趙方鈺，崔慧珍，王一新，常 爽，蔡曼珊，趙 鵬

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，廣東廣州 510000）

禽白血?。╝vian leukosis，AL）是由禽C型逆轉(zhuǎn)錄病毒群的禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）感染引起的一種禽腫瘤性疾病，包括淋巴細胞性白血病、骨髓性白血病及紅細胞性白血病等[1-3]。根據(jù)宿主范圍和不同毒株間的相互干擾作用以及病毒囊膜糖蛋白的抗原構(gòu)造，可將ALV分為11 種亞群（A—K），其中E 亞群屬于內(nèi)源性ALV，不具有致病性或致病性很低，而K 亞群ALV（ALV-K）是從我國地方品系雞中首先分離到的新亞群[4-6]，近年來在黃羽肉雞和地方品系雞中報道較多。與其他亞群相比，J 亞群具有更強的致病性及傳播能力，危害更大[7]。流行病學調(diào)查[8-10]顯示，A、B、J、K 是我國流行范圍最廣且危害最嚴重的4 種主要代表亞群。不同品種雞感染ALV后表現(xiàn)不同類型的臨床癥狀，如生長遲緩，飼料利用率低，多種臟器腫瘤并且誘導免疫抑制等，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失[11-12]。因此AL 被列為我國種禽場必須要實現(xiàn)凈化的主要禽病之一。

在實施AL 凈化過程中，盡早檢出和淘汰ALV 陽性雛雞對于最大程度降低病毒垂直傳播及其帶來的早期水平傳播極為重要。目前最簡單快速的初篩方法就是采集雛雞胎糞進行ALV 群特異性衣殼蛋白27（protein 27，p27）抗原檢測，以此首先將經(jīng)垂直傳播感染帶毒的雛雞檢出淘汰。實驗室中常用的ALV 檢測方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光測定（IFA）等[13-15]。ALV p27 抗原ELISA 是目前實施凈化用途最廣泛的檢測技術(shù)，已在AL 凈化中被廣泛應用多年。目前市場上有多種商品化ALV-p27 抗原ELISA 檢測試劑盒，其靈敏度和特異性有所差異[16-17]。磁微?；瘜W發(fā)光技術(shù)是將磁性分離技術(shù)、化學發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來的一種新興分析技術(shù)，目前已有企業(yè)開發(fā)了用于檢測p27抗原的磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒，但其應用效果尚未得到驗證。本研究通過對7 日胚齡SPF 雞胚經(jīng)卵黃囊接種ALV-K，構(gòu)建雞胚垂直感染攜帶ALV-K模型，分別用3 家公司的ALV-p27 抗原ELISA 檢測試劑盒、磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒以及膠體金檢測試紙條進行檢測和結(jié)果比較，以期為評價不同試劑盒或不同檢測方法在凈化中的價值提供評估模型。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞

ALV-K 野毒株（ALV-K JS11C1 毒株，Genbank 登錄號KF746200.1），由山東農(nóng)業(yè)大學家禽腫瘤病實驗室于2012 年從江蘇省某地方品系保種雞群中分離鑒定和保存；用于病毒增殖的DF-1 細胞系，購自美國ATCC 公司，由山東農(nóng)業(yè)大學家禽腫瘤病實驗室保存；無特定病原（specific pathogen free，SPF）雞胚，購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。ALV-K 在DF-1 細胞上增殖后，按照Reed-Muench 法測定其細胞半數(shù)感染量（50%tissue culture infective dose，TCID50），結(jié)果為3.5×103TCID50/mL。

1.2 主要儀器及試劑

全自動化學發(fā)光免疫分析儀（規(guī)格型號Shinei1910），購自深圳迎凱生物科技有限公司；磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒，購自鄭州禾旭生物科技有限公司；Biotek Synergy H1 酶標儀（規(guī)格型號H1M），購自廣州達瑞生物技術(shù)股份有限公司；ALV ELISA 抗原檢測試劑盒，為國內(nèi)3 家試劑盒公司生產(chǎn)，根據(jù)企業(yè)要求分別編號為A、B、C；胎糞樣品稀釋液為無菌PBS；抗凝劑為肝素鈉。膠體金檢測試紙條，購自無錫某診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)。

