張力,劉子修,廖太陽(yáng),吳鵬,李曉辰,梅偉,茆軍,王培民,張立

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是累及膝關(guān)節(jié)所有構(gòu)成組織的退行性破壞,以滑膜炎癥、軟骨降解、軟骨下骨的結(jié)構(gòu)破壞為主要病理特征,祖國(guó)醫(yī)學(xué)稱之為“骨痹”[1-2]。在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中,本課題組初步觀察到以“溫經(jīng)活血”立法研發(fā)的中藥復(fù)方膝痹寧(原名膝寧方,因申請(qǐng)專利更名膝痹寧,專利號(hào):CN201010514325)對(duì)KOA有良好治療效果,不僅能有效控制疼痛,也可緩解KOA關(guān)節(jié)僵硬、活動(dòng)欠利、上下樓困難的臨床癥狀[3-6],預(yù)示著膝痹寧可能對(duì)KOA存在軟骨保護(hù)效應(yīng),但膝痹寧發(fā)揮療效的藥物活性成分及效應(yīng)機(jī)制仍有待闡明。

代謝紊亂作為KOA高危風(fēng)險(xiǎn)因素之一,對(duì)KOA的發(fā)生發(fā)展具有多方面的影響,不僅體現(xiàn)在糖脂代謝異常誘發(fā)膝關(guān)節(jié)局部的慢性低度炎癥[7],也體現(xiàn)在軟骨組織自身的代謝平衡對(duì)KOA的病程進(jìn)展至關(guān)重要[8-9]。研究表明,以基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)3、MMP13為代表的膠原水解酶，負(fù)責(zé)軟骨膠原合成與降解,動(dòng)態(tài)維持軟骨膠原平衡,對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有破壞作用[9];另一方面,過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,PPARγ)、PPARγ共激活因子(PPARγ coactivator-1α,PGC1α)調(diào)控能量代謝、脂肪酸代謝、脂質(zhì)代謝，對(duì)KOA具有軟骨保護(hù)效應(yīng)[10]。據(jù)此,闡明KOA中的代謝紊亂對(duì)病理機(jī)制的解析、藥效靶點(diǎn)的篩選,均具有重要意義。

超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap mass spectrometry,UPLC-Q-Orbitrap MS/MS) 融合了四級(jí)桿質(zhì)量分析器的母離子選擇性和軌道阱質(zhì)量分析器的精確質(zhì)量檢測(cè)功能,對(duì)于中藥復(fù)雜體系的快速分析和成分識(shí)別以及代謝組學(xué)的研究具有優(yōu)勢(shì)[11-12]。立足于此,本研究運(yùn)用該技術(shù),不僅對(duì)膝痹寧的活性成分展開(kāi)鑒定,還檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血清代謝物,通過(guò)差異代謝物的比較,篩選KOA的代謝標(biāo)志物和膝痹寧的作用靶點(diǎn),初步探討了膝痹寧對(duì)KOA模型大鼠軟骨保護(hù)效應(yīng)的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥治療KOA 的機(jī)制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取3月齡SPF級(jí)雌性SD大鼠18只,體質(zhì)量240～280 g(南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng))。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物房保持室溫(25±2) ℃,相對(duì)濕度(60±5)%,12 h光/暗方案。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ACU210101),在國(guó)家衛(wèi)生研究所關(guān)于保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)方針下進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

MMP3、MMP13、PPARγ、GAPDH抗體(貨號(hào):17873-1-AP、18165-1-AP、15540-1-AP、60004-1-Ig,美國(guó)Proteintech公司),PGC1α抗體(貨號(hào):AF5395,美國(guó)Affinity公司),RNA快速提取試劑盒(貨號(hào):RN001,上海奕杉生物科技有限公司),逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑(貨號(hào):R222-01、Q331-02,南京諾唯贊生物公司)。

