杜 娟，劉亞輝，蘇玉賢

（1.開封市畜牧工作站，河南開封 475000；2.平頂山市畜牧發(fā)展中心，河南平頂山 467000）

副豬嗜血桿菌病也稱為格拉瑟?。℅lasser's disease），是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的豬細(xì)菌性傳染病，以關(guān)節(jié)炎、心包炎、多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和敗血癥為病理特征，臨床表現(xiàn)為體溫升高、呼吸困難、咳嗽、跛行、神經(jīng)失調(diào)等多種癥狀。HPS 是條件致病菌，通常定殖于上呼吸道，很少單獨引起發(fā)病，在豬體發(fā)生免疫抑制或環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致免疫力下降時，可與豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、鏈球菌等病原體發(fā)生混合感染，加重病情。HPS 在我國豬群中普遍存在，主要侵害4～8 周齡仔豬，引起的發(fā)病率為10%～15%，病死率可達(dá)50%以上[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。

HPS 血清型較多，按照Kieleein-Rapp-Gabriedson（KRG）瓊脂擴散方法分類至少有15 種，有約20%的菌株未能定型[2]。HPS 有明顯的區(qū)域性和時期性特征，不同時期、不同地區(qū)甚至同一個養(yǎng)殖場可能存在不同血清型菌株流行，且不同血清型菌株間致病力差異大，缺乏完全交叉免疫保護(hù)或者交叉免疫保護(hù)率低[3-4]。盡管疫苗接種是有效防控HPS 感染的主要手段，但是HPS 商品疫苗僅有2～3 種血清型，疫苗株與流行的致病菌株血清型難以匹配，因而免疫保護(hù)作用有限[5]。目前，臨床上使用抗生素是防治細(xì)菌性疫病不可或缺的重要措施。但是，HPS 易產(chǎn)生耐藥性，長期濫用抗生素導(dǎo)致HPS 耐藥性增強和新耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給防治該病帶來很大困難。因此，分離鑒定地方菌株，了解本地區(qū)HPS 流行菌株特點和開展耐藥性監(jiān)測可以提高疫苗免疫效果，減少藥物盲目使用，對有效防控該病流行具有指導(dǎo)意義。本研究于2022 年從河南省安陽市25 家豬場采集臨床疑似HPS 感染病死豬的肺臟、肝臟、心血等病料進(jìn)行HPS 分離鑒定，并進(jìn)行血清型分型、耐藥性檢測，以了解該地區(qū)豬場HPS 流行菌株血清型和耐藥情況，為今后疫苗研制和臨床藥物篩選提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2022 年1—12 月在河南省安陽市不同區(qū)域選擇25 家養(yǎng)豬場，無菌采集68 頭臨床疑似感染HPS病死仔豬和保育豬的肺臟、心血、關(guān)節(jié)液、腦、肝臟等組織病料，共175 份，其中肺臟47 份、腦組織44 份、肝臟18 份、心血19 份、關(guān)節(jié)液18 份、氣管29 份，每個采集部位計為1 份病料。病豬死前主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、關(guān)節(jié)腫大、站立不穩(wěn)、皮膚黏膜發(fā)紺，剖檢可見關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、肺炎和心包炎等病變。25 家豬場病料采集信息見表1。

表1 25 家豬場病料采集信息統(tǒng)計

1.2 主要試劑、菌株及試驗小鼠

胰蛋白大豆肉湯（TSB）、胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、5%綿羊鮮血瓊脂平板、犢牛血清，購自青島海博有限公司；細(xì)菌基因組 DNA 小量抽提試劑盒（離心柱式），購自上海碧云天生物有限公司；胸膜肺炎放線桿菌（ATCC27090）質(zhì)控菌株、16 種細(xì)菌藥敏紙片、微量生化鑒定管，購自杭州微生物試劑有限公司；ATCC25923 金黃色葡萄球菌、HPS 1～15 型單因子標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；DL 2000 DNA Marker、2×TaqMaster Mix、PCR試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒等，均購自天根生化科技（北京）有限公司；BALB/c 小鼠，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心。

圖1 分離菌菌落培養(yǎng)和鏡檢結(jié)果

1.3 病原菌分離培養(yǎng)

用接種環(huán)無菌挑取病料分別接種于TSA 培養(yǎng)基（含有犢牛血清和0.01% NAD），37 ℃培養(yǎng)24～36 h 后，挑取形態(tài)為光滑濕潤、無色透明、針尖大小的疑似HPS 菌落，再接種于TSA 培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代純化培養(yǎng)；挑取疑似HPS 菌落制作細(xì)菌涂片，革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)和染色；挑取上述純化培養(yǎng)菌落分別劃線接種于含犢牛血清、未含NAD 的TSA 培養(yǎng)基，未含犢牛血清、NAD 的TSA 培養(yǎng)基，置恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落形態(tài)和生長情況。

