李長印,陸明霞,廖健城,黃莉吉,居文政,鄒建東

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)院臨床藥理實驗室,江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇 南京 210029)

芪葵顆粒為江蘇省中醫(yī)院廣泛應用的治療早中期糖尿病腎病的院內(nèi)制劑,全方由黃芪、制首烏、黃蜀葵花3味中藥依據(jù)“益氣養(yǎng)陰、清利活血”的早中期2型糖尿病腎病治療原則組方而成。方中黃芪甘溫,補中益氣,升陽止渴,利水退腫;制首烏補血益精,滋補肝腎,且微溫而不燥熱,補虛而不滋膩,二藥配用,氣陰兼顧,益氣養(yǎng)陰,養(yǎng)血理血；配以黃蜀葵花,利水活血,通淋消腫,補瀉同施,標本兼顧。芪葵顆粒臨床療效確切[1-2],且與當前治療糖尿病腎病的臨床常用西藥相比,具有改善患者整體癥狀和長期服用安全有效等優(yōu)勢,因而具有巨大的開發(fā)應用潛力。目前,芪葵顆粒的相關(guān)研究多集中于臨床療效[1-2]及藥理機制[3-4]方面,缺乏對其化學成分系統(tǒng)全面的分析和鑒定。超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-QTOF-MS/MS)兼具UPLC的高效分離能力以及TOFMS的高靈敏度、高分辨率、高質(zhì)量精度和掃描范圍廣等特點,現(xiàn)已廣泛應用于中藥復雜化學成分的系統(tǒng)定性表征[5-6]。近年來,本課題組以此聯(lián)用分析技術(shù)為基礎,先后對芪葵顆粒組方的單味藥材黃芪[7-9]和黃蜀葵花[10]進行了較為系統(tǒng)的化學成分定性分析。在此基礎上,本研究首先采用UPLC-QTOF-MS/MS方法對芪葵顆粒復方進行分析檢測,進而借助PeakView軟件,綜合運用靶向和非靶向篩選策略,全面篩選并鑒定復方中含有的主要化學成分,以明確復方中化學成分的存在形式,為明確、優(yōu)化復方制劑質(zhì)量控制標準以及深入研究復方制劑的藥效物質(zhì)基礎提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗儀器

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司),配備有柱溫箱G1316C、自動進樣器G4226A,自動進樣器控溫模塊G1330B和二元泵G4220A;Triple TOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀,配備Analyst TF 1.6操作系統(tǒng)及PeakView 2.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國AB Sciex公司);CDS質(zhì)譜自動校準系統(tǒng);SorvallTMLegendTMMicro 17R微量離心機(Thermo Scientific公司);WH2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);CPA225D電子天平(德國Sartorius公司);Millipore Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(Milli-Q公司)。

1.2 試劑與藥物

甲醇、乙腈(HPLC級,德國Merck公司);甲酸、甲酸銨(質(zhì)譜級,瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司);TOF-MS正、負離子調(diào)諧液(美國AB Sciex公司,批號:4460131、4460134)。

芪葵顆粒由江蘇省中醫(yī)院制劑部制備,每袋10 g,批號:1607001;20個芪葵顆粒相關(guān)化學成分對照品的名稱、生產(chǎn)廠家和批號等信息詳見表1。

表1 芪葵顆粒20個主要化學成分對照品信息Table 1 General information of 20 authentic standards for major constituents in Qikui Granules

2 方法

2.1 樣品制備

精密稱取芪葵顆粒105.8 mg,加入超純水或純甲醇5 mL,超聲提取(50 kHz,300 W)20 min,渦旋30 s混勻后,立即精密吸取1 mL于1.5 mL離心管中,4 ℃ 12 000×g離心5 min,取上清液進行UPLC-QTOF-MS/MS分析。

精密稱取20個對照品適量,以甲醇稀釋至適當濃度,并等量混合制備混標溶液,取混標及單標溶液進行UPLC-QTOF-MS/MS分析,對定性鑒定結(jié)果進行比對確認。

2.2 色譜條件

采用Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)進行色譜分離。色譜柱:Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,2.7 m);柱溫:45 ℃;流速:0.4 mL·min-1;流動相:A相為0.1%甲酸的水溶液,質(zhì)譜負離子檢測模式下B相為含有10 mmol·L-1甲酸銨的乙腈/水(95∶5,v/v),質(zhì)譜正離子檢測模式下B相為含有10 mmol·L-1甲酸銨和0.125%甲酸的乙腈/水(95∶5,v/v);采用梯度洗脫分離:0～6 min,90%A;6～12 min:90%～80%A;12～18 min:80%～65%A;18～23 min:65%～50%A;23～28 min,50%～25%A;28～32 min:25%A;32～35 min:25%～90%A;35～45 min,90%A。進樣體積：正離子模式下為3 μL,負離子模式下為6 μL；自動進樣器溫度4 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件

