嚴(yán) 浩，王玉棟，鐘 武，莊 洋，楊 宏,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

白鰱具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且其價(jià)格低廉易養(yǎng)殖，常被用來制作魚糜，但由于脂肪氧化、酶促反應(yīng)的影響，會(huì)產(chǎn)生難聞的腥味，已有多項(xiàng)研究證明己醛、壬醛和1-辛烯-3-醇是鰱魚腥味的主要來源[1-3]。目前已有許多方法用于水產(chǎn)品腥味的去除，如活性炭吸附等物理方法[4]，雙氧水漂洗、酸堿漂洗等化學(xué)方法[5-6]，以及生物發(fā)酵去腥[7]，但前者更適用于液體以及氣體，化學(xué)方法去腥則可能導(dǎo)致魚糜中化學(xué)成分發(fā)生改變，生物發(fā)酵去腥則會(huì)使蛋白變性使水產(chǎn)品的理化性質(zhì)發(fā)生改變[2]。

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）、蛋清蛋白（egg white protein，EWP）、乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI），由于其多種功能特性（如起泡性、凝膠性、黏著性等），被廣泛的應(yīng)用于魚糜凝膠中。研究表明，一定pH值下，WPI含量的增加能增強(qiáng)對(duì)己醛、1-辛烯-3-醇的結(jié)合[8]；汪娟[9]研究發(fā)現(xiàn)，SPI對(duì)己醛、壬醛具有較好的結(jié)合能力，但會(huì)增強(qiáng)1-辛烯-3-醇的釋放；而有關(guān)EWP對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合能力的研究較少。揮發(fā)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合主要通過可逆的疏水相互作用，其他的結(jié)合方式包括氫鍵、范德華力、離子鍵以及不可逆的化學(xué)共價(jià)交聯(lián)，如醛酮類物質(zhì)主要與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域通過疏水相互作用結(jié)合，而醇類物質(zhì)則可通過氫鍵與蛋白質(zhì)的羥基發(fā)生可逆結(jié)合[10]。另外不同種類蛋白質(zhì)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合能力也存在差異，如小麥蛋白對(duì)醛酮類物質(zhì)的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于油菜蛋白以及豌豆蛋白[11]。

目前已有關(guān)于肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）結(jié)合己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇的研究，MP濃度[12]、pH值[13-14]、鹽離子強(qiáng)度及種類[15]、蛋白氧化[16]、外源添加物[2]等因素均可對(duì)其結(jié)合能力產(chǎn)生影響，如在Xue Chao[17]和Zhang Huimin[2]等的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母β-葡聚糖可通過提升白鰱MP結(jié)合己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇的能力抑制白鰱的腥味。而有關(guān)于外源蛋白對(duì)MP的研究，多是集中于凝膠性能的研究，有關(guān)外源蛋白對(duì)MP結(jié)合腥味物質(zhì)能力的研究鮮有報(bào)道。本研究通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜研究SPI、EWP、WPI添加量對(duì)白鰱魚糜MP結(jié)合己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇能力的影響，并探究不同外源蛋白添加量下MP結(jié)構(gòu)變化與其結(jié)合能力的關(guān)系，可為調(diào)控白鰱魚糜的腥味提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍白鰱魚糜（AA級(jí)） 洪湖市井力水產(chǎn)食品股份有限公司；SPI 河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；EWP安徽省亳州市眾意蛋業(yè)有限責(zé)任公司；WPI 美國(guó)希爾瑪奶酪公司；己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇（均為色譜級(jí)）上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)） 德國(guó)CNW科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；X-30RC高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；UV-1700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；F-4600熒光光譜儀 日本日立公司；ZS90納米粒度電位分析儀 英國(guó)Malvern公司；7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭美國(guó)Supeleo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 MP提取