1.3 SPF 雞胚病毒接種與樣品采集

將ALV-K 以500 TCID50/枚的劑量接種50 枚7 胚齡SPF 雞胚卵黃囊，另10 枚雞胚接種生理鹽水作為陰性對照；待雛雞出殼后進行編號，逐一采集胎糞以及無菌抗凝血；將胎糞與樣品稀釋液充分混勻置于冰盒，12 000 r/min 離心2 min 后，用規(guī)格為0.22 μm 的無菌濾器過濾，取100 μL 濾液接種至已長成單層的DF-1 細胞進行病毒分離，將培養(yǎng)7 d 后的細胞上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆?，剩余未接種的胎糞樣品凍存于-80 ℃?zhèn)溆?；將無菌抗凝血以3 000 r/min 離心3 min，取上層血漿接種DF-1 細胞進行病毒分離，同樣取培養(yǎng)7 d 后的細胞上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ALV-p27 抗原檢測

將3 種類型樣品（胎糞以及胎糞、血漿的病毒分離細胞培養(yǎng)上清）反復凍融3 次，恢復至室溫后，分別取100 μL 樣品進行ALV-p27 抗原檢測。以3 家公司ALV-p27 抗原ELISA 檢測試劑盒、磁微粒化學發(fā)光檢測試劑盒以及膠體金檢測試紙條對不同樣品進行檢測，具體操作按各試劑盒使用說明書進行。對于ELISA 檢測，使用Biotek Synergy H1 酶標儀讀數(shù)獲得樣品吸光度值（OD 值），再按照說明書計算方法得出樣品與陽性對照的比值（S/P）；對于磁微?；瘜W發(fā)光檢測，通過儀器顯示的樣品發(fā)光值計算S/P；對于膠體金檢測，參照說明書以顯色度深淺進行眼觀判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁微粒化學發(fā)光檢測試劑盒與ELISA 試劑盒檢測結(jié)果比較

接種ALV-K 后的SPF 雞胚共孵出雛雞22 只，磁微粒化學發(fā)光檢測試劑盒與3 家公司ELISA 試劑盒檢測結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：胎糞樣品及病毒分離細胞上清經(jīng)3 家公司ELISA 試劑盒檢測皆判定為陽性，但是讀值有所差異，大多數(shù)樣品經(jīng)A公司ELISA 試劑盒檢測OD 值過高，超出儀器范圍，為強陽性；同公司不同樣品對比，除個別樣品外，經(jīng)病毒分離后的細胞上清中ALV-K 含量更高。經(jīng)磁微粒化學發(fā)光檢測試劑盒檢測，胎糞及病毒分離細胞上清也均為陽性，與3 家公司ELISA 試劑盒檢測結(jié)果完全一致，但磁微粒化學發(fā)光檢測試劑盒檢測讀數(shù)更高，便于直觀判定結(jié)果。

表1 磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒與3 家公司ELISA 試劑盒檢測結(jié)果（S/P）對比

2.2 膠體金檢測試紙條與ELISA 試劑盒檢測結(jié)果比較

雞胚接種ALV-K 后孵出的22 只雛雞，其所有胎糞樣品、胎糞病毒分離細胞上清和血漿病毒分離細胞上清經(jīng)膠體金檢測試紙條檢測均為陽性，與3 家公司ELISA 試劑盒檢測結(jié)果完全一致（表2）。膠體金檢測試紙條僅可根據(jù)顯色情況做出定性判斷，無法顯示讀數(shù)差異。

表2 膠體金檢測試紙條與3 家公司ELISA 試劑盒檢測結(jié)果對比

2.3 陽性胎糞不同稀釋度樣品檢測結(jié)果對比

隨機抽取兩個陽性胎糞樣品，分別做5 個稀釋梯度（2-5～2-9），再分別用膠體金檢測試紙條、磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒和3 家公司ELISA 試劑盒進行檢測，結(jié)果見表3。當稀釋至2-8梯度時，3 家公司ELISA 試劑盒和磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒均可檢測出陽性，但稀釋至2-9梯度時結(jié)果出現(xiàn)差異。K1 陽性胎糞稀釋到2-9梯度時，磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒和A 公司ELISA 試劑盒均可檢測出陽性，而B 公司和C 公司ELISA 試劑盒檢測判定為陰性；K2 陽性胎糞稀釋到2-9梯度時，磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒和A、B 公司ELISA 試劑盒均可檢測出陽性，而C 公司ELISA 試劑盒檢測判定為陰性。膠體金檢測試紙條的靈敏度最低，在K1 和K2 陽性胎糞稀釋到2-8和2-9梯度時，均無法檢出。