1.4 病原菌“衛(wèi)星生長”試驗

挑取純化培養(yǎng)的疑似HPS 菌落水平劃線接種于5%綿羊鮮血瓊脂平板，再垂直于上述水平劃線接種金黃色葡萄球菌，于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24～36 h，觀察是否有“衛(wèi)星生長”（即待檢菌落在靠近金黃色葡萄球菌處較多，越遠(yuǎn)菌落越少，直至不能生長[6]）和細(xì)菌溶血現(xiàn)象。

1.5 生化試驗鑒定

挑取純化培養(yǎng)的疑似HPS 菌落，分別接種于添加有2% NAD 和5%胎牛血清的葡萄糖、果糖、H2S 等微量生化鑒定試劑管，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～36 h 后進(jìn)行接觸酶、氧化酶試驗，按照說明書進(jìn)行操作并觀察試驗結(jié)果。

1.6 PCR 擴增鑒定

參考Oliveira 等[7]報道的方法設(shè)計合成HPS 16S rRNA 基因（GenBank 登錄號M75065）特異性擴增引物（上游引物HPS-F：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3'；下游引物HPS-R：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3'）。引物由深圳華大基因科技有限公司合成，預(yù)期擴增片段大小為821 bp。挑取TSA 培養(yǎng)基（添加有2%NAD 和5%犢牛血清）上的菌落，按照說明書利用基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株DNA，以提取純化的DNA 為模板用于PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系（25.0 μL）：細(xì)菌DNA 模板 2.0 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，加入滅菌超純水至25.0 μL。PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 min，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，共運行30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 擴增產(chǎn)物利用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在自動紫外凝膠成像儀下觀察拍照，記錄結(jié)果，同時設(shè)陰、陽性對照。擴增產(chǎn)物克隆、純化后，送深圳華大基因科技有限公司測序，用BLAST 軟件對測得的基因序列與GenBank 中公布的HPS 16S rRNA 序列進(jìn)行同源性比對分析。

圖2 部分分離菌株16S rRNA PCR 擴增電泳結(jié)果

1.7 分離菌株血清分型

采用文獻(xiàn)[8]中的免疫瓊脂擴散試驗方法進(jìn)行分離菌株血清型鑒定。

1.7.1 分離菌株分型抗原制備 取分離菌株接種于TSA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～36 h，再挑取菌落接種于TSA 培養(yǎng)基對分離菌進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)。用PBS（pH 7.2）緩沖液洗脫菌苔，將其裝入離心管中，12 000 r/min 離心2～3 min；棄掉上清液，加入9 倍于沉淀物體積的PBS（pH 7.2）緩沖液，混勻，121 ℃高壓處理1～2 h，12 000 r/min 離心2～3 min；收取上清液，即為分離菌株血清學(xué)分型抗原。

1.7.2 血清分型瓊脂擴散試驗 分別稱取0.85 g NaCL、1.00 g 瓊脂糖，加入PBS（pH 7.2）緩沖液100 mL，混勻加熱溶解，制成厚度約4 mm 的瓊脂平板，倒置于冰箱，4 ℃保存?zhèn)溆?。用打孔器在平板中央和周圍根?jù)需要打出孔間距3 mm、孔直徑4 mm 的圓孔，火焰封底。中央孔添加分離菌株分型抗原，周圍孔添加HPS 1～15 型單因子標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，37 ℃條件下，在濕盒中作用24～36 h，觀察判斷試驗結(jié)果。如果抗體孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰的白色沉淀線，則判分離菌為對應(yīng)的陽性血清型菌株，反之判為陰性菌株。

1.8 耐藥性試驗

對34 株分離菌采用K-B 紙片法進(jìn)行藥敏檢測。將分離菌株接種于含有0.01% NAD、5%犢牛血清的TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～24 h后，接種于生理鹽水，漩渦混勻，調(diào)整菌液濃度至0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，用滅菌棉簽蘸取菌液，均勻涂布于含?.01% NAD、5%犢牛血清的TSA 培養(yǎng)基上；用無菌鑷子分別夾取16 種細(xì)菌藥敏紙片均勻平貼于TSA 培養(yǎng)基上面，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24～36 h，測定每種藥敏紙片抑菌環(huán)直徑大小。由于美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)系會（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）中尚無HPS藥物敏感性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，而胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）與HPS 均為引起豬呼吸道病的病原菌，且親緣性較近，本次藥敏試驗采用CLSI（2015 版）規(guī)定的胸膜肺炎放線桿菌藥敏測定方法，以胸膜肺炎放線桿菌（ATCC27090）為質(zhì)控菌株，按照CLSI（2015 版）標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏試驗結(jié)果[9]，判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn) 單位：mm

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離培養(yǎng)

