陳瑩琪，陳 杰，周耀進(jìn)，李子健，唐世超，趙玉川，羅惠波，黃 丹,

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；2.宜賓六尺巷酒業(yè)有限公司，四川 宜賓 644100）

濃香型大曲在發(fā)酵過程中微生物、微生物和代謝產(chǎn)物之間呈一種動(dòng)態(tài)、有規(guī)律的演變過程[1]，并通過微生物代謝產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)[2-3]，研究表明吡嗪類物質(zhì)是促進(jìn)白酒特定風(fēng)味形成的決定性風(fēng)味物質(zhì)之一[4-5]。其中2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪有助于濃香型白酒的呈香[6-7]，并具有擴(kuò)張血管、改善血循環(huán)、護(hù)肝等功能[8]。雖然已從大曲中鑒定出多種吡嗪類化合物[9-10]，但關(guān)于吡嗪類物質(zhì)與濃香型大曲發(fā)酵過程中微生物群落的相關(guān)性仍不清楚，對(duì)大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)的合成機(jī)制尚不完全清楚?，F(xiàn)有研究表明，大曲發(fā)酵過程中2,3,5,6-四甲基吡嗪[11-12]、2,5-二甲基吡嗪[13]、2-乙基-3,5/3,6-二甲基吡嗪14]的代謝產(chǎn)生由微生物完成。Jin Yao等[15]采用Illumina MiSeq和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)研究了醬香型大曲中微生物群落和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)特征，發(fā)現(xiàn)醬香型大曲中的桿菌綱、放線菌綱等與吡嗪類物質(zhì)密切相關(guān)，曲霉菌與吡嗪類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。Ren Qing等[16]研究了中國(guó)米酒中微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性，表明吡嗪類化合物與曲霉菌、枝孢霉屬、乳球菌屬、畢赤酵母屬等微生物之間總共建立了88 種相關(guān)性。但是目前極少有研究解析這些吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物與制曲過程中其他微生物的相關(guān)性。因此，解析大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物，以及吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物與大曲發(fā)酵過程中其他微生物的相互作用模式，對(duì)于揭示大曲發(fā)酵過程中微生物合成吡嗪類物質(zhì)的機(jī)制、調(diào)控大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)合成具有重要意義。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)全面系統(tǒng)地解析濃香型大曲發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，并通過HS-SPMEGC-MS測(cè)定大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)的種類、含量，解析制曲過程中吡嗪類物質(zhì)合成的階段性特征，以及吡嗪類物質(zhì)與大曲微生物的相關(guān)性，揭示吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物與大曲發(fā)酵過程中其他微生物的共生網(wǎng)絡(luò)，旨在為解析大曲發(fā)酵過程中的吡嗪類物質(zhì)的合成機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲取自宜賓某濃香型白酒廠。

E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 美國(guó)Omega BioTek公司；2-辛醇（內(nèi)標(biāo)，色譜純） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano Drop 2000紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭（2 cm，50/30 μm） 美國(guó)Supelco公司；7890 BGC-5977 AMS GC-MS聯(lián)用儀、Db-5 ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

對(duì)發(fā)酵過程中1、3、5、7、9、11、13、15、18、22 d和28 d的大曲樣品進(jìn)行收集，每次從曲房的上層、中層、下層3 個(gè)不同的位點(diǎn)取3 個(gè)平行樣品，總計(jì)33 個(gè)樣品。取樣后，將大曲粉碎均勻，每份取約200 g密封在無菌袋中，-80 ℃保藏。

1.3.2 吡嗪類物質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 萃取頭的預(yù)處理

將新購(gòu)置的萃取頭在GC儀進(jìn)樣口250 ℃老化1 h。

1.3.2.2 樣品HS-SPME

準(zhǔn)確稱取1 g大曲樣，加入到20 mL的頂空瓶中，再加入2 g NaCl和50 μL內(nèi)標(biāo)（10 mg/L 2-辛醇溶液），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在50 ℃預(yù)熱10 min，然后磁力攪拌萃取吸附30 min，用于GC-MS分析。