參考Fan Mingcong等[18]的方法略作修改。稱取2.5 g魚糜，加入4 倍體積低鹽緩沖液（0.05 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4、15.5 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5），9000 r/min均質(zhì)1 min，4 ℃靜置15 min，4 ℃、10000 r/min離心10 min，重復(fù)提取3 次，取沉淀。將沉淀溶于4 倍體積的高鹽緩沖液（0.45 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4、15.5 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5），9000 r/min均質(zhì)1 min，4 ℃放置22 h后12000 r/min離心10 min（4 ℃），取上清液用10 倍體積的冷凝水沉淀30 min，10000 r/min離心10 min（4 ℃），取沉淀用15 mL溶解液溶解（0.6 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5），即得MP溶液。

1.3.1.2 樣品溶液制備

參考Xue Chao[17]和夏培浩[19]等的方法略作修改。將MP稀釋至4 mg/mL，向溶液中添加溶解好的SPI、EWP、WPI 4 ℃條件下用溶解液溶解12 h后，離心取上清液，使其添加量為MP的2%、4%、6%。

1.3.1.3 特征腥味物質(zhì)溶液制備

將己醛、壬醛和1-辛烯-3-醇標(biāo)準(zhǔn)品用少量色譜級(jí)甲醇溶解，混勻后用超純水稀釋，使三者的質(zhì)量濃度分別為0.5、0.1、0.5 g/100 mL，用棕色小瓶保存待用。

1.3.2 分析檢測(cè)

1.3.2.1 表面疏水性

參考Jia Na等[20]的方法略作修改。取1 mL 4 mg/mL的MP懸浮液添加200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB），混合均勻后室溫下反應(yīng)2 h，6000 r/min離心15 min（4 ℃）。將上清液用溶解液稀釋10 倍，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行。BPB結(jié)合量按式（1）計(jì)算：

式中：A溶解液為溶解液的吸光度；A樣品為樣品的吸光度。

1.3.2.2 濁度

將MP質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL，采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)350 nm處測(cè)量透過率（T），每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行，按式（2）計(jì)算濁度[21]：

1.3.2.3 粒徑和Zeta電位

參考Zheng Jiabao等[21]的方法略作修改。將MP稀釋至0.1 mg/mL和0.01 mg/mL，納米粒徑電位分析儀分別測(cè)定樣品的粒徑以及電位。樣品粒徑在25 ℃通過配備4 mW氦/氖激光器的動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量，波長(zhǎng)輸出為633 nm，并在173°的檢測(cè)角下進(jìn)行反向散射校準(zhǔn)。Zeta電位在25 ℃下使用電泳遷移率池（DTS1070）測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行。

1.3.2.4 內(nèi)源熒光光譜

參考Liu Qian等[22]的方法略作修改。將MP稀釋至0.1 mg/mL，轉(zhuǎn)移至光程為1 cm的石英比色皿，使用熒光光譜儀進(jìn)行測(cè)定。樣品在波長(zhǎng)280 nm處被激發(fā)，發(fā)射光譜在300～400 nm范圍內(nèi)記錄，激發(fā)和發(fā)射狹縫的寬度均為5 nm的固定值，掃描速率為60 nm/min，電壓為400 V。每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行。

1.3.2.5 紫外全掃描

參考Wang Yu等[23]的方法略作修改。將MP稀釋至0.3 mg/mL，轉(zhuǎn)移到光程為1 cm的石英比色皿，采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)230～400 nm內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行。

1.3.2.6 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜

參考An Yueqi等[1]的方法略作修改。取5 mL樣品溶液于15 mL頂空瓶中，并添加5 μL配制好的特征腥味物質(zhì)溶液，4 ℃放置12 h后，采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行分析。40 ℃平衡10 min后采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附30 min，將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，250 ℃解吸5 min。

氣相色譜條件：H P-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序最初為40 ℃，保持4 min，之后以4 ℃/min的恒定速率升溫至250 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流量為恒定速率1.0 mL/min，采用不分流模式進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；氣質(zhì)接口溫度280 ℃；檢測(cè)器電壓1.2 kV；掃描范圍40～350 u，掃描速率2.0 scans/s。

MP對(duì)腥味物質(zhì)的結(jié)合能力用游離揮發(fā)性化合物的百分比表示，每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行，按式（3）計(jì)算：