BioPhotometer plus核酸蛋白檢測(cè)儀、逆轉(zhuǎn)錄PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司),7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司),UltiMate 3000超高效液相色譜串聯(lián)Thermo Q FOCUS Orbitrap質(zhì)譜儀,配備有加熱電噴霧離子源、高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣機(jī)、X Calibur 2.0軟件(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),KQ-300 GDV 溫控超聲儀(中國(guó)昆山超聲儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膝痹寧藥液的制備 依據(jù)膝痹寧臨床使用劑量[3](每日1帖):淡附片10 g，制狗脊10 g，紫河車10 g，山萸肉10 g，川桂枝10 g，巴戟天10 g，生薏仁15 g，制首烏15 g，川牛膝10 g，生甘草10 g，炒白芍10 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑部提供,加水400 mL后武火煎煮沸騰,以文火濃縮藥液至100 mL,則每1 mL相當(dāng)于含生藥1.2 g。

用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥液根據(jù)大鼠與成人每千克體質(zhì)量折算系數(shù)1∶6.25,旋蒸儀濃縮藥液,冰箱4 ℃ 保存?zhèn)溆?。用于活性成分鑒定的藥液則進(jìn)一步冷凍干燥制備凍干粉,稱取膝痹寧凍干粉0.2 g,錐形瓶中加入甲醇25 mL后稱定質(zhì)量,超聲(功率250 W,頻率50 kHz)處理30 min,再次稱定質(zhì)量并用甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量,隨后0.22 μm過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 活性成分鑒定的色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈;洗脫梯度:0～3 min,5%～35%B;3～6 min,35%～55%B;6～8 min,55%～75%B;8～11.5 min,75%～95%B;11.5～12 min,95%～5%B;流速0.5 mL·min-1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量3 μL。

質(zhì)譜采用加熱電噴霧離子源,正、負(fù)離子模式檢測(cè),鞘氣流速45 L·min-1,輔氣流速10 L·min-1,噴霧電壓分別為3.5、2.5 kV,毛細(xì)管溫度325 ℃。掃描模式為Full MS/dd-MS2,掃描范圍m/z81～1 000,碰撞能量20、40、60 eV。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模、干預(yù)及取材 由SPSS軟件生成隨機(jī)數(shù),隨機(jī)均分為空白組、KOA(模型)組、膝痹寧組,每組6只。

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,取KOA組、膝痹寧組共12只大鼠,3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,雙側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮,常規(guī)75%乙醇消毒。采用前交叉韌帶離斷術(shù)構(gòu)建KOA模型,縱向切口開(kāi)放膝關(guān)節(jié)腔,髕骨脫位后手術(shù)刀離斷前交叉韌帶,前抽屜試驗(yàn)檢驗(yàn)手術(shù)結(jié)果,逐層縫合。術(shù)后青霉素鈉連續(xù)注射3 d預(yù)防感染?？瞻捉M僅切開(kāi)皮膚而不開(kāi)放膝關(guān)節(jié)腔,形成假手術(shù)對(duì)照。

造模14 d后,膝痹寧組大鼠每日按照10 mL·kg-1劑量予膝痹寧藥液灌胃治療,空白組和KOA組予等量生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)8周。8周后麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈采血,4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min后,取上層血清,-80 ℃凍存?zhèn)溆?脫頸法處死大鼠，開(kāi)放膝關(guān)節(jié)腔,摘取軟骨組織,保存于4%多聚甲醛溶液或-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.4 血清樣本的處理及代謝組學(xué)檢測(cè)的色譜質(zhì)譜條件 從解凍離心后的大鼠血清樣本各取30 μL,轉(zhuǎn)移置放在冰上的EP管。隨后加入200 μL含2×10-6%氯丙苯氨酸的乙腈-甲醇混合溶液(1∶1,v/v)。渦旋震蕩10 s,超聲5 min,-20 ℃靜置30 min,隨后14 000 r·min-1離心10 min,取上清液100 μL加入檢測(cè)瓶中,待測(cè)。另從每個(gè)待測(cè)樣本各取20 μL混合成QC樣本,用于質(zhì)控。

代謝組學(xué)檢測(cè)中,色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液;洗脫梯度:0～1 min,2%B;1～8 min,2%～50%B;8～11 min,50%～98%B;11～12 min,98%B;12～15 min,98%～2%B;流速0.25 L·min-1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件同活性成分鑒定部分。

