亓 菲，劉蒙達(dá)，張皓博，范偉興，孫淑芳，樊曉旭

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

結(jié)核病是由分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病，是世界上致命的傳染病之一。全球每年共有活動性結(jié)核病病例達(dá)1 000 萬例，其中兒童患者100 萬例。2022 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)告顯示，結(jié)核病死亡病例達(dá)140 萬，目前仍有約36%的結(jié)核病新發(fā)病例未得到及時(shí)診斷和報(bào)告[1]。多數(shù)地區(qū)常規(guī)結(jié)核病診斷手段依賴于痰樣本細(xì)菌培養(yǎng)。但是，該方法存在局限性：一方面痰樣本很難獲得，另一方面在兒童、肺外結(jié)核病患者、艾滋病病毒合并感染者中診斷敏感性較低。

所有分枝桿菌都表達(dá)一種獨(dú)特的包膜糖脂，即脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）。LAM 暴露在分枝桿菌表面，與免疫原性相關(guān)，是一種潛在的毒力因子，可與白細(xì)胞結(jié)合并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。2014 年，WHO 呼吁“開發(fā)基于生物標(biāo)志物的快速非痰液檢測方法，旨在通過識別特征性生物標(biāo)志物來檢測所有形式的結(jié)核病”，并要求檢測方法在能診斷活動性結(jié)核病的同時(shí)具有高特異性[2]。目前，LAM 已被建議作為結(jié)核病診斷的一種生物標(biāo)志物，它能以可溶形式從活動性肺結(jié)核病患者的尿液中排出。盡管LAM 檢測技術(shù)對單純的結(jié)核病患者檢測敏感性相對有限，但對免疫抑制結(jié)核病患者表現(xiàn)出很好的敏感性。由于尿液樣本易于收集，該技術(shù)在免疫抑制結(jié)核病患者以及很難產(chǎn)生痰液的兒童及重癥結(jié)核病患者中顯示出巨大潛力。鑒于此，本綜述介紹了LAM 的相關(guān)研究進(jìn)展，特別是在結(jié)核病診斷方面的應(yīng)用。

1 LAM 結(jié)構(gòu)

LAM 是分枝桿菌細(xì)胞壁內(nèi)三大相互關(guān)聯(lián)的脂多糖群之一，通過糖脂錨定方式非共價(jià)連接到分枝桿菌質(zhì)膜，并延伸到細(xì)胞壁表面。LAM 分子含有3 個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：（1）將LAM 分子與生物體質(zhì)膜結(jié)合的糖磷脂錨；（2）在分枝桿菌中高度保守且與糖磷脂錨相連的核心結(jié)構(gòu)；（3）具有可變甘露糖帽子和側(cè)鏈的阿拉伯聚糖結(jié)構(gòu)域[3]。這些結(jié)構(gòu)的變化，可產(chǎn)生多種具有一系列獨(dú)特性質(zhì)和功能的LAM 分子。甘露糖帽子結(jié)構(gòu)可促進(jìn)分枝桿菌與巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體結(jié)合，為生物體提供了首選的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。

