transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA and treated with normal glucose （NG）， high glucose（HG） and HG with canagliflozin. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖6 卡格列凈改善SV40 Mes13細胞自噬水平的作用依賴于SIRT1

Figure 7. Changes of autophagy in SV40 Mes13 cells transfected with mRFP-GFP-LC3. The autophagic flux was observed by mRFPGFP-LC3（the yellow dots indicate autophagosomes， while the red dots indicate autophagolysosomes in merged images）.Numbers of autophagosomes （yellow dots in merged images） per cell and numbers of autophagolysosomes （red dots in merged images） per cell were shown. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs normal glucose（NG） group； #P＜0.05 vs high glucose（HG） group.圖7 mRFP-GFP-LC3腺病毒轉染后SV40 Mes13細胞內自噬流情況的變化

SGLT2i促進腎臟細胞自噬的分子機制研究尚未完全闡明，目前已有的研究主要集中于AMPK/mTOR信號通路［6，24-25］，而與 SIRT1有關的自噬信號通路少有報道。既往研究結果顯示，在DKD小鼠模型中，腎臟組織SIRT1表達下調［26-29］。本研究觀察到，高糖環(huán)境下，小鼠SV40 Mes13細胞SIRT1的表達下降。SIRT1在DKD中起腎臟保護作用，可以通過去乙酰化修飾自噬蛋白促進腎臟細胞自噬，延緩DKD［8-9］。Packer［30］總結，SGLT2i通過促進葡萄糖排泄，模擬機體營養(yǎng)剝奪的生理狀態(tài)，上調腎臟的SIRT1表達。本研究結果顯示，高糖環(huán)境中，卡格列凈恢復SV40 Mes13細胞SIRT1的表達水平。研究顯示，在DKD大鼠足細胞中，SGLT2i上調SIRT1，同時增強足細胞自噬，緩解足細胞損傷［31］。但該研究并未通過敲除大鼠腎臟SIRT1來進一步明確SIRT1是否介導了SGLT2i改善足細胞自噬的作用。本研究觀察到，高糖環(huán)境中，SIRT1被敲減后，卡格列凈改善SV40 Mes13細胞的自噬功能的作用消失。以上結果說明，SIRT1介導了卡格列凈促進SV40 Mes13細胞自噬的作用。

除了直接乙?；{節(jié)自噬蛋白，SIRT1還可以通過去乙?；揎椶D錄因子FOXO3α，激活FOXO3α的轉錄活性，促進FOXO3α下游自噬靶基因的表達［32］。既往研究顯示，在DKD小鼠腎臟足細胞中，SIRT1-FOXO3α通路受抑制，P2Y2R敲減后，SIRT1和FOXO3α表達上調，F(xiàn)OXO3α的轉錄活性增強，足細胞自噬功能改善［11］。本研究觀察到，在小鼠腎系膜細胞系SV40 Mes13細胞中，高糖環(huán)境中，隨著SIRT1表達下降，F(xiàn)OXO3α的表達下降，核轉位減少，Mammucari等［33］報道，F(xiàn)OXO3α主要通過上調Bnip3改善自噬，因此，Bnip3可以作為反映FOXO3α轉錄活性的指標之一。并且，BNIP3在DKD中起腎臟保護作用。BNIP3的下降與DKD患者微量蛋白尿的發(fā)生有關［34］。通過上調BNIP3，可以促進自噬，改善DKD腎臟纖維化［35］。本研究觀察到，在SV40 Mes13細胞中，高糖環(huán)境中，隨著SIRT1表達下降，F(xiàn)OXO3α的表達下降，核轉位減少，下游Bnip3下降；卡格列凈增強FOXO3α核轉位的同時上調Bnip3；SIRT1被敲減后，卡格列凈上述作用消失。以上結果說明，在SV40 Mes13細胞中，高糖抑制SIRT1-FOXO3α通路，而卡格列凈激活SIRT1-FOXO3α通路，進而促進其下游自噬基因的表達，促進細胞自噬。

Figure 8. The effect of canagliflozin（Cana） on fibrosis in SV40 Mes13 cells was dependent on SIRT1. A： Western blot analysis of COL1A1， COL3A1 and α-SMA in SV40 Mes13 cells transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA and treated with normal glucose （NG）， high glucose （HG） and HG with Cana； B and C： the mRNA levels of α-SMA and COL1A1 in SV40 Mes13 cells treated with NG， HG and HG with Cana transfected with lentiviral SIRT1 shRNA or scrambled shRNA. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs NG group； #P＜0.05 vs HG group.圖8 卡格列凈改善SV40 Mes13細胞纖維化的作用依賴于SIRT1

系膜細胞自噬功能受損是小鼠腎臟纖維化的原因之一。Kim等［14］觀察到，抑制系膜細胞自噬功能導致胞外膠原蛋白I的沉積，而誘導自噬可促進膠原蛋白I的降解，從而改善腎臟纖維化。既往研究顯示，在DKD體內及體外模型中，增強腎系膜細胞自噬功能有利于改善其纖維化［23，36］。Chen 等［23］觀察到，在STZ誘導的DKD小鼠模型及體外高糖培養(yǎng)的小鼠腎系膜細胞中，lncRNA SOX2OT通過抑制Akt/mTOR促進腎系膜細胞自噬，改善系膜細胞的過度增殖和纖維化，延緩DKD的進展。另有研究結果顯示，在高糖培養(yǎng)的SV40 Mes13細胞中，F(xiàn)BW7通過抑制mTOR改善細胞自噬，從而改善SV40 Mes13細胞炎癥和纖維化［36］。在腎小管細胞中，恩格列凈通過改善高糖環(huán)境下細胞的自噬功能，下調纖維化指標［37］。本研究結果顯示，在小鼠腎系膜細胞系SV40 Mes13細胞中，卡格列凈改善高糖環(huán)境下自噬功能，同時下調纖維化指標α-SMA、COL1A1和COL3A1的表達。SIRT1被敲減后，卡格列凈改善SV40 Mes13細胞自噬功能和改善纖維化的作用同時消失。因此，通過改善自噬可能是卡格列凈改善SV40 Mes13細胞纖維化的機制之一。

綜上所述，本研究顯示，高糖抑制SV40 Mes13細胞SIRT1-FOXO3α通路，導致細胞自噬功能受損及細胞纖維化。高糖環(huán)境下，卡格列凈可通過激活SIRT1-FOXO3α通路，增強SV40 Mes13細胞自噬，并改善SV40 Mes13細胞纖維化。本研究為進一步理解卡格列凈對腎臟系膜細胞的保護作用提供參考資料。由于本研究僅在小鼠腎系膜細胞系中進行實驗，此后還需在其他不同類型的腎臟細胞和DKD動物模型中進一步探索卡格列凈對SIRT1-FOXO3α通路的影響。