1.3.5 番紅O-固綠染色 常規(guī)石蠟包埋、切片、梯度脫水,根據(jù)番紅O-固綠軟骨染色試劑盒染色說(shuō)明書,染色后觀察攝片。

1.3.6 qPCR檢測(cè)軟骨組織MMP3、MMP13、PPARγ和PGC1α mRNA表達(dá)水平 RNA提取試劑盒在無(wú)RNA酶環(huán)境下提取組織總RNA,分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄體系?；靹螂x心后PCR儀擴(kuò)增。檢索GenBank中相應(yīng)的基因序列,采用Oligo v6.6軟件設(shè)計(jì)引物,上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司幫助合成。目的基因序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因序列Table 1 Target gene sequence

1.3.7 Western blot法檢測(cè)軟骨組織MMP3、MMP13、PPARγ和PGC1α的蛋白表達(dá)水平 組織稱質(zhì)量后勻漿,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,蛋白煮沸變性后加樣電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉,1∶1 000加入一抗,4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗膜后,1∶10 000加入二抗室溫孵育,顯色液曝光。結(jié)果根據(jù)GAPDH內(nèi)參半定量計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 膝痹寧的活性成分鑒定

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS對(duì)膝痹寧的活性成分進(jìn)行鑒定,采集正、負(fù)離子模式下的總離子流圖(圖1)。通過(guò)分析離子峰、碎片離子信息,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[13-17],共鑒別出56個(gè)活性成分,其中有機(jī)酸11種、生物堿9種、糖類6種、中長(zhǎng)鏈脂肪酸7種、芳香族化合物5種,包括蒽醌、黃酮、維生素類的其他活性成分18種。詳見(jiàn)表2。

圖1 膝痹寧藥液的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of Xibining

表2 膝痹寧的活性成分Table 2 The active ingredient of Xibining

(續(xù)表)

2.2 膝痹寧對(duì)KOA模型大鼠的軟骨保護(hù)作用

觀察HE切片發(fā)現(xiàn),空白組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)正常,表面完整,軟骨細(xì)胞從淺層至深層數(shù)量增多;KOA模型大鼠軟骨組織表面區(qū)域部分缺損,淺層軟骨細(xì)胞丟失,纖維化明顯;膝痹寧組軟骨組織表面也存在部分區(qū)域缺損,但淺表區(qū)域軟骨細(xì)胞尚有保存,纖維化程度較KOA組明顯降低(圖2)。番紅O-固綠染色結(jié)果顯示,KOA組軟骨面缺損明顯,鈣化明顯,膝痹寧組也存在軟骨缺損和鈣化,但程度明顯較KOA組減輕(圖2)。

軟骨組織中MMP3、MMP13的mRNA和蛋白表達(dá)水平在KOA組均較空白組升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而膝痹寧組則較KOA組降低(P<0.05，P<0.01),見(jiàn)圖3。此外,KOA大鼠軟骨組織中PPARγ、PGC1α的mRNA和蛋白表達(dá)均低于空白組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),膝痹寧能升高PPARγ、PGC1α的表達(dá)水平(P<0.05，P<0.01),見(jiàn)圖4。說(shuō)明膝痹寧對(duì)KOA大鼠的軟骨代謝存在干預(yù)作用。

圖2 各組大鼠軟骨組織代表性HE染色、番紅O-固綠染色Fig.2 The representative HE and Safranin O-Fast Green staining on cartilage tissue of each group

注:A. MMP3、MMP13的相對(duì)mRNA表達(dá);B. MMP3、MMP13的代表性蛋白條帶;C. MMP3、MMP13的相對(duì)蛋白表達(dá);與空白組比較,**P<0.01;與KOA組比較,圖3 各組大鼠軟骨組織MMP3、MMP13 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Fig.3 The relative expression levels of MMP3 and MMP13 in cartilage of rats in each group