式中：Ac為MP揮發(fā)性化合物的峰面積；As為添加不同質(zhì)量濃度外源蛋白后揮發(fā)性化合物的峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2018整理數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行顯著性分析，Origin 2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

Bertsch等[24]的研究中證明BPB分子可以與蛋白表面的疏水位點(diǎn)結(jié)合，因此可通過BPB結(jié)合量表征白鰱魚糜MP表面疏水性的變化。如圖1所示，外源蛋白添加量增加，MP的BPB結(jié)合量先增大后減小，添加4% SPI、2% EWP和4% WPI時(shí)MP的BPB結(jié)合量顯著高于組內(nèi)其余樣品（P＜0.05），表明此添加量下樣品具有最大的表面疏水性，MP解折疊程度最大。表面疏水性的增強(qiáng)可歸結(jié)于外源蛋白與MP產(chǎn)生的相互作用，Herrero等[25]的研究中SPI可以減少M(fèi)P中α-螺旋的含量，促使MP展開，暴露出更多的疏水基團(tuán)，同樣一定量的EWP也能夠促進(jìn)MP的展開[26]。表面疏水性的下降可能是由于當(dāng)?shù)鞍诐舛瘸^一定臨界限時(shí)，不同大分子蛋白由于其大分子質(zhì)量以及熱力學(xué)不相容性，容易發(fā)生相分離形成單獨(dú)的相，從而使蛋白的疏水位點(diǎn)被包埋[27]。另外，相較于其他2 組樣品，添加EWP的樣品BPB結(jié)合量更低，這是因?yàn)榈扒宓鞍字兄饕牡鞍踪|(zhì)卵白蛋白的疏水性氨基酸殘基均位于蛋白的內(nèi)部[28]。

圖1 外源蛋白對(duì)MP BPB結(jié)合量的影響Fig.1 Effects of external proteins on the BPB binding ability of MP

2.2 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白濁度的影響

如圖2所示，在添加SPI、EWP、WPI后，樣品的濁度皆大于對(duì)照組，這與蛋白質(zhì)聚集體的存在有關(guān)，表明可能形成了不溶性聚集體，降低了溶解度，這是由于蛋白內(nèi)部疏水性氨基酸殘基的暴露，蛋白之間的疏水相互作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致MP的聚集程度加深[13]。研究表明非共價(jià)相互作用力是蛋白質(zhì)聚集的直接驅(qū)動(dòng)力，疏水基團(tuán)的暴露有助于蛋白質(zhì)的聚集[22]，在Shen Hui等[13]的報(bào)道中，在pH 5～7的范圍內(nèi)，pH值可增強(qiáng)MP表面疏水性，MP溶液的濁度隨之上升?？梢钥吹教砑覵PI、WPI的樣品濁度變化規(guī)律與圖1表面疏水性的結(jié)果一致，而對(duì)于添加EWP的樣品，隨著蛋白添加量的增加，樣品的濁度變化較小，這可能是由于蛋白的進(jìn)一步展開導(dǎo)致α-螺旋減少，蛋白內(nèi)部的氫鍵遭到破壞，暴露出蛋白表面的氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，水分子羥基通過氫鍵增強(qiáng)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，兩者的親和力增強(qiáng)，形成的聚集體更容易溶解在溶液中[29-30]。

圖2 外源蛋白對(duì)MP濁度的影響Fig.2 Effects of external proteins on the turbidity of MP

2.3 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白平均粒徑的影響

粒徑的大小與蛋白分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)相關(guān)，而疏水相互作用增強(qiáng)有助于蛋白分子的交聯(lián)以及聚集體的形成，另外蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用也與蛋白質(zhì)聚集體的形成有關(guān)[13]。如圖3所示，隨著外源蛋白添加量的增加，MP的平均粒徑呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中添加4% SPI、2% EWP、2% WPI的樣品平均粒徑顯著高于組內(nèi)其余樣品（P＜0.05），可歸結(jié)于顯著增加的表面疏水性引起了蛋白之間的強(qiáng)相互作用使蛋白質(zhì)聚集程度增加，而粒徑的減小則是由于蛋白分子之間的靜電引力不足，使蛋白分子的聚集程度降低[13]。另外，當(dāng)外源蛋白添加過多時(shí)，不同大分子蛋白由于其大分子質(zhì)量以及熱力學(xué)不相容性，會(huì)使不同的蛋白質(zhì)自聚集形成單獨(dú)的相，此時(shí)蛋白質(zhì)的粒徑也會(huì)有所降低[31]。