采用AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀進行檢測。采用電噴霧離子源(ESI)在正、負2種離子模式下進行采集。TOFMS掃描模式參數(shù)設置如下:霧化氣(GS1):60 psi;輔助加熱氣(GS2):60 psi;氣簾氣(CUR):35 psi;離子化溫度(TEM):500 ℃;正、負離子模式下噴霧電壓(ISVF)分別為5 500 V和4 500 V;分子量掃描范圍:m/z50～1 000,累積時間:0.15 s;去簇電壓(DP):80 V;碰撞能量(CE):10 eV。采用動態(tài)背景扣除(DBS)和觸發(fā)信息關(guān)聯(lián)采集模式(IDA)采集數(shù)據(jù)。主要的IDA轉(zhuǎn)換標準如下:信號強度大于50 cps,4 g·mL-1以內(nèi)排除同位素,分子量誤差50 mg·mL-1,每個循環(huán)最多監(jiān)測12個候選離子。子離子掃描模式的主要參數(shù)如下:分子量掃描范圍m/z25～1 000,累積時間0.035 s;CE:(40±20)eV;其他參數(shù)同TOFMS掃描模式。采用AB公司的調(diào)諧液傳遞系統(tǒng)(CDS)對分子量準確度進行自動校準。數(shù)據(jù)采集過程由Analyst TF 1.6進行控制。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 化合物篩選 采用目標化合物靶向篩選和主要化學成分非靶向篩選相結(jié)合的方式研究芪葵顆粒復方中的化學成分。

目標化合物的靶向篩選流程如下:①依據(jù)前期黃芪[7-9,11-12]、黃蜀葵花[10]和何首烏[13-18]三味藥材化學成分研究相關(guān)文獻報道,建立芪葵顆粒化學成分庫;②在芪葵顆粒提取液的負離子模式下UPLC-QTOF-MS/MS總離子流色譜圖(TIC)中,利用PeakView軟件的提取離子流色譜圖(XIC)功能,獲取芪葵顆粒數(shù)據(jù)庫各化合物目標離子(即[M-H]-、[M+HNO3-H]-和[M+HCOOH-H]-三種準分子離子)的XIC圖;③考察各XIC圖譜中出現(xiàn)的每個色譜峰所對應的TOFMS質(zhì)譜圖,依據(jù)TOFMS提供的精確實測分子質(zhì)量(與庫化合物的精確理論分子質(zhì)量差值應<5×10-6)確證目標離子的存在并記錄其準確保留時間;④在相應保留時間的TOFMS質(zhì)譜圖中,結(jié)合質(zhì)量虧損規(guī)律[7-8,10]篩選質(zhì)荷比(m/z)大于庫化合物[M-H]-離子的可能相關(guān)離子,以排除碎片離子的干擾,并依據(jù)各離子精確分子質(zhì)量間的相互關(guān)聯(lián),篩選潛在目標化合物的各種可能類型的準分子離子(如[M-H]-、[M+HNO3-H]-、[M+HCOOH-H]-、[M+HCl-H]-、[2M-H]-等);⑤依據(jù)上述準分子離子的類型和精確分子質(zhì)量,結(jié)合芪葵顆粒數(shù)據(jù)庫中化合物的元素組成,推斷篩選所得化合物的化學元素組成(即分子式);⑥在正離子模式下,采用PeakView軟件的XIC功能,提取各分子式對應不同類型準分子離子(如[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+、[2M+H]+等)的XIC圖,在與負離子模式相對應的保留時間處考察其TOFMS質(zhì)譜圖,確證對應化合物上述準分子離子的存在;⑦結(jié)合正、負離子篩選結(jié)果,以至少2個準分子離子的出現(xiàn)為標準確認篩選化合物的存在,鎖定目標化合物。

為了全面系統(tǒng)表征芪葵顆粒復方的化學成分,彌補基于已知化合物庫篩選的不足,同時進行復方主要化學成分的非靶向篩選。采用PeakView非靶標峰尋找(Non-Targeted peak finding)功能,設定強度閾值為9 000 cps,全面提取負離子模式下芪葵顆粒中的主要化學成分離子,以部分確證上述靶向篩選結(jié)果,并按照上述流程③④⑦嘗試對豐度較大的未知化學成分進行鎖定。

2.4.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定和歸屬 鎖定目標化合物后,依據(jù)上述芪葵顆粒數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻報道,初步確定化合物名稱和結(jié)構(gòu),并通過對照品比對,準確鑒定部分化合物;同時結(jié)合文獻報道對目標化合物的二級質(zhì)譜碎片離子進行解析,并與AB Sciex中藥高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)庫匹配得分>95)搜索結(jié)果、文獻報道或?qū)φ掌返亩壭畔⑦M行比對,確證或合理歸屬目標化合物的具體化學結(jié)構(gòu)。