注:A. PPARγ、PGC1α的相對(duì)mRNA表達(dá);B. PPARγ、PGC1α的代表性蛋白條帶;C. PPARγ、PGC1α的相對(duì)蛋白表達(dá);與空白組比較,**P<0.01;與KOA組比較,圖4 各組大鼠軟骨組織PPARγ、PGC1α mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Fig.4 The relative expression levels of PPARγ and PGC1α in cartilage of rats in each group

2.3 膝痹寧對(duì)KOA模型大鼠的血清代謝組學(xué)影響

代表性大鼠血清色譜圖如圖5所示。將MS-DIAL 處理后得到的代謝物數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Metaboanalyst進(jìn)行主成分分析(PCA),結(jié)果見(jiàn)圖6。

空白組和KOA組能明顯區(qū)分,提示KOA模型大鼠的血清與空白大鼠代謝表型有一定區(qū)分。OPLS-DA得分圖顯示空白組和KOA組可以明顯區(qū)分,Permutation test置換檢驗(yàn)顯示模型準(zhǔn)確性較好(圖7)。

進(jìn)一步根據(jù)Fold Change>1.2、P<0.05篩選空白組和KOA組的差異代謝物,篩選后得到顯著差異的代謝物23個(gè)。其中,KOA組較空白組明顯下調(diào)的代謝物15個(gè),包括左旋肉堿、甘油醛、谷氨酸、氨基頡草酸、脯氨酸、甘油酸、亮氨酸、異亮氨酸、鳥(niǎo)嘌呤、蛋氨酸、乙酰膽堿、天冬酰胺、酪氨酸、鳥(niǎo)氨酸、蘇氨酸;上調(diào)的代謝物有8個(gè),包括延胡索酸、半乳糖、色氨酸、丙氨酸、甲基煙酰氨、甘氨酸、纈氨酸、硬脂酸。將膝痹寧組按同樣的條件納入分析,并對(duì)比KOA組較空白組出現(xiàn)的差異代謝物進(jìn)行篩選,膝痹寧通過(guò)上調(diào)左旋肉堿、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等8種代謝物,下調(diào)半乳糖、纈氨酸、色氨酸、甲基煙酰胺、硬脂酸,發(fā)揮藥效作用(表3)。

圖5 代表性大鼠血清色譜圖Fig.5 The representative chromatogram of rat serum

此外,將膝痹寧干預(yù)的代謝物導(dǎo)入Metaboanalyst進(jìn)行富集分析和通路分析,代謝差異物主要富集于支鏈脂肪酸的氧化、脂肪酸代謝、長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化(圖8),涉及嘌呤代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、合成,氨酰-tRNA 生物合成,甘油磷脂、甘油酯代謝等代謝通路(表4、圖9)。

注:K.KOA組;N.空白組;XBN.膝痹寧組;QC.質(zhì)控樣本圖6 各組大鼠血清的PCA分析Fig.6 PCA analysis of serum in each group

注:K.KOA組;N.空白組圖7 OPLS-DA得分圖和Permutation test置換檢驗(yàn)Fig.7 OPLS-DA score map and Permutation test

表3 膝痹寧對(duì)大鼠血清代謝差異物的調(diào)節(jié)作用Table 3 Regulation of Xibining on serum metabolic differences in rats

圖8 代謝差異物的富集分析Fig.8 Enrichment analysis of metabolic difference

注:A.煙酸鹽和煙酰胺代謝;B.甘油酯代謝;C.乙醛酸和二羧酸的代謝;D.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、磷酸戊糖途徑;E.甘油磷脂代謝;F.氨酰-tRNA 生物合成;G.纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、合成;H.嘌呤代謝圖9 代謝通路分析Fig.9 Metabolic pathway analysis