1.3.2.3 GC-MS分析

將萃取頭從頂空瓶中取出，迅速插入GC儀進(jìn)樣口在250 ℃解吸5 min，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析[17]。

GC條件：Db-5 ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），不分流，體積流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min。后運(yùn)行溫度240 ℃，后運(yùn)行時(shí)間5 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；連接桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35～450；ACQ方式Scan。

1.3.3 DNA提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增基因組學(xué)高通量測(cè)序

稱取2 g大曲樣品，使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒從提取大曲中微生物DNA。使用引物338f/806r（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGAG-3’/5’-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3’）和ITS1f/2043R（5’-CTTGGTCATTAGGAAGA-3’/5’-GCTGCGTTCTTCATC GATGC-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)和真菌rRNA基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔（ITS1）區(qū)域[18-19]。

1.4 原始序列數(shù)據(jù)處理

使用基礎(chǔ)分析軟件Qiime 1.9.1版本處理原始數(shù)據(jù)，主要是進(jìn)行序列拼接，序列歸類，去除序列中接頭、標(biāo)簽及引物序列，去除低質(zhì)量序列[20]。然后用Uchime軟件去除嵌合體序列[21]。使用Uparse分析軟件進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚合[22]。使用RDP Classifier 2.11進(jìn)行序列分類注釋。Usearch 7.0進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)。Mothur 1.30.2進(jìn)行α多樣性分析。使用Qiime 1.9.1可以生成各分類學(xué)水平豐度表和β多樣性距離計(jì)算。在P＜0.05時(shí)接受統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。使用R語言stats包3.5.0在微生物屬和吡嗪類物質(zhì)中計(jì)算出Spearman相關(guān)系數(shù)（r＞0.6）以檢測(cè)微生物群與吡嗪類物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，使用Cytoscape 3.4.0可視化相關(guān)矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)的變化

在大曲發(fā)酵過程中，通過HS-SPME-GC-MS共檢測(cè)到9 種吡嗪類物質(zhì)，含量如圖1a所示。在檢測(cè)到的9 種吡嗪類物質(zhì)中，具有主要貢獻(xiàn)作用的是2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪，這與韓素娜等[23]的研究類似。在大曲發(fā)酵1～5 d時(shí)，吡嗪類物質(zhì)總含量極低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，吡嗪類物質(zhì)總含量存在2 個(gè)快速增長(zhǎng)階段：7～9、18～22 d，分別增加到3.8、2.1 倍。其中2,3,5,6-四甲基吡嗪在發(fā)酵7～9 d增加到3.6 倍，2,3,5-三甲基吡嗪在發(fā)酵7～9 d增加到3.7 倍。在18 d，吡嗪類物質(zhì)含量大幅降低，這可能是因?yàn)樵?5～18 d時(shí)大曲發(fā)酵溫度相對(duì)較高，吡嗪類物質(zhì)具有揮發(fā)性而造成了散逸；再有就是微生物將其作為底物而被轉(zhuǎn)化[6,24]。與大曲發(fā)酵前相比，大曲發(fā)酵結(jié)束后2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等吡嗪類物質(zhì)含量均明顯增加。

圖1 大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)含量變化（a）和Heatmap圖（b）Fig.1 Changes in contents of pyrazine metabolites during fermentation of Daqu (a),and their heatmap (b)

風(fēng)味Heatmap圖可以直觀地反映大曲發(fā)酵過程中9 種吡嗪類物質(zhì)的變化和差異（圖1b）。對(duì)大曲發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)可以分為兩個(gè)階段：1～5、7～28 d。其中，在1～5 d階段，3～5 d的吡嗪類物質(zhì)可以聚為一個(gè)小類；在7～28 d階段，7～9、13～15、22～28 d的吡嗪類物質(zhì)可以分別聚為一個(gè)小類，并且7～15 d和18～28 d又可以單獨(dú)聚為一類。說明在7～28 d階段，吡嗪類物質(zhì)組成和含量相對(duì)較為相似，與1～5 d階段相比有一定差異。這可能是因?yàn)樵谥魄^程中，發(fā)酵不同階段大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)不同，大曲微生物所處的發(fā)酵溫度有差異[6,25]，從而影響了吡嗪類物質(zhì)的合成和積累，因此產(chǎn)生的吡嗪類物質(zhì)的含量與數(shù)量較1～5 d階段多。