結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒菌株（如H37Rv、Erdman或NYH-27）的LAM 與無毒菌株或臨床分離菌株的LAM 在結(jié)構(gòu)上存在差異，與其他致病性分枝桿菌（如麻風(fēng)分枝桿菌）LAM 相比也有差異。LAM 結(jié)構(gòu)的差異和多樣性主要由以下方面決定：（1）末端連接的分子類型，即甘露糖（mannose，Man）、阿拉伯糖或甲基硫代-D-木糖（methylthio-D-xylose，MTX），可誘導(dǎo)復(fù)雜結(jié)構(gòu)成分含量；（2）表位結(jié)構(gòu)配置以及與Man連鎖的MTX 分支，這是確定表位長度和結(jié)構(gòu)組成的關(guān)鍵[4]。據(jù)觀察，LAM 這些結(jié)構(gòu)成分可動態(tài)變化，從而對表位識別造成影響。LAM 結(jié)構(gòu)的改變會直接影響到一些抗體（CS-35、A194、MoAb1、S4-20、FIND 28、CS40 和CS906.7） 的特異性表位識別能力[4-5]。末端D-阿拉伯多糖側(cè)鏈（mannose-capped LAM，ManLAM）上帶有甘露糖基化帽LAM 分子，這是致病性分枝桿菌的特征性結(jié)構(gòu)；而恥垢分枝桿菌中通常帶有磷酸肌醇LAM（phosphatidyl-myo-inositol capped LAM，PILAM），其他快速生長的分枝桿菌如龜分枝桿菌中的LAM 沒有甘露糖或磷酸肌醇帽化，被稱為AraLAM 分子[3，6]。ManLAM 分子具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)特性，而PILAM 和AraLAM 在人體內(nèi)具有強(qiáng)烈的促炎癥作用。研究發(fā)現(xiàn)，LAM 相對分子質(zhì)量峰值集中在17.3 kDa，但峰值兩側(cè)多峰分布廣泛，反映出相當(dāng)大的分子異質(zhì)性。因此，來自任何特定來源的LAM，在大小、側(cè)鏈分支模式、甘露聚糖核心、阿拉伯多糖側(cè)鏈?；土姿峄矫娑即嬖诓町悺４送?，LAM 具有熱穩(wěn)定性，在臨床樣本中不易降解，適用作診斷靶點(diǎn)。

2 LAM 功能

結(jié)核分枝桿菌在應(yīng)激條件下具有很強(qiáng)適應(yīng)能力，可以發(fā)生蛋白質(zhì)組、脂組重排。在感染的不同階段，糖脂分布以及LAM 與脂甘露聚糖（lipomannan，LM）的比值可發(fā)生變化。低濃度LAM 可誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，這可能是由于LAM 具有多個(gè)表位，這些表位可與細(xì)胞表面受體以不同程度親和力發(fā)生相互作用，例如暴露在嗜酸性粒細(xì)胞表面的CR3 凝集素結(jié)構(gòu)域能與甘露糖相互作用，從而介導(dǎo)細(xì)菌攝取[7]。LAM 具有不同數(shù)量的甘露糖單位，而甘露糖濃度增加直接影響樹突狀細(xì)胞成熟及其功能。從結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌中分離的LAM 會抑制T 細(xì)胞增殖，影響γ干擾素介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化，抑制蛋白激酶活性，促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子，以及介導(dǎo)補(bǔ)體激活[8]。

在對先天性免疫的調(diào)節(jié)中，LAM 等毒力因子通過影響免疫細(xì)胞（如肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的活性和功能對抗宿主防御系統(tǒng)。LAM 通過TLR-2 信號傳導(dǎo)、p38 表達(dá)上調(diào)、ERK1/2 磷酸化誘導(dǎo)人類II 型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）-37[9]。IL-37 可與Smad3（SMAD家族成員3）形成復(fù)合物，被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，從而抑制促炎細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。LAM 能夠阻斷免疫細(xì)胞亞群的激活和分化。例如，通過體外試驗(yàn)證實(shí)，暴露于LAM 的單核細(xì)胞無法分化為成熟巨噬細(xì)胞，其表型上缺乏CD86、TLR2 和TLR4表達(dá)。這些巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子的細(xì)胞內(nèi)信號激活功能受損，導(dǎo)致PAR2 通路在控制細(xì)胞內(nèi)Mtb生長方面存在功能缺陷[11]。LAM 影響了中性粒細(xì)胞通過CD11b/CD18 分子吞噬分枝桿菌。LAM 作用于中性粒細(xì)胞膜上富含乳糖神經(jīng)酰胺的脂筏，從而破壞酪氨酸蛋白激酶信號，抑制造血細(xì)胞激酶與Lyn 酪氨酸激酶關(guān)聯(lián)，防止吞噬溶酶體形成、細(xì)胞因子產(chǎn)生、脫顆粒和呼吸爆發(fā)[12]。LAM 通過抑制吞噬體成熟，影響先天性免疫反應(yīng)激活和進(jìn)一步發(fā)揮作用。LAM 與TLR1 1805G/T 多態(tài)性相關(guān)，因而增加了宿主對結(jié)核分枝桿菌的易感性。此外，結(jié)核病患者血清中循環(huán)的LAM 通過高密度脂蛋白，提高了人類巨噬細(xì)胞對分枝桿菌的易感性，顯著抑制了腫瘤壞死因子的生成。上述研究表明，LAM可影響先天免疫細(xì)胞的表型和功能，并進(jìn)一步延遲先天免疫反應(yīng)，削弱反應(yīng)效果。