圖3 外源蛋白對(duì)MP平均粒徑的影響Fig.3 Effects of external proteins on the average particle size of MP

2.4 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白Zeta電位的影響

蛋白質(zhì)的分散、聚集均會(huì)影響其表面電荷的變化[13]。如圖4所示，所有樣品的Zeta電位值均為負(fù)值，表明蛋白表面均帶負(fù)電荷。3 種混合溶液的Zeta電位隨著外源蛋白添加量的增加先增大后減小，在SPI、EWP、WPI添加量分別為4%、2%、4%時(shí)，樣品的Zeta電位顯著高于組內(nèi)其余樣品（P＜0.05）。Zeta電位增加，表明蛋白分子間的靜電引力大于靜電斥力，此時(shí)的靜電相互作用能夠促使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集；而隨外源蛋白添加量進(jìn)一步增加，MP的Zeta電位顯著降低（P＜0.05），此時(shí)蛋白分子間靜電斥力更大，分子間靜電斥力會(huì)降低蛋白質(zhì)間的聚集度[21]，進(jìn)一步解釋了圖3中外源蛋白添加過量后蛋白分子平均粒徑有所下降的現(xiàn)象。

圖4 外源蛋白對(duì)MP Zeta電位的影響Fig.4 Effects of external proteins on the zeta potential of MP

2.5 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

內(nèi)源熒光光譜對(duì)色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性變化極其敏感，是評(píng)價(jià)蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的重要方法，通常蛋白在折疊狀態(tài)下，色氨酸殘基處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水環(huán)境中，蛋白溶液具有較高的熒光強(qiáng)度，此時(shí)，蛋白質(zhì)表面具有較多的親水基團(tuán)，表面疏水性較低[22,32]。如圖5所示，添加4% SPI的樣品熒光強(qiáng)度明顯低于組內(nèi)其余樣品，最大吸收峰略微紅移，這表明SPI添加量為4%時(shí)能夠促進(jìn)MP展開，色氨酸殘基暴露到更加親水的環(huán)境中[22]，這與圖1表面疏水性的結(jié)果一致。而添加EWP后，MP的熒光強(qiáng)度明顯降低，但隨著添加量的增加MP熒光強(qiáng)度的變化并不明顯，表明EWP能夠促使MP展開，但其含量的增加對(duì)MP三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響不大。而對(duì)于添加WPI的樣品，隨著WPI添加量的增加，蛋白溶液的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，WPI添加量為4%時(shí)具有最低的熒光強(qiáng)度，此時(shí)由于蛋白展開，暴露出的色氨酸基團(tuán)引起了熒光猝滅現(xiàn)象；添加量繼續(xù)增大，MP的熒光強(qiáng)度明顯下降，其最大吸收峰略微藍(lán)移，表明蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，色氨酸殘基被重新包埋進(jìn)蛋白內(nèi)。

圖5 外源蛋白對(duì)MP內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of external proteins on the intrinsic fluorescence intensity of MP

2.6 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白紫外吸收光譜的影響

紫外吸收光譜能夠識(shí)別3 種芳香族氨基酸殘基（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸），尤其是酪氨酸殘基所處微環(huán)境的變化，可用來辨別蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[23]。由圖6可知，所有樣品均在波長(zhǎng)275 nm左右觀察到吸收峰，表明酪氨酸的存在[33]。而在添加SPI、EWP以及WPI后，樣品溶液的吸光度均高于對(duì)照組，表明外源蛋白能促進(jìn)MP展開，暴露出更多酪氨酸殘基。此外，隨著SPI添加量的增加，MP最大吸收峰略微藍(lán)移，表明SPI與MP之間產(chǎn)生相互作用促使酪氨酸殘基所處環(huán)境的極性增加。MP的內(nèi)源熒光光譜以及紫外吸收光譜的結(jié)果表明，外源蛋白的添加能使色氨酸、酪氨酸殘基所處環(huán)境的極性增強(qiáng)，表明外源蛋白能夠促使MP展開。