2.4.3 鑒定結(jié)果梳理 根據(jù)化學成分結(jié)構(gòu)的相似性和關(guān)聯(lián),結(jié)合可能發(fā)生的轉(zhuǎn)化反應,對鑒定出的各化合物間的關(guān)聯(lián)性和相互間代謝及轉(zhuǎn)化關(guān)系進行梳理和總結(jié),以表征芪葵顆粒復方化學成分的多樣性和相互關(guān)聯(lián)性。

3 結(jié)果

3.1 化合物篩選

采用UPLC-QTOF-MS/MS在“2.2”色譜和“2.3”質(zhì)譜條件下對芪葵顆粒水提液分別進行進樣分析,獲得正、負離子模式下的TIC圖,如圖1a～b所示。按照“2.4.1”化合物篩選流程,最終從芪葵顆粒水提液中篩選鎖定了89個目標化合物。各化合物正、負離子模式下的疊加XIC圖如圖1c～d所示,大部分化合物在現(xiàn)有色譜條件下可以得到比較好的分離;而對于少數(shù)不能很好分離的化合物,則可以通過高分辨質(zhì)譜的區(qū)分能力和豐富的準分子離子類型加以區(qū)分和確認。

注：a.負離子模式下TIC圖；b.正離子模式下TIC圖；c.負離子模式下XIC圖；d.正離子模式下XIC圖；1～71.已鑒定化學成分LC1～LC71;U1～U18.未鑒定化學成分圖1 芪葵顆粒水提液的UPLC-QTOF-MS色譜圖Fig.1 The UPLC-QTOF-MS chromatograms from the aqueous extract of Qikui Granules

3.2 化學成分鑒定

對89個化合物中的71個化合物實現(xiàn)了合理的結(jié)構(gòu)鑒定或歸屬。表2匯總了71個已鑒定化合物的保留時間(tR)、分子式、準分子離子、峰強度、子離子、名稱、來源藥材等詳細信息。其中19個化合物通過對照品比對進行了確認;18個化合物的一、二級質(zhì)譜信息與AB Sciex中藥高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配良好(匹配得分均大于95,滿分為100)?，F(xiàn)將主要鑒定過程簡述如下。

3.2.1 黃酮類 作為黃芪和黃蜀葵花2味藥材的主要化學成分,黃酮類化合物應為芪葵顆粒復方制劑的主要化學和藥效成分。在本研究篩選鑒定的71個化合物中,有多達45個化合物被歸屬為黃酮類,其中16個可進一步通過對照品比對準確鑒定。45個黃酮類成分按藥材來源可大體劃分為黃芪黃酮和黃葵黃酮兩大類。

3.2.1.1 黃芪黃酮類 共有31個化合物歸屬為黃芪黃酮類,其中8個化合物經(jīng)對照品比對準確鑒定。

如表2所示,多個加合離子和精確分子質(zhì)量信息提示,LC54的分子式可能為C16H12O4,對應復方中黃芪主要成分之一芒柄花素,其特征性碎片離子m/z267、252、223、208、195、167、135、132等的出現(xiàn)，以及對照品的比對結(jié)果表明,LC54為芒柄花素。類似地,LC40、LC60、LC57分別被準確鑒定為毛蕊異黃酮、黃芪異黃烷和黃芪紫檀烷。LC33、LC14、LC41和LC38可通過標準品比對分別被準確鑒定為上述4個苷元的葡萄糖苷類化合物芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷、黃芪異黃烷苷和黃芪紫檀烷苷,它們均可特征性地丟失1分子葡萄糖(162)生成對應苷元離子,并進一步裂解產(chǎn)生苷元特征子離子。上述4個苷元LC54、LC40、LC60、LC57為黃芪黃酮類化合物的主要結(jié)構(gòu)母核,其結(jié)構(gòu)中羥基、甲基、甲氧基、糖基等取代基團的位置信息可為復方中其他相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)歸屬提供合理依據(jù)。各苷元的裂解途徑詳見前期文獻報道[9,12],裂解產(chǎn)生的特征子離子(表2)對于解析其結(jié)構(gòu)類似物和相應糖苷類化合物具有重要指導意義。

表2 芪葵顆粒中鑒定出的71個化合物的詳細信息Table 2 The detailed information of 71 identified compounds in Qikui Granules