在對獲得性免疫的調(diào)節(jié)中，LAM 促進(jìn)產(chǎn)生IL-10 的B 細(xì)胞（B-10）亞群（CD1 低CD5+）數(shù)量增加，而LAM 被B-10 細(xì)胞表達(dá)的TLR2 識別，進(jìn)一步有利于通過AP-1 產(chǎn)生IL-10。富含IL-10的微環(huán)境可促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的存活，抑制宿主的促炎免疫防御反應(yīng)。LAM 主要在脂筏部位插入CD4+T 細(xì)胞膜，阻斷Zeta 鏈相關(guān)蛋白激酶70（ZAP-70）、CD3ζ 鏈（CD3ζ）、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶和激活T 細(xì)胞連接子等的分子磷酸化，抑制通過經(jīng)典TCR 依賴途徑激活CD4+T 細(xì)胞，還可以通過上調(diào)淋巴細(xì)胞無能相關(guān)基因（genes related to anergy in lymphocytes，GRAIL），導(dǎo)致CD4+T 細(xì)胞活性受損[13]。

3 LAM 在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

根據(jù)LAM 特性，將其作為生物標(biāo)志物，開發(fā)了相關(guān)免疫學(xué)診斷方法。但是，LAM 是一種水溶性分子，不能采取從細(xì)胞中提?。ㄏ嗨葡嗳埽┑姆椒āｋS著技術(shù)的不斷發(fā)展，在保證其生物學(xué)活性前提下的提取、純化、制備特異性單克隆抗體（簡稱單抗）工藝日益成熟，人們相應(yīng)開發(fā)了檢測尿液、血清中LAM 的ELISA 試劑盒。

3.1 LAM 純化

LAM 是一種大的雙親性分子，具有高度的內(nèi)在分子異質(zhì)性。分枝桿菌細(xì)胞包膜中含有與LAM結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子，如LM、阿拉伯甘露聚糖、磷脂酰肌醇甘露糖苷（phosphatidylmyo-inositol mannosides，PIM）和甘露聚糖等，從而影響了其純度提取。因此，獲得LAM 的均質(zhì)組分需要實(shí)現(xiàn)以下關(guān)鍵步驟：去除蛋白質(zhì)和核酸干擾物，疏水作用色譜法分離脂多糖，尺寸排除色譜法分離脂聚糖。在幾十年前的研究中，對LAM 的純化采用了不同的程序，如疏水作用色譜法，以及離子交換色譜法與凝膠過濾法相結(jié)合，1999 年Hamasur 等[14]發(fā)明了更簡單方便且高產(chǎn)的氯仿-甲醇萃取結(jié)合凝膠過濾的方法。