2.2 濃香型大曲發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物的群落演替

大曲發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)豐度＞1%）的變化情況如圖2a所示。大曲發(fā)酵過程中各階段的優(yōu)勢(shì)真菌差異較大。在大曲發(fā)酵1～5 d時(shí)，優(yōu)勢(shì)真菌群落主要是奧默柯達(dá)屬（Kodamaea）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、念珠菌屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）等，相對(duì)豐度分別為76.04%～31.20%、41.84%～9.83%、34.34%～4.03%、7.64%～1.77%。此外，雙足囊菌屬（Dipodascus）、地絲菌屬（Geotrichum）等也占據(jù)一定比例，這些微生物也是大曲發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)微生物。隨著發(fā)酵進(jìn)程的推移，以嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）為代表的嗜熱真菌屬逐漸占據(jù)微生物群落豐度的優(yōu)勢(shì)地位。大曲發(fā)酵7～13 d，嗜熱子囊菌屬、伊薩酵母屬、假絲酵母屬（Candida）等為優(yōu)勢(shì)真菌屬，嗜熱子囊菌屬占優(yōu)勢(shì)地位，在發(fā)酵中期11 d，嗜熱子囊菌屬在群落中的占比高達(dá)98.25%；在發(fā)酵的后期15～28 d，嗜熱子囊菌屬、嗜熱絲孢菌屬占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，可以占群落相對(duì)豐度的99%以上。

大曲發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（平均相對(duì)豐度＞1%）的變化情況如圖2b所示。在大曲發(fā)酵的整個(gè)階段芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）相對(duì)豐度均占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。在1～5 d階段，芽孢桿菌屬在細(xì)菌中的占比逐漸升高，相對(duì)豐度從30.96%升為49.25%；而魏斯氏菌屬在細(xì)菌中的占比逐漸降低，相對(duì)豐度從43.11%降至15.51%。大曲發(fā)酵5 d后，芽孢桿菌屬的豐度呈波動(dòng)上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，且在細(xì)菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而魏斯氏菌屬則呈波動(dòng)下降后穩(wěn)定的趨勢(shì)。在大曲發(fā)酵前期，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、小球菌屬（Pediococcus）也屬于優(yōu)勢(shì)物種，乳酸桿菌屬相對(duì)豐度為13.02%～6.16%，假單胞菌屬為15.54%～2.84%、小球菌屬為7.78%～1.45%。此外，在大曲發(fā)酵前期葡萄球菌屬（Staphylococcus）、泛生菌屬（Pantoea）、考薩考氏菌屬（Kosakonia）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）等也占有一定比例，均為大曲發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。與真菌不同的是，細(xì)菌發(fā)酵中后期存在多種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，如高溫放線菌屬則在大曲發(fā)酵后期占優(yōu)勢(shì)；在大曲發(fā)酵5 d后含量逐漸上升，后期呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，在9 d達(dá)到最高20.78%，之后階段在17.86%～9.96%之間波動(dòng)，此外糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）也占據(jù)一定的比例，這些微生物為大曲發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

圖2 大曲發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)真菌（a）和細(xì)菌（b）在屬水平的相對(duì)豐度圖Fig.2 Relative abundance of dominant fungi (a) and bacteria (b) at the genus level during Daqu fermentation

2.3 濃香型大曲發(fā)酵過程中微生物群落的組成比較

為了解大曲發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，基于ANOSIM指數(shù)對(duì)大曲發(fā)酵過程中的各個(gè)階段進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）[26]，比較大曲不同發(fā)酵階段微生物群落結(jié)構(gòu)的差異和距離。如圖3所示，PCA表明，制曲過程微生物群落演替可分為兩個(gè)階段：第1階段為大曲發(fā)酵的1～5 d（A階段）、第2階段為大曲發(fā)酵的7～28 d（B階段），將大曲發(fā)酵過程分為兩個(gè)階段對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)和它們與吡嗪類物質(zhì)相關(guān)性進(jìn)行研究。