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

需要注意的是,復方中何首烏藥材中可能含有的蒽醌苷元大黃素甲醚[14,16-17]與毛蕊異黃酮互為同分異構(gòu)體。對照品進樣分析結(jié)果顯示,由于化合物極性不同,兩者保留時間相差很遠,分別為29.25 min和17.96 min,且兩者產(chǎn)生的主要特征子離子完全不同。毛蕊異黃酮的主要特征子離子為m/z268、239、211、183、148、135、91等(圖2a),而大黃素甲醚的主要特征子離子為m/z240、212、184等(圖2b),這些離子的出現(xiàn)可用于區(qū)別鑒定與兩者結(jié)構(gòu)類似的相關(guān)化合物。根據(jù)上述毛蕊異黃酮主要特征子離子的出現(xiàn),初步鑒定出6個結(jié)構(gòu)類似物。其中LC37和LC65與毛蕊異黃酮分子式相同,且同樣可產(chǎn)生主要特征子離子m/z268、239、211、183,初步鑒定其為毛蕊異黃酮同分異構(gòu)體。LC47和LC50分子式比毛蕊異黃酮多一個O,它們既可產(chǎn)生m/z239、211、183、148等毛蕊異黃酮特征子離子,又可產(chǎn)生比其多16(羥基)的299、284、255、227、199等系列特征碎片離子,據(jù)此將其歸屬為羥基毛蕊異黃酮;參考黃芪黃酮苷元LC60、LC57和黃葵黃酮苷元LC39的苯環(huán)羥基取代位置,初步推斷羥基化位點為2'位或5位;綜合結(jié)構(gòu)類似性和豐度信息,將LC47和LC50分別初步歸屬為5-羥基毛蕊異黃酮和2'-羥基毛蕊異黃酮。LC48和LC58為一組同分異構(gòu)體,其特征性母離子m/z297[M-H]-提示其分子式為C17H14O5,比毛蕊異黃酮(LC40)的分子式C16H12O5多CH2,提示其可能為甲基化的毛蕊異黃酮,甲基化位點可能為毛蕊異黃酮的3'位或7位羥基;考慮到黃芪異黃烷(LC60)的化學結(jié)構(gòu)為3'位甲氧基取代,且LC48的豐度(6 855 cps)遠高于LC58(1 713 cps),LC48和LC58分別被初步鑒定為3'-甲基毛蕊異黃酮和7-甲基毛蕊異黃酮。LC11、LC14和LC43為一組毛蕊異黃酮苷的同分異構(gòu)體,他們均可通過特征性地丟失1分子葡萄糖(162)生成苷元離子m/z283以及高豐度的毛蕊異黃酮特征子離子m/z268,其中LC14可通過標準品的保留時間和一、二級質(zhì)譜圖(圖2c)比對被準確鑒定為毛蕊異黃酮苷,這也在一定程度上驗證了依據(jù)上述苷元特征子離子歸屬類似化合物結(jié)構(gòu)的可靠性。元素組成信息提示LC21和LC27為羥基化的LC14,L24為雙羥基化的LC14;對應于LC47和LC50,將LC21、LC27和L24分別初步歸屬為5-羥基毛蕊異黃酮苷、2'-羥基毛蕊異黃酮苷和5,2'-雙羥基毛蕊異黃酮苷,其二級碎片離子中作為基峰離子存在的苷元離子m/z299、314可為上述結(jié)構(gòu)歸屬提供進一步的佐證。類似地,LC34的分子式提示為乙?；腖C14,苷元子離子m/z325表明,乙酰化不是發(fā)生在葡萄糖殘基上,而是3'位羥基上,據(jù)此鑒定其為3'-乙?；锂慄S酮苷。LC20的元素組成提示其為去甲基化的LC14,由于LC14結(jié)構(gòu)中僅4'位有甲氧基,據(jù)此推斷其為4'-去甲基毛蕊異黃酮苷,苷元4'-去甲基毛蕊異黃酮對應的碎片離子m/z269可為此推斷提供確證依據(jù)。

注：a和b源自對照品溶液;c和d源自芪葵顆粒水提液,對應編號為LC14和LC49的目標化合物。圖2 毛蕊異黃酮(a)、大黃素甲醚(b)、毛蕊異黃酮苷(c)和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(d)的二級子離子圖譜Fig.2 Product ion mass spectra of calycosin (a), physcion (b), calycosin-7-O-β-D-glucoside (c) and physcion-8-O-β-D-glucoside (d)