Cantera 等[15]提出：LAM 免疫檢測的敏感性受到限制是由于采用了體外培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌提純的LAM 抗原，而不是從臨床患者體內(nèi)尿液樣本中純化的LAM。他們認(rèn)為尿LAM（urine LAM，uLAM）對新型uLAM 特異性抗體開發(fā)和篩選至關(guān)重要，純化后的LAM 可用于開發(fā)更加敏感的活動性結(jié)核病uLAM 診斷方法。他們提供了一種可以從大量尿液中有效富集uLAM 的基本方法，但需要繼續(xù)開發(fā)改進(jìn)，比如處理具有更高uLAM 濃度的大量尿液來收獲更高產(chǎn)量的uLAM。另一種非免疫親和方法是使用重組人甘露糖結(jié)合凝集素。該凝集素可與LAM 甘露聚糖帽子結(jié)構(gòu)相互作用，在中等體積（500 mL）的尿液樣本中的純化效率高達(dá)51.4%，但純化的uLAM 量非常低，不足以通過SDS-PAGE 和蛋白質(zhì)印跡對LAM 進(jìn)行典型分子分析。目前還沒有商業(yè)化的LAM 提純試劑盒，但有國內(nèi)外品牌（如上海羽哚生物、杭州華葵金配生物、美國MOSS 等）的LAM 抗原產(chǎn)品。

3.2 LAM 單抗制備

為進(jìn)一步提高對LAM 的檢測性能，有關(guān)抗LAM 單抗的研究一直在繼續(xù)。目前制備的單抗主要包括檢測LAM Ara4 和Ara6 結(jié)構(gòu)的單抗（A194-01、CS-35、900 系列）以及嚴(yán)格依賴Ara6 結(jié)構(gòu)的單抗（FIND 系列），還包括天然人源單抗（P30B9）、小鼠源單抗（CS-40）和4 種來源于噬菌體展示文庫（My2F12、MoAb1、MoAb2 和MoAb3）的單抗，另有通過肺結(jié)核病患者記憶B 細(xì)胞體外培養(yǎng)，制備的A194 單抗等[3]。鼠抗LAM 單抗（如CS-35）是目前國際上公認(rèn)有效的抗LAM 單抗，目前暫無商品化抗LAM 單抗。

高親和力抗LAM 單抗CS-35 是由麻風(fēng)分枝桿菌接種小鼠后制備的，也是唯一一種通過X 射線晶體學(xué)方法獲悉詳細(xì)表位結(jié)合信息的單抗。Yan等[16]用結(jié)核分枝桿菌H37Rv 株細(xì)胞壁成分免疫家兔，建立了免疫單鏈可變區(qū)片段（scFv）噬菌體展示文庫；通過ELISA 篩選，鑒定了針對LAM 的scFv 單抗；通過對所選克隆的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行測序，構(gòu)建了包含全長輕鏈和重鏈的載體，并在293 T 細(xì)胞中共表達(dá)，產(chǎn)生完整的IgG 抗體；采用多種免疫分析方法，測定了抗結(jié)核分枝桿菌H37Rv 純化LAM 的單抗對多種分枝桿菌的性能和結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)這種新型兔抗LAM 特異性單抗能夠較好地識別生長緩慢的致病性分枝桿菌LAM。

3.3 尿液中LAM 檢測方法

Hamasur 等[17]首次提出將LAM 作為結(jié)核病診斷的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)：在腎臟的血液過濾過程中，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞形成了一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中孔徑可容納攜帶LAM 的Mtb 從膜分子或細(xì)胞外囊泡通過，使LAM 通過尿液排出；通過建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）來檢測尿中LAM 的含量，從而進(jìn)行結(jié)核病診斷。尿液LAM 檢測方法對于診斷晚期免疫缺陷和CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)低的艾滋病病毒（HIV）感染相關(guān)結(jié)核病患者具有很好的敏感性。2005 年，美國Chemogen 公司開發(fā)了檢測尿液LAM 的ELISA 試劑盒，后來將其更名為Clearview? TB ELISA 試劑盒。2012 年，美國Alere 公司Determine? TB LAM 檢測試劑盒問世。Clearview 與Determine 試劑盒相比，在450 nm處讀取OD 值后判定的結(jié)果幾乎相同（Determine 24/85、Clearview 23/85），且在30 min 內(nèi)能得到結(jié)果[18]。