真菌群落在A階段和B階段距離較遠(yuǎn)（圖3a），說明在發(fā)酵A階段和發(fā)酵B階段的真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，這與大曲微生物群落組成和吡嗪類物質(zhì)分析一致；B階段中的點(diǎn)比A階段分布更廣，表明真菌群落在發(fā)酵B階段變化可能高于發(fā)酵A階段。與真菌群落不同的是，細(xì)菌群落在A階段和B階段出現(xiàn)了大部分的重疊（圖3b），說明它們之間的差異并不明顯。

圖3 大曲發(fā)酵過程真菌（a）和細(xì)菌（b）的PCAFig.3 PCA plots of fungal (a) and bacterial community compositions (b)during Daqu fermentation

為進(jìn)一步了解大曲發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)，通過線性判別分析Effect Size（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）比較每個(gè)階段主要差異微生物，以識(shí)別出差異豐富的特征，這些特征也與生物學(xué)上有類別一致的意義[27]。LEfSe多重分析表明（圖4），有顯著差異的真菌屬共有38 種（線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞2，P＜0.05）（圖4a），包括A階段奧默柯達(dá)屬（Kodamaea）、念珠菌屬（Candida）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）等33 個(gè)真菌屬；B階段由嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）、鏈格孢屬（Alternaria）等5 個(gè)真菌類群表現(xiàn)出明顯的屬間差異。

與真菌不同的是，細(xì)菌有顯著差異的屬共有36 種（LDA＞2，P＜0.05）（圖4b），且差異細(xì)菌屬大多在B階段。在A階段的差異細(xì)菌屬共12 種，包括考薩考氏菌屬（Kosakonia）、泛菌屬（Pantoea）、嗜甲基菌屬（Methylophilus）等；在B階段，共有24 種差異細(xì)菌屬，包括高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）等。

圖4 大曲發(fā)酵過程真菌（a）和細(xì)菌（b）屬的LEfeSeFig.4 LEfeSe analysis of fungal (a) and bacterial (b) genera during Daqu fermentation

2.4 濃香型大曲發(fā)酵過程微生物群落與吡嗪類物質(zhì)的相關(guān)性分析

2.4.1 差異微生物與吡嗪類物質(zhì)的相關(guān)性Heatmap和共生網(wǎng)絡(luò)圖分析

選取大曲發(fā)酵過程中差異微生物（屬）與吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，將相關(guān)性系數(shù)作Heatmap圖。由圖5a可知，2-乙烯基-6-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪與多種差異真菌（屬）都呈正相關(guān)；而2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪則與多種差異真菌（屬）呈負(fù)相關(guān)。與吡嗪類物質(zhì)具有相關(guān)性的38 種差異真菌（屬）中（Spearman相關(guān)系數(shù)|ρ|＞0.6），僅13 種真菌表現(xiàn)出與吡嗪類物質(zhì)具有顯著相關(guān)性（P＜0.005），如圖5c所示，2-乙烯基-6-甲基吡嗪與刺孢殼屬（Chaetomella）呈非常顯著正相關(guān)，2,5-二甲基吡嗪僅與刺孢殼屬呈正相關(guān)；2,6-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪則僅與枝孢霉屬（Cladosporium）呈正相關(guān)；2,3-二甲基吡嗪則與多數(shù)真菌（枝孢霉屬、橫梗霉屬（Lichtheimia）、小尖霉屬（Microtrichum）等）呈顯著正相關(guān)；2-乙基-6-甲基吡嗪與刺孢殼屬、橫梗霉屬等呈顯著正相關(guān)。然而，2-乙基-6-甲基吡嗪與嗜熱絲孢菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪與刺孢殼屬、鐮刀菌屬（Fusarium）呈顯著負(fù)相關(guān)。