表4 代謝通路分析Table 4 Metabolic pathway analysis

3 討論

膝痹寧方取淡附片、桂枝為君,益腎助陽(yáng),宣痹散寒;以紫河車、山萸肉、巴戟天、制狗脊、制首烏為臣,補(bǔ)益肝腎,祛風(fēng)除濕;生薏仁健脾益氣;牛膝補(bǔ)腎活血,通利關(guān)節(jié)；佐以甘草緩急止痛,調(diào)和諸藥,共奏補(bǔ)肝腎益氣血,祛寒濕通經(jīng)絡(luò)之功。本研究中,我們采用UPLC-Q-Orbitrap-MS對(duì)膝痹寧的活性成分進(jìn)行鑒定,共鑒別出56個(gè)活性成分。膝痹寧中含有的烏頭酸、水楊酸、新烏寧堿、烏頭堿等成分可能與KOA疼痛的臨床控制有關(guān)[18];佛手柑內(nèi)酯、肉桂醛、異歐前胡素、香草酸、大黃素等物質(zhì)可能與膝痹寧緩解KOA滑膜炎癥的療效有關(guān)[19];而葫蘆巴堿則具有糾正代謝紊亂的藥效,提示膝痹寧對(duì)代謝因素的影響[20]。

隨后,我們探討了膝痹寧對(duì)大鼠的軟骨保護(hù)效應(yīng)及其對(duì)代謝核心靶點(diǎn)的干預(yù)作用。研究表明:膝痹寧干預(yù)后,KOA大鼠的軟骨缺損和鈣化程度減輕,MMP3、MMP13的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。此外,膝痹寧升高了KOA軟骨代謝信號(hào)PPARγ、PGC1α的mRNA和蛋白表達(dá),提示膝痹寧可能對(duì)KOA軟骨代謝紊亂存在干預(yù)作用。大鼠血清代謝組學(xué)研究表明:KOA組較空白組明顯下調(diào)的代謝物有15個(gè),上調(diào)的有8個(gè);膝痹寧可能通過(guò)上調(diào)左旋肉堿、脯氨酸、甘油酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等8種物質(zhì)和下調(diào)半乳糖、纈氨酸、硬脂酸等5種物質(zhì),發(fā)揮藥效作用。代謝差異物主要富集于支鏈脂肪酸的氧化、脂肪酸代謝、長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化,涉及嘌呤代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、合成,氨酰-tRNA 生物合成,甘油磷脂、甘油酯代謝等代謝通路。脯氨酸、羥脯氨酸、亮氨酸、半乳糖代謝對(duì)于Ⅱ型膠原的生物合成是至關(guān)重要的,參與膠原側(cè)鏈的組成[21-23],因此,膝痹寧對(duì)KOA軟骨中脯氨酸、亮氨酸及半乳糖代謝的調(diào)節(jié)作用,可能對(duì)其軟骨保護(hù)效應(yīng)的發(fā)揮至關(guān)重要。

本研究結(jié)果中膝痹寧對(duì)左旋肉堿的影響與Zhang等的研究相一致[24],我們通過(guò)對(duì)代謝差異物的篩選發(fā)現(xiàn)了肉堿在KOA大鼠模型中表達(dá)降低,而肉堿的補(bǔ)充治療,在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[25-27],均證實(shí)能夠有效地緩解KOA滑膜炎癥,保護(hù)軟骨降解破壞,盡管其中的作用機(jī)制仍是未知的。膝痹寧能提高大鼠體內(nèi)左旋肉堿的含量,增加的左旋肉堿可能作為脂肪酸β氧化的重要參與者，為KOA提供更多的能量,發(fā)揮軟骨保護(hù)效應(yīng)。

本研究也存在些許不足。首先,受限于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)模,本研究中用于代謝組學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物數(shù)量相對(duì)較少,進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量可望對(duì)KOA代謝差異物做出更全面的篩選;其次,本研究未涉及離體實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)相應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可望進(jìn)一步明確膝痹寧通過(guò)影響代謝因素體現(xiàn)KOA軟骨保護(hù)效應(yīng)的因果關(guān)系。此外, 新近的報(bào)道中,PPARγ對(duì)多個(gè)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶存在明確的調(diào)節(jié)作用,如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶、肉堿酰基轉(zhuǎn)移酶。膝痹寧是否對(duì)上述關(guān)鍵酶具有干預(yù)作用,以及是否通過(guò)干預(yù)酶活性影響脂質(zhì)代謝,均具有深入研究的價(jià)值。