表3 不同方法對胎糞稀釋樣品檢測結(jié)果對比

3 討論

ALV-K 是2012 年王鑫等[6]首次從我國地方品系雞中鑒定到的ALV 新亞群。經(jīng)推測，該病毒可能已在我國地方品系雞中長期定殖。ALV-K 作為最晚發(fā)現(xiàn)的新亞群，盡管其致病性弱于其他亞群，但是傳播范圍和傳播能力依然很強，尤其是在黃羽肉雞和地方品系雞中流行更為廣泛[18]，給養(yǎng)禽業(yè)造成了一定經(jīng)濟損失?？刂艫LV 傳播的最有效手段仍然是種源凈化，而靈敏特異的檢測技術(shù)是實現(xiàn)凈化的重要技術(shù)支撐。ALV 的群特異性抗原p27蛋白是檢測的常用抗原靶標[19]，目前可以通過不同方法檢測ALV-p27蛋白判定是否感染。長期以來，針對p27 抗原的ELISA 試劑盒一直是批量樣品檢測的首選，特別是在數(shù)量龐大的出殼雛雞胎糞檢測方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

此前，不同p27 抗原ELISA 試劑盒的對比主要是將不同滴度的ALV 接種細胞后取上清進行ELISA 檢測[20-21]，其優(yōu)點是樣品陰陽性結(jié)果明確，容易判定和比較靈敏度，缺點是樣品過于完美化，難以反映出胎糞、血漿等不同性質(zhì)樣品對于檢測的實際干擾。本研究通過7 胚齡SPF 雞胚經(jīng)卵黃囊接種ALV-K 建立垂直感染模型，以確定的ALV-K感染樣品構(gòu)建了檢測樣品盤。即待雛雞出殼后采集1 日齡胎糞、血漿接種DF-1 細胞進行病毒分離（病毒分離一般作為判定金標準），37 ℃溫箱培養(yǎng)7 d收取細胞上清，收集胎糞以及胎糞和抗凝血的病毒分離細胞上清形成檢測樣品盤，能夠相對較好地彌補單純細胞樣品評估方式的不足。本研究分別使用磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒、ELISA 試劑盒、膠體金檢測試紙條3 種方法檢測ALV-K。結(jié)果表明，磁微?；瘜W發(fā)光技術(shù)靈敏度更高，特異性更強，且操作簡單、耗時短，易于自動化，節(jié)省了人工成本。傳統(tǒng)ELISA 方法完成檢測約需3 h，且對加樣速度有要求，而磁微?；瘜W發(fā)光技術(shù)僅需0.5 h 即可得出結(jié)果。不同病毒載量陽性樣品的倍比稀釋試驗可以發(fā)現(xiàn)，磁微粒化學發(fā)光技術(shù)的靈敏度更高，減少了漏檢陽性雞帶來的損失，為AL 凈化提供了新的技術(shù)支持，有助于加速ALV-K 凈化。當然，本研究建立的檢測方法評估模型也有不足之處，如建立的陽性和陰性樣品盤均為SPF 雞樣品。需要強調(diào)的是，我國品質(zhì)繁多的各種品系雞中，內(nèi)源性ALV p27 蛋白表達規(guī)律非常復雜，比SPF 雞p27蛋白復雜得多。如果能夠在更多不同品系雞特別是地方品系雞中開展類似評估，將更加有助于科學評估不同檢測技術(shù)的靈敏度和特異性。

綜上，磁微?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒、ELISA檢測試劑盒和膠體金檢測試紙條檢測靈敏度存在一定差異，膠體金檢測試紙條靈敏度有限，磁微?；瘜W發(fā)光技術(shù)靈敏度優(yōu)勢明顯且易于判定，耗時更短，具備靈敏度和耗時短雙重優(yōu)勢。