元素組成信息提示LC7(C23H28O11)、LC23(C31H40O16)、LC26(C29H38O15)和LC52(C25H30O11)的結(jié)構(gòu)與LC41(C23H28O10)相關(guān)。LC7可能為羥基化LC41,但沒有進一步的子離子提供支持,僅將其初步鑒定為羥基黃芪異黃烷苷,并在圖3中給出了一種可能的化學結(jié)構(gòu);LC52為乙?；疞C41,可產(chǎn)生對應黃芪異黃烷的基峰子離子m/z301,且未出現(xiàn)乙?；S芪異黃烷對應的子離子,表明黃芪異黃烷即為其苷元,乙?；咸烟菫槠涮擒?據(jù)此將其初步鑒定黃芪異黃烷-乙酰葡萄糖苷;類似地,LC26可先后丟失1個葡萄糖殘基(162)產(chǎn)生高豐度子離子m/z463、301,分別對應LC41和黃芪異黃烷(LC60),且LC41對應的子離子豐度明顯高于黃芪異黃烷,提示2個葡萄糖殘基先后丟失比共同丟失的幾率更大,推測2個葡萄糖殘基可能位于不同的羥基取代位點,據(jù)此可將其初步鑒定為黃芪異黃烷-7,2'-雙葡萄糖苷;LC23由于豐度較小,僅可見微量的丟失1分子葡萄糖(162)的碎片離子m/z505,結(jié)合文獻報道[9,11],將其初步鑒定為丙二酰黃芪異黃烷苷-四碳糖苷。

LC61為LC57的同分異構(gòu)體,且可通過特征性先后丟失O和CH2產(chǎn)生LC57的特征子離子m/z284、269等,表明其結(jié)構(gòu)中同樣含有1個羥基和1個甲基,據(jù)此初步將其歸屬為黃芪紫檀烷異構(gòu)體。LC45的分子式為C17H16O6,比苷元LC57多一個O,且其可產(chǎn)生[M-H2O]-特征子離子m/z297,提示其結(jié)構(gòu)中的2個羥基可能位于鄰位,據(jù)此初步推斷其為2-羥基黃芪紫檀烷。LC35和LC36的分子式均為C28H34O14,比LC38(C23H26O10)多1個戊糖殘基(C5H8O4),且可產(chǎn)生共同的子離子m/z299,對應苷元LC57;由于LC38結(jié)構(gòu)中僅有葡萄糖殘基上可能發(fā)生戊糖取代,初步推斷LC35和LC36為一組黃芪紫檀烷苷-戊糖苷的同分異構(gòu)體,戊糖類型及取代位點待定,僅在圖3中給出一種可能結(jié)構(gòu)。LC28和LC32的分子式為C22H24O10,比LC38少CH2,提示兩者為去甲基化的LC38,這與LC38的苷元中含有2個甲氧基相吻合,但現(xiàn)階段無法確定兩者的對應關(guān)系,因此,暫將LC28和LC32歸屬為9-去甲基黃芪紫檀烷苷或10-去甲基黃芪紫檀烷苷。

3.2.1.2 黃葵黃酮類 共有13個化合物歸屬為黃葵黃酮類,其中8個化合物經(jīng)對照品比對準確鑒定。

通過解析一級、二級質(zhì)譜信息,并與對照品的保留時間和相關(guān)質(zhì)譜信息進行比對,LC39、LC25、LC29被準確鑒定為槲皮素、楊梅素和棉皮素。如表2所示,其苷元特征子離子可為鑒定其結(jié)構(gòu)類似物和相應糖苷類化合物提供重要參考。LC16和LC17被準確鑒定為槲皮素的糖苷金絲桃苷和異槲皮苷,參考色譜保留行為與前期研究的一致性[19],其同分異構(gòu)體LC31被暫時鑒定為黃蜀葵花的另一個主要黃酮類成分槲皮素-3'-O-葡萄糖苷。LC13、LC19和LC22分別被準確鑒定為蘆丁、棉纖維素和棉皮苷。如圖2所示,上述經(jīng)標準品比對準確鑒定的5個糖苷類成分LC16、LC17、LC13、LC19和LC22均為黃酮醇苷類化合物。前期研究表明[20],黃酮醇苷類在負離子模式下發(fā)生糖苷鍵異裂生成相應苷元子離子[A-H]-的同時,還可通過糖苷鍵均裂生成相應苷元自由基子離子[A-H]·-;在同樣的儀器、同樣的CE等參數(shù)設定下,[A-H]-和[A-H]·-的豐度比值可為推斷苷元的糖基化位點提供重要參考依據(jù)。對比這5個黃酮醇苷類成分的二級質(zhì)譜碎片離子信息(表2)和化學結(jié)構(gòu)(圖3)可以發(fā)現(xiàn),3-雙糖苷LC13只生成[A-H]·-m/z300,未見[A-H]-m/z301;3-糖苷LC16和LC17產(chǎn)生的[A-H]·-m/z300與[A-H]-m/z301的豐度比值約為1.5;8-糖苷LC19和8-葡萄糖醛酸苷LC22只生成[A-H]-m/z317,未見[A-H]·-m/z316。由上可知,在本研究的試驗條件下(AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀,CE為40 eV),不同糖基化位點的黃醇酮苷類生成[A-H]·-與[A-H]-的比例從大到小的排列依次為:3-雙糖苷>3-糖苷>8-糖苷,這與前期文獻報道[20]的排列順序(3-糖苷>4'-糖苷>7-糖苷≈8-糖苷)基本一致。上述均裂離子產(chǎn)生規(guī)律對復方中其他黃酮醇苷類的化合物糖基位點歸屬具有重要指導意義。