圖6 外源蛋白對(duì)MP紫外吸收光譜的影響Fig.6 Effects of external proteins on the UV absorption spectrum of MP

2.7 外源蛋白對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)合特征腥味物質(zhì)能力的影響

如圖7A、B所示，MP溶液中游離己醛、壬醛含量變化基本一致，隨著外源蛋白添加量的增大，MP溶液中己醛、壬醛的含量均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，添加量為4%時(shí)，溶液中游離的己醛、壬醛含量顯著低于組內(nèi)其余樣品（P＜0.05），僅添加6% EWP的樣品在組內(nèi)具有最大的壬醛結(jié)合能力，表明3 種外源蛋白均能增強(qiáng)MP對(duì)己醛、壬醛的結(jié)合能力。通常，蛋白對(duì)醛類物質(zhì)的結(jié)合能力與其表面疏水性呈正相關(guān)，其結(jié)合能力的增強(qiáng)可歸結(jié)于蛋白展開暴露出更多的疏水結(jié)合位點(diǎn)[10]。而圖1和圖5顯示，隨著外源蛋白添加量的增加，MP展開，蛋白的表面疏水性增強(qiáng)，醛類物質(zhì)與暴露出來的疏水位點(diǎn)以及巰基相結(jié)合，此時(shí)釋放出的己醛、壬醛的含量顯著降低。而隨著添加量的進(jìn)一步增大，MP對(duì)己醛、壬醛的結(jié)合能力下降，這可歸結(jié)于蛋白分子由于相分離而發(fā)生自聚集，疏水基團(tuán)重新嵌入蛋白中，從而導(dǎo)致MP表面疏水性下降所致。圖3、5顯示：外源蛋白添加量過高時(shí)，蛋白質(zhì)的聚集程度增大，但粒徑反而減小，在Sow等[31]的研究中，這是由于相分離導(dǎo)致的自聚集造成的，此時(shí)疏水基團(tuán)被重新包埋，不利于MP與風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合。此外，由于相分離的發(fā)生，外源蛋白會(huì)作為惰性填料填充在MP蛋白之間，這可能會(huì)阻礙蛋白質(zhì)間的靜電相互作用，從而減小揮發(fā)性物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的離子相互作用，使通過靜電相互作用結(jié)合的揮發(fā)性物質(zhì)重新釋放出來[27,34]，而圖4中Zeta電位的下降也證實(shí)了這一結(jié)論。

另外，在同樣的處理?xiàng)l件下，MP對(duì)壬醛的吸收效果明顯高于己醛，這與Xue Chao等[17]的研究一致。研究表明，較大風(fēng)味分子的結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的構(gòu)象阻礙效應(yīng)，可以阻止庚醛和辛醛靠近蛋白的疏水結(jié)合位點(diǎn)，降低蛋白與兩者的親和力[35]。與此類似，MP對(duì)己醛的結(jié)合量較之壬醛更低，可能歸因于壬醛化學(xué)結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的構(gòu)象阻礙效應(yīng)。另外，有研究表明MP對(duì)碳鏈更長(zhǎng)的醛類有更好的結(jié)合效果，其結(jié)合能力的增強(qiáng)是由于長(zhǎng)鏈醛類與蛋白質(zhì)產(chǎn)生的疏水相互作用更強(qiáng)[14]。