側(cè)流尿脂阿拉伯甘露聚糖（lateral flow urine lipoarabinomannan，LF-LAM）檢測是一種商業(yè)化的活動性肺結(jié)核病床旁檢測方法，是WHO 推薦的床旁結(jié)核病檢測方法之一，可用于CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)低的HIV 合并感染結(jié)核病患者或重癥患者的診斷，包括HIV 陽性的成年人、青少年和有結(jié)核病癥狀（肺或肺外）住院及門診患者。LF-LAM 最突出的優(yōu)勢是價(jià)格低，僅為核酸擴(kuò)增檢測價(jià)格的1/3～1/4。LF-LAM 的靈敏度不是最佳，對于CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)大于200 細(xì)胞/mm3的患者不建議進(jìn)行LAM 檢測[19]。在一項(xiàng)來自南非、越南和加納共1 595 名HIV-分枝桿菌感染患者的Alere LAM 診斷研究中，應(yīng)用微生物學(xué)參考標(biāo)準(zhǔn)評估敏感性和特異性，發(fā)現(xiàn)LF-LAM 的總體敏感性為34.9%，特異性為95.3%；使用復(fù)合參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微生物學(xué)確診和結(jié)核病患者臨床診斷，發(fā)現(xiàn)LF-LAM 的敏感性為31.4%；在CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)≤100 個(gè)/μL 的患者中，LF-LAM 的敏感性為56.0%；在CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)為＞200 個(gè)/μL 的患者中，LF-LAM 的敏感性為10.9%[20]。

日本開發(fā)的Fujifilm SILVAMP TB 尿液LAM 檢測試劑盒（簡稱FujiLAM），診斷需50～60 min。該方法在讀取結(jié)果時(shí)不使用參考卡，測試線顯色即判為陽性。該檢測技術(shù)采取了一對高親和力單抗，主要針對結(jié)核分枝桿菌的特異性LAM 表位，通過銀擴(kuò)增可增加待檢和對照品測試線的可見度，使待檢尿液中LAM 濃度較LF-LAM 檢測限降低約1/30，有望提高床旁結(jié)核病的檢測效率[21]。在對389 名可獲得現(xiàn)場尿和晨尿的艾滋病-結(jié)核病患者尿樣的檢測中，患者的CD4 細(xì)胞計(jì)數(shù)中位數(shù)為176個(gè)/μL，現(xiàn)場尿與晨尿測試結(jié)果的總體一致性為94.6%，與微生物參考標(biāo)準(zhǔn)相比，F(xiàn)ujiLAM 檢測現(xiàn)場尿和晨尿的敏感性分別為67.4%和69.8%，特異性分別為90.2%和89.0%，雙樣本策略將FujiLAM靈敏度從67.4%提高到74.4%，而特異性從90.2%降低到87.3%[22]。這項(xiàng)研究表明，F(xiàn)ujiLAM 在現(xiàn)場尿和清晨尿樣本上的檢測表現(xiàn)相當(dāng)，采用雙樣本檢測策略可以提高靈敏度，但有降低特異性的風(fēng)險(xiǎn)，這些數(shù)據(jù)可以為未來的指南和臨床實(shí)踐提供信息。

在歐洲，人們利用光子生物傳感器，開發(fā)了實(shí)時(shí)檢測尿液LAM 的床旁檢測方法。這種方法原理是當(dāng)特異性抗體（anti-LAM）與抗原發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，光折射率會發(fā)生變化，通過干涉儀和芯片光譜的共振波長偏移測量信號判定結(jié)果。通過免疫反應(yīng)分析，可以在15 min 內(nèi)對未稀釋的人尿液樣本進(jìn)行結(jié)核病檢測；檢測僅需要150 μL 的尿液，尿液LAM 的檢測限為475 pg/mL；與目前商業(yè)化結(jié)核病LAM 檢測試劑相比，生物傳感實(shí)時(shí)檢測LAM 法表現(xiàn)出較高的靈敏度（100%）和特異性（100%）[23]。