注：(1)羥基化;(2)六碳糖基化;(3)葡萄糖醛酸化;(4)乙酰化;(5)去甲基化;(6)甲基化;(7)四碳糖基化;(8)丙二?；?(9)五碳糖基化;藍色表示經(jīng)標準品比對確認的化合物圖3 芪葵顆粒中主要化學成分的可能化學結(jié)構(gòu)及其可能涉及的轉(zhuǎn)化反應Fig.3 The candidate structures of the identified compounds and their possible related conversion reactions

LC19的同分異構(gòu)體LC8和LC9產(chǎn)生的子離子與LC19完全不同,它們僅產(chǎn)生較弱的[A-H]-m/z317,但產(chǎn)生顯著的[A-H]·-m/z316,由此可初步推斷其糖苷鍵可能位于3位;對比另一組同分異構(gòu)體金絲桃苷(LC16)和異槲皮苷(LC17)的3位糖基分別為3-O-半乳糖苷和3-O-吡喃葡萄糖苷,類似地,暫時將LC8和LC9分別初步鑒定為棉皮素-3-O-半乳糖苷和棉皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷。LC5可先后特征性地丟失1個葡萄糖醛酸殘基(176)和1個葡萄糖殘基(162),并發(fā)生苷元均裂,先后生成特征子離子m/z479、316;和LC13只生成[A-H]·-m/z300類似,只有m/z316而未見m/z317的現(xiàn)象提示苷元棉皮素的葡萄糖基化可能發(fā)生在3位;同時,對比LC22可知,葡萄糖醛酸化位點應為8位,據(jù)此將LC5合理鑒定為棉皮苷-3-O-葡萄糖苷。LC10與蘆丁(LC13)一樣,可產(chǎn)生顯著的槲皮素苷元[A-H]·-m/z300,以及271、255等特征碎片離子,且分子式比蘆丁少CH2,據(jù)此初步推測LC10也是槲皮素的3位雙糖苷,將其初步鑒定為槲皮素-3-O-葡萄糖苷-戊糖苷。

LC18的分子式為C28H32O15,與毛蕊異黃酮雙葡萄糖苷的分子式相符合,但其產(chǎn)生的子離子中未見毛蕊異黃酮的特征離子,它可以通過特征性丟失m/z194，生成可能是其苷元離子的m/z413,并可產(chǎn)生主要碎片離子m/z193,暫時將其歸屬為黃酮類,其藥材來源可能為黃芪或黃蜀葵花,化學結(jié)構(gòu)有待進一步深入研究。

3.2.2 皂苷類 復方中篩選出的化合物里共有14個被歸屬為皂苷類,均來源于黃芪藥材。其中LC56可通過對照品比對準確鑒定為黃芪甲苷,LC51、LC55和LC59因與LC56具有類似的準分子離子而被簡單歸屬為黃芪甲苷同分異構(gòu)體。LC63、LC64和LC66的分子式為C43H70O15,比LC56多1個乙?；?C2H2O),參考前期研究[7-8],將其初步歸屬為黃體皂苷Ⅱ同分異構(gòu)體。類似地,LC67、LC68和LC70比LC56多2個乙?；?將其初步鑒定為黃芪皂苷Ⅰ異構(gòu)體;LC71比LC56多3個乙酰基,將其初步鑒定為乙酰黃芪皂苷Ⅰ;LC46和LC53比LC56多1分子葡萄糖和1分子木糖,將其初步鑒定為黃芪皂苷Ⅴ/Ⅵ/Ⅶ同分異構(gòu)體;LC62被初步鑒定為大豆皂苷。

3.2.3 蒽醌類 復方中篩選出的化合物里共有4個被歸屬為蒽醌類,均來源于何首烏藥材。其中LC69可通過標準品比對分別準確鑒定為大黃素;與文獻報道[16]一致,大黃素的[M-H]-m/z269可通過先后丟失CO、CO2、CH3等生成m/z241、225、210、197、185、182等系列特征子離子。依據(jù)一級、二級質(zhì)譜信息的相似性,LC44被初步鑒定為大黃素同分異構(gòu)體。類似地,LC42可通過特征性地丟失1個葡萄糖苷殘基生成大黃素苷元離子m/z269,苷元進一步裂解可產(chǎn)生m/z241、225、210等大黃素系列特征子離子,據(jù)此初步鑒定其為大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷。與文獻報道[14,16-17]不同,復方水提液樣品中未檢測到大黃素甲醚,但依據(jù)特征性地162丟失,苷元離子m/z283以及m/z240等大黃素甲醚主要特征子離子(圖2b和2d)的出現(xiàn),LC49被合理歸屬為大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷,與文獻報道相一致[18]。