由圖5b可知，2-乙烯基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等與多數(shù)的差異細(xì)菌（屬）呈負(fù)相關(guān)，2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪則表現(xiàn)出和大部分差異細(xì)菌（屬）呈正相關(guān)。共36 種細(xì)菌（屬）表現(xiàn)出與吡嗪類物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性（|ρ|＞0.6），但僅有8 種細(xì)菌與吡嗪類物質(zhì)具有顯著相關(guān)性（P＜0.005），如圖5d所示，2,3,5-三甲基吡嗪與球形芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、涅瓦菌屬（Nevskia）、未分類腸桿菌屬（unclassified_o_Enterobacterales）顯著正相關(guān)，2-乙烯基-6-甲基吡嗪與Pelomonas呈非常顯著正相關(guān)，2-甲基吡嗪與unclassified_f__Candidatus_Hepatincola呈正相關(guān)。除此之外，2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪與泛菌屬具有顯著負(fù)相關(guān)，2-乙基-6-甲基吡嗪與諾卡菌屬、未分類乳桿菌屬（unclassified_o_Lactobacillales）呈顯著負(fù)相關(guān)，與泛菌屬則表現(xiàn)出正相關(guān)。同時(shí)，2,6-二甲基吡嗪與諾卡菌屬（Nocardia）、未分類乳桿菌屬呈負(fù)相關(guān)。

圖5 大曲差異真菌屬（a、c）、細(xì)菌（b、d）屬與吡嗪類物質(zhì)的Spearman相關(guān)性Heatmap及可視化相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Spearman correlation heatmaps of differential fungal genera (a) and bacterial genera (b) versus pyrazine metabolites,and visual correlation network diagrams of differential fungal genera (c) and bacterial genera (d)versus pyrazine metabolites

2.4.2 濃香型大曲發(fā)酵過程微生物與吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape軟件基于Spearman系數(shù)構(gòu)建濃香型大曲發(fā)酵過程微生物與吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（|ρ|＞0.6，P＜0.005）。可以發(fā)現(xiàn)大曲發(fā)酵過程中微生物群落成員與吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物之間的互利或競(jìng)爭(zhēng)的相互作用模式，處于互利共生關(guān)系的微生物呈正相關(guān)[28]，而處于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的微生物呈負(fù)相關(guān)[29]從而推斷不同微生物群之間可能存在“合作”或“競(jìng)爭(zhēng)”關(guān)系[30]。結(jié)果顯示，真菌屬相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)（圖6a）由88 個(gè)節(jié)點(diǎn)、443 條邊連接而成。節(jié)點(diǎn)間以正相關(guān)（89.84%）為主，只有少數(shù)是負(fù)相關(guān)（10.16%），枝孢霉屬與13.93%的真菌屬具有相關(guān)性，其中與大多數(shù)真菌屬呈正相關(guān)，而僅與嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和未分類散囊菌目（unclassified_o_Eurotiales）兩種真菌屬呈負(fù)相關(guān)；除此之外，刺孢殼屬（Chaetomella）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、鐮刀菌屬（Fusarium）、畢赤醇母屬（Pichia）分別與6.29%、8.31%、6.74%、5.62%的真菌屬具有相關(guān)性，且與其中大多數(shù)的真菌呈正相關(guān)，與極少數(shù)的真菌呈負(fù)相關(guān)。相反的是，嗜熱真菌屬（Thermomyces）與7.86%的真菌屬具有相關(guān)性，但卻與大多數(shù)的真菌屬呈負(fù)相關(guān)，表明嗜熱真菌屬與大多數(shù)屬之間存在共排斥關(guān)系。值得注意的是，小尖霉屬（Wallemia）僅與Wickerhamomyces這一種真菌屬具有相關(guān)性，呈正相關(guān)。