3.4 血清中LAM 檢測方法

通過使用特異性熒光標(biāo)記抗體結(jié)合共聚焦顯微鏡掃描觀察發(fā)現(xiàn)，LAM 能夠與膜細(xì)胞結(jié)合，表現(xiàn)出雙親和特性，這將為結(jié)核分枝桿菌的免疫分析檢測提供新的思路。這種方法不僅可以檢測組織學(xué)標(biāo)本中的LAM，還可以檢測外周血中的LAM。用ELISA 方法檢測血液中的LAM 抗原發(fā)現(xiàn)：該檢測對痰涂片陽性活動性肺結(jié)核病患者的敏感性為88%，對痰中抗酸桿菌陰性的活動性肺結(jié)核病患者的敏感性為67%，對艾滋病-結(jié)核病患者的檢測結(jié)果不太理想，敏感性僅為57%，對結(jié)核病患者的特異性為91.5%[24]。與尿液LAM 檢測相比，血液LAM-ELISA 對免疫抑制結(jié)核病患者的敏感性較低，其中LAM 可以在細(xì)菌囊泡內(nèi)移動，這可能是LAM 逃避抗體識別的原因之一?；|(zhì)效應(yīng)研究表明，交叉反應(yīng)、低吸附、免疫復(fù)合物干擾或血清LAM 濃度低、LAM-HDL 或LAM 蛋白復(fù)合物干擾等因素會影響檢測的敏感性。其中，Laurentius等[25]指出LAM 與蛋白相互作用是血液LAM 檢測的主要干擾因素，建議用酸（HClO4）、加熱或甲醇處理人血清中的蛋白質(zhì)使其變性，以提高ELISA檢測的敏感性。

4 LAM 應(yīng)用展望

LAM 是一種很有應(yīng)用前景的結(jié)核病診斷生物標(biāo)志物，無論患者是否感染HIV，無論結(jié)核分枝桿菌感染部位在哪，基于LAM 的檢測有望用于成人和兒童結(jié)核病的診斷。然而，尿液LAM 檢測仍存在一些局限性，例如對單純結(jié)核病患者的檢測敏感性低、單抗特異性低，結(jié)核病患者臨床特征也會干擾診斷分析。血清LAM 檢測的局限性包括：樣本基質(zhì)效應(yīng)干擾、LAM 與細(xì)胞或可溶性分子相互作用、LAM 表位結(jié)構(gòu)變化。除此之外，檢測還可能受到試劑的影響（例如非結(jié)核分枝桿菌抗體與LAM 的交叉反應(yīng)性）、不同樣本類型的LAM 結(jié)構(gòu)差異影響，以及分析設(shè)計(jì)和檢測平臺等因素的影響。

針對目前方法存在的不足，一是利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)等手段，找到更保守、免疫原性更高的LAM結(jié)構(gòu)表位；二是優(yōu)化天然LAM 純化工藝、人工合成LAM 工藝等，在保證其生物學(xué)活性的前體下提高產(chǎn)量；三是通過重組表達(dá)等技術(shù)，開發(fā)高特異性、高親和力單抗；四是充分把握技術(shù)發(fā)展紅利，融合生物傳感、化學(xué)、電、磁、光學(xué)等多學(xué)科，進(jìn)一步增強(qiáng)和放大特異性信號，提高檢測的靈敏度，延長檢測的窗口期。今后需建立基于LAM 生物標(biāo)志物的便攜、快速、經(jīng)濟(jì)的現(xiàn)場快速診斷方法，作為目前結(jié)核病經(jīng)典診斷方法的補(bǔ)充，以提高結(jié)核病病原的甄別效率。