3.2.4 二苯乙烯苷類 二苯乙烯苷類化合物為何首烏藥材的主要化學成分之一。本研究從復方中篩選出3個二苯乙烯苷類LC6、LC12和LC15。在TOFMS負離子模式下,LC15可以產(chǎn)生明顯而豐富的準分子離子如m/z405[M-H]-、811[2M-H]-、451[M+HCOOH-H]-、468[M+HNO3-H]-等;子離子模式下,m/z405[M-H]-可通過特征性地丟失1個葡萄糖苷殘基(162)產(chǎn)生基峰四羥基二苯乙烯苷元離子m/z243,以及m/z225、215、173、137、131、109等苷元重排后產(chǎn)生的特征碎片離子,上述裂解途徑及特征子離子與文獻[16]中反式二苯乙烯苷的相關(guān)描述相一致;通過對照品對比,將其準確鑒定為二苯乙烯苷。LC6和LC12均可產(chǎn)生明顯而豐富的各種準分子離子(其中LC6以[M+HCOOH-H]-m/z613豐度最高,而LC12則主要產(chǎn)生[M-H]-m/z567,這或許與其化學結(jié)構(gòu)不同密切相關(guān),有待深入研究考證),表明其分子式為C26H32O14,比LC15(C20H22O9)多C6H10O5,且均可產(chǎn)生四羥基二苯乙烯苷元特征子離子m/z243,據(jù)此初步推測其為二苯乙烯苷的葡萄糖苷;LC6的[M-H]-可產(chǎn)生子離子m/z405,表明LC15結(jié)構(gòu)母核上發(fā)生糖基化取代的可能為酚羥基,據(jù)此初步將其歸屬為二苯乙烯苷-O-葡萄糖苷;而LC12的[M+HCOOH-H]-和[M-H]-的子離子中均未見m/z405的出現(xiàn),表明其LC15結(jié)構(gòu)母核上發(fā)生糖基化取代的可能為葡萄糖殘基;據(jù)此,將LC12初步鑒定為四羥基二苯乙烯-2-O-雙葡萄糖苷,其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

3.2.5 其他類 LC1和LC30為一組同分異構(gòu)體,均可產(chǎn)生豐富的準分子離子m/z341[M-H]-、387[M+HCOOH-H]-、404[M+HNO3-H]-和377[M+HCl-H]-等,但其保留時間分別為1.16 min和15.66 min,表明其極性相差較大,結(jié)構(gòu)也應完全不同。參考文獻報道[13]和AB Sciex數(shù)據(jù)庫,暫時將其鑒定為蔗糖或松二糖,具體結(jié)構(gòu)有待進一步確證。由于多糖為黃芪、黃蜀葵花和何首烏藥材里面的共有主要成分,且芪葵顆粒為3味藥材組成的水提制劑,據(jù)此推測芪葵顆粒中檢測到的上述2種二糖來源于復方藥材,而非制劑輔料。

LC2和LC3也是一組同分異構(gòu)體,在TOFMS全掃描圖譜上,準分子離子m/z383[2M-H]-、193[M+H]+、215[M+Na]+、210[M+NH4]+的出現(xiàn),證明離子m/z191為此組同分異構(gòu)體的[M-H]-，而非源內(nèi)裂解碎片離子,其對應的分子式為C6H8O7,根據(jù)AB Sciex數(shù)據(jù)庫匹配結(jié)果暫時將其鑒定為異檸檬酸或檸檬酸。

LC4的保留時間為1.71 min,m/z339[2M-H]-碎片的存在證明離子m/z169為其[M-H]-，而非源內(nèi)裂解離子;由精確分子質(zhì)量可推知其分子式應為C7H6O5,與何首烏藥材中的主要成分沒食子酸[8]相符;與文獻報道一致[7-8],其特征性子離子m/z125、81等的出現(xiàn)進一步驗證了該推斷。

4 討論

本研究通過全面考察庫中化合物的XIC圖,不僅可以發(fā)現(xiàn)已有報道的化合物,還能全面篩選其同分異構(gòu)體和與之結(jié)構(gòu)母核類似(具有相同子離子)的新化合物?；衔锏逆i定依據(jù)為不少于2個準分子離子的存在,且通常情況下為一個離子模式下不少于2個;與前期文獻報道[11,15-16]不同,設定這樣的鎖定依據(jù),可以避免將子離子對應的結(jié)構(gòu)碎片鑒定為化合物的錯誤風險。同時,為了彌補基于已知化合物庫篩選的局限性,全面系統(tǒng)表征芪葵顆粒復方的化學成分,本研究對復方主要化學成分(離子強度大于9 000 cps)進行了非靶向篩選,其結(jié)果既在一定程度上驗證了靶向篩選的結(jié)果,也發(fā)現(xiàn)了一些新的未知化合物。