如圖7C所示，MP對(duì)醇類物質(zhì)的結(jié)合能力通常與氫鍵以及弱疏水相互作用相關(guān)，EWP、WPI添加量增加，MP溶液中游離1-辛烯-3-醇的含量隨之降低，表明MP結(jié)合1-辛烯-3-醇的能力增強(qiáng)，而這與圖1中MP表面疏水性的變化并不一致，表明疏水相互作用并不是促使EWP、WPI改變MP結(jié)合1-辛烯-3-醇的能力的原因。圖5、6結(jié)果表明，添加2% EWP和4% WPI時(shí)，MP的展開程度最大，有研究表明蛋白展開可導(dǎo)致蛋白內(nèi)部的氫鍵遭到破壞，增加了氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，從而使醇類物質(zhì)的羥基通過氫鍵與MP結(jié)合，增強(qiáng)了兩者之間的親和力[30]；而當(dāng)EWP、WPI的添加量繼續(xù)增加，游離1-辛烯-3-醇含量進(jìn)一步降低，表明MP結(jié)合1-辛烯-3-醇的能力進(jìn)一步增強(qiáng)，這可能是由于蛋白自聚集，增加了表面的親水基團(tuán)，通過氫鍵與1-辛烯-3-醇相結(jié)合。而添加6% SPI后，游離的1-辛烯-3-醇含量反而增加，這可能是由于SPI中本身具有一定量的1-辛烯-3-醇所致[9]。

圖7 外源蛋白對(duì)MP結(jié)合特征腥味物質(zhì)能力的影響Fig.7 Effects of external proteins on the binding capacity of MP to fishy-odor compounds

此外，添加不同外源蛋白的MP溶液結(jié)合能力也存在差異，添加WPI的樣品中游離的己醛、壬醛和1-辛烯-3-醇3 種腥味物質(zhì)含量顯著低于SPI組以及EWP組，表明添加WPI的MP溶液對(duì)3 種腥味物質(zhì)均具有最強(qiáng)的結(jié)合能力。這可能是由于3 種外源蛋白不同的空間排列結(jié)構(gòu)所造成的[11]。SPI主要由7S（β-伴大豆球蛋白）和11S（大豆球蛋白）構(gòu)成，其中11S是由6 個(gè)亞基通過6 個(gè)二硫鍵以及少量的非共價(jià)相互作用構(gòu)成[36]。而WPI中主要的蛋白為β-乳球蛋白，其桶狀結(jié)構(gòu)由2 個(gè)二硫鍵連接而成，并含有一個(gè)游離巰基[37]。相較于WPI，SPI含有更多的二硫鍵，蛋白亞基之間的聯(lián)系更加緊密，產(chǎn)生的空間位阻會(huì)減少風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)入疏水核心的可能性，而WPI二硫鍵較少可減少風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)入蛋白疏水區(qū)域的阻礙，同時(shí)WPI中含有的游離巰基，也能夠增強(qiáng)其對(duì)醛酮類物質(zhì)的吸收[11]。而蛋清蛋白中卵白蛋白占其含量的一半以上，含有386 個(gè)氨基酸殘基，并且多為疏水性氨基酸，但這些氨基酸均分布于卵白蛋白內(nèi)部，其疏水區(qū)域并不能與風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合[11,28]。

3 結(jié)論

外源蛋白可通過改變MP三級(jí)結(jié)構(gòu)影響MP的結(jié)合能力。添加適量外源蛋白能促進(jìn)蛋白展開，增強(qiáng)MP表面疏水性，形成更大的聚集體，溶液濁度也隨之增加，此時(shí)MP具有較強(qiáng)的己醛、壬醛結(jié)合能力；添加量過高，MP疏水基團(tuán)被重新包埋，結(jié)合己醛、壬醛的能力隨之下降。同時(shí)，EWP、WPI添加量的增大可增強(qiáng)MP結(jié)合1-辛烯-3-醇的能力，這可歸結(jié)于蛋白氫鍵結(jié)合位點(diǎn)的增加；而隨SPI添加量的增加，MP對(duì)1-辛烯-3-醇的結(jié)合能力先上升后下降。此外，添加WPI的樣品對(duì)3 種腥味物質(zhì)的結(jié)合能力強(qiáng)于添加SPI、EWP的樣品。但對(duì)于這3 種外源蛋白在魚糜制品中是否能起到同樣的作用，仍需進(jìn)一步研究。