細(xì)菌屬相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)（圖6b）由88 個(gè)節(jié)點(diǎn)、161 條邊連接而成。節(jié)點(diǎn)間以正相關(guān)達(dá)67.70%。泛菌屬（Pantoea）與20.49%的細(xì)菌屬具有相關(guān)性，其中與大多數(shù)細(xì)菌屬呈負(fù)相關(guān)，而僅與魏斯氏菌屬（Weissella）、鏈球菌屬（Streptococcus）呈正相關(guān)；與之相反的是，諾卡菌屬（Nocardia）、unclassified_f__Candidatus_Hepatincola、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）分別與19.87%、11.80%、10.56%的細(xì)菌屬具有相關(guān)性，且與其中大多數(shù)的細(xì)菌呈正相關(guān)，與極少數(shù)細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。涅瓦河菌屬（Nevskia）、Pelomonas分別與8.07%、4.35%的細(xì)菌屬具有相關(guān)性，且表現(xiàn)為共合作關(guān)系。

圖6 大曲真菌屬（a）、細(xì)菌（b）屬與吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Correlation network maps of fungal (a) and bacterial genera (b)versus microorganisms related to pyrazine synthesis in Nongxiangxing Daqu

3 結(jié)論

利用HS-SPME-GC-MS測(cè)定濃香型大曲中吡嗪類物質(zhì)的含量，總共檢測(cè)到9 種吡嗪類物質(zhì)，對(duì)吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在制曲過程中吡嗪類物質(zhì)的積累存在階段性特征，即在1～5 d和7～28 d階段吡嗪類物質(zhì)的數(shù)量和種類存在顯著差異，這可能和制曲過程不同階段微生物菌群演替有關(guān)。利用高通量測(cè)序鑒定大曲發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)真菌群落主要由奧默柯達(dá)屬、伊薩酵母屬、假絲酵母屬、曲霉屬等組成；優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落主要由芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬等組成。通過PCA將大曲發(fā)酵過程分為A（1～5 d）、B（7～28 d）兩個(gè)階段；通過LEfSe分析篩選出兩個(gè)發(fā)酵階段的差異微生物，在A階段主要的差異真菌為奧默柯達(dá)屬、念珠菌屬等，B階段主要的差異真菌為嗜熱子囊菌屬、嗜熱絲孢菌屬；在A階段主要的差異細(xì)菌為考薩考氏菌屬、泛菌屬、嗜甲基菌屬；B階段主要的差異細(xì)菌為高溫放線菌屬、糖多孢菌屬、不動(dòng)桿菌等。利用差異微生物（屬）與吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出了與吡嗪類物質(zhì)相關(guān)性系數(shù)|ρ|＞0.6、P＜0.05的屬，發(fā)現(xiàn)2,6-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪都與枝孢霉屬呈正相關(guān)，這與Ren Qing等[16]發(fā)現(xiàn)在中國(guó)米酒中吡嗪類物質(zhì)的合成與枝孢霉屬密切相關(guān)的結(jié)論一致。2,3-二甲基吡嗪與枝孢霉屬、橫梗霉屬、小尖霉屬、伊薩酵母屬等多種真菌屬呈顯著正相關(guān)；2,3,5-三甲基吡嗪與球形芽孢桿菌屬、涅瓦菌屬、未分類腸桿菌屬都具有顯著正相關(guān)，這其中球形芽孢桿菌屬、未分類腸桿菌屬、未分類乳桿菌屬屬于桿菌綱，諾卡菌屬屬于放線菌綱，這與Yao Jin等[15]發(fā)現(xiàn)桿菌綱、放線菌綱與吡嗪類物質(zhì)密切相關(guān)的結(jié)論一致。通過Spearman系數(shù)構(gòu)建這些吡嗪類物質(zhì)代謝相關(guān)微生物與制曲過程中其他微生物之間的網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)吡嗪代謝相關(guān)微生物與制曲過程中其他大曲微生物多呈正相關(guān)。僅嗜熱真菌屬等少數(shù)微生物表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。不過吡嗪類物質(zhì)相關(guān)微生物與大曲微生物組通過何種方式相互影響，有待后續(xù)研究闡明。本研究結(jié)果為找尋大曲發(fā)酵過程中的功能微生物，提升大曲發(fā)酵品質(zhì)提供理論支持。