根據(jù)篩選鑒定出的71個化合物,作者嘗試對芪葵顆粒中主要化學成分涉及到的轉(zhuǎn)化反應進行總結(jié)歸納。在此過程中,假設轉(zhuǎn)化反應的起點為結(jié)構(gòu)最簡單的化合物,即將芒柄花素、紫檀烷和異黃烷3個苷元作為黃芪黃酮類化合物的轉(zhuǎn)化起點,將槲皮素、黃芪甲苷、大黃素和二苯乙烯苷分別作為黃葵黃酮類、黃芪皂苷類、何首烏蒽醌類和何首烏苯乙烯苷類化合物的轉(zhuǎn)化源頭。需要指出的是,上述轉(zhuǎn)化起點及轉(zhuǎn)化反應方向在生成復方化學成分的過程中也有可能是可逆的。如圖3所示,在上述假設下,鑒定結(jié)果表明,芪葵顆粒主要化學成分的形成可能涉及羥基化、糖基化、葡萄糖醛酸化、乙?；⒓谆?、丙二酰化等多種轉(zhuǎn)化反應及其逆反應。

如表2所示,對71個已鑒定化合物的統(tǒng)計結(jié)果顯示,各種準分子離子類型出現(xiàn)的頻率從高到低依次為:[M-H]-(58次)>[M+HNO3-H]-(54次)=[M+H]+(54次)>[M+Na]+(46次)>[M+HCOOH-H]-(44次)>[M+HCl-H]-(38次)>[M+NH4]+(28次)。此外,某些化合物也有[2M-H]-和[2M+HCOOH-H]-等二聚體準分子離子的存在。多種準分子離子的高頻率同時出現(xiàn)為明確化合物的存在,排除源內(nèi)裂解碎片離子的干擾提供了極大的便利。不過,不同類型準分子離子的產(chǎn)生及其豐度高低可能會受到流動相組成、化合物類型和具體的化學結(jié)構(gòu)等多種因素的影響。如本研究及前期研究[7-8,10]顯示:采用LC-MS系統(tǒng)會使多數(shù)化合物產(chǎn)生明顯的[M+HNO3-H]-;LC流動相中甲酸和甲酸銨的加入會增加[M+HCOOH-H]-和[M+NH4]+的豐度和出現(xiàn)頻率。因此,在中藥成分定性分析中,適當優(yōu)化流動相的添加成分,不僅能夠改善化合物的峰形,還可以豐富準分子離子的類型,提高化合物篩選的效率和準確度?；衔锏念愋突蚪Y(jié)構(gòu)與主要準分子離子的類型也顯現(xiàn)出一定的相關(guān)性,本研究結(jié)果初步顯示,皂苷類化合物多以[M+HCOOH-H]-為主,黃酮苷元多以[M-H]-為主,黃芪黃酮苷多以[M+HCOOH-H]-和[M+HNO3-H]-為主,而黃葵黃酮苷則以[M-H]-和[M+HNO3-H]-為主?；橥之悩?gòu)體的化合物主要加合離子類型也有可能完全不同,如前面鑒定部分提到的LC6和LC12。上述加合離子的存在類型和豐度與化學結(jié)構(gòu)的內(nèi)在聯(lián)系及其規(guī)律有待后續(xù)系統(tǒng)嚴謹?shù)纳钊胙芯俊?/p>

已鑒定化合物的峰強度信息顯示,豐度最高的前15個化合物(峰強度大于100 000 cps)依次為LC15、LC2、LC3、LC40、LC54、LC1、LC69、LC22、LC17、LC16、LC14、LC33、LC4、LC31和LC38。這些成分包含何首烏中的二苯乙烯苷、沒食子酸和大黃素,黃芪中的3個異黃酮苷和2個苷元,黃蜀葵花中的4個黃酮苷,以及可能存在于3種藥材中的糖類和檸檬酸,這也在一定程度上提示3味藥材對復方發(fā)揮藥效均具有重要的作用。

綜上,本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS分析技術(shù)平臺,采用靶向和非靶向相結(jié)合的篩選鑒定方法,從芪葵顆粒中篩選出89個主要化學成分,并對其中71個進行了準確鑒定或合理歸屬。該研究明確了芪葵顆粒中化學物質(zhì)的存在形式,為科學闡明芪葵顆粒的藥效物質(zhì)和優(yōu)化其制劑質(zhì)控標準提供了重要參考依據(jù);同時,本研究也表明基于UPLC-QTOF-MS/MS分析的靶向和非靶向相結(jié)合的篩選鑒定策略在中藥等復雜化學成分的系統(tǒng)定性表征方面具有巨大的應用潛力。