培養(yǎng)36 h 后觀察培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和生長情況，可見在TSA 培養(yǎng)基（含有犢牛血清和0.01%NAD）上產(chǎn)生針尖大小（直徑0.5～2 mm）、無色透明、光滑濕潤的菌落，而在添加犢牛血清、未添加NAD 的TSA 培養(yǎng)基和未添加犢牛血清和NAD的TSA 培養(yǎng)基上均無上述菌落生長。對單個菌落革蘭氏染色鏡檢，可見菌體為革蘭氏陰性菌，且呈細(xì)絲狀、長桿狀和球桿狀等不同形態(tài)。將34 株疑似HPS 菌落和金黃色葡萄球菌接種在5%綿羊鮮血平板上，均可見靠近金黃色葡萄球菌劃線兩側(cè)出現(xiàn)明顯的“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象，而遠(yuǎn)離劃線處菌落稀少或無菌落生長，且菌落不溶血。共從175 份病料中分離培養(yǎng)出34 株疑似HPS。菌落培養(yǎng)和鏡檢結(jié)果見圖1。

2.2 生化試驗

利用微量生化反應(yīng)鑒定管對34 株分離菌進(jìn)行生化試驗。結(jié)果顯示：所有分離菌株發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖生化反應(yīng)均為陽性，而對木糖、乳糖、甘露醇生化反應(yīng)結(jié)果不一致；對脲酶、H2S、吲哚、賴氨酸、苯丙氨酸、氧化酶生化反應(yīng)均為陰性，氧化酶、接觸酶試驗均為陽性。34 株分離菌株生化特性均符合標(biāo)準(zhǔn)HPS 的生化特性。生化試驗結(jié)果見表3。

表3 34 株分離菌生化試驗結(jié)果

2.3 分離菌PCR 鑒定

以分離株DNA 為模板，利用HPS 的16S rRNA 基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴增，將產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR 鑒定結(jié)果顯示：對所有分離菌株16S rRNA 基因PCR 擴增，均獲得大小為821 bp 的目的條帶，與預(yù)期目的條帶相吻合。經(jīng)BLSA 比對，測得序列與GenBank 中公布的HPS 16S rRNA 序列同源性在97%以上。結(jié)合分離菌株分離培養(yǎng)、鏡檢、生化特性試驗及PCR鑒定結(jié)果，綜合判定34 株分離菌株均為HPS，檢出率為19.43%（34/175）。PCR 電泳檢測結(jié)果見圖2。

2.4 血清學(xué)分型鑒定

采用免疫瓊脂擴散方法，對34 株HPS 分離菌株進(jìn)行血清學(xué)分型鑒定試驗。結(jié)果顯示：分離率最高的是血清4 型14 株，占41.18%；血清5 型4 株，占11.76%；血清6 型3 株，占8.82%；血清13 型8 株，占23.53%；未定血清型5 株，占14.71%。分型菌株占菌株總數(shù)的85.29%。結(jié)果表明，河南省安陽市存在HPS 血清4、5、6 和13 型流行，其中血清4 型為優(yōu)勢血清型。25 家豬場分離菌株數(shù)量及血清型分布情況見表4。

表4 25 家豬場分離菌株數(shù)量及血清型分布情況

2.5 耐藥性檢測

采用K-B 紙片法對臨床分離鑒定的34 株HPS進(jìn)行藥敏試驗，并根據(jù)CLSI M100—S25 標(biāo)準(zhǔn)判斷。結(jié)果（表5～6）顯示：分離的HPS 菌株對16 種抗生素的耐藥性差異較大。對阿莫西林、青霉素G、鏈霉素、土霉素4 種抗生素耐藥性最高，耐藥率為88.24%～94.12%；對林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、大觀霉素、阿奇霉素等7 種抗生素耐藥性相對較低，耐藥率為47.06%～73.53%；對頭孢噻呋、頭孢氨芐、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、替米考星5 種抗生素耐藥性最低，耐藥率為8.82%～20.59%。34 株HPS分離菌株多重耐藥性較嚴(yán)重，對5 種以上抗生素產(chǎn)生了耐藥性，最多的為12 種。其中，耐9 種抗生素菌株最多，占菌株總數(shù)的29.41%。結(jié)果表明，河南省安陽市流行的HPS 菌株耐藥性較嚴(yán)重。

表5 34 株HPS 分離株耐藥性檢測結(jié)果

表6 HPS 分離株多重耐藥檢測結(jié)果

不同血清型中，除血清4 型對頭孢氨芐，5 型對頭孢氨芐、諾氟沙星、環(huán)丙沙星，6 型對頭孢噻呋、林可霉素，13 型對頭孢噻呋、環(huán)丙沙星，未定型對替米考星沒有產(chǎn)生耐藥性外，分離的4 種HPS血清型菌株對多種抗生素存在不同程度的耐藥性，其中血清4 型不但耐藥菌株數(shù)最多，對15 種抗生素的耐藥性也較高（表7）。

表7 不同血清型HPS 菌株對16 抗生素的耐藥性檢測結(jié)果 單位：%

3 討論

本研究收集河南省安陽市25 家養(yǎng)豬場疑似感染HPS 病死豬的肺臟、心血等175 份組織病料，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察、生化試驗、PCR 鑒定等方法，分離出34 株HPS，檢出率為19.43%。該結(jié)果低于王翠等[10]對豫北地區(qū)和王慶云[11]對河南省安陽市豬場HPS 鑒定的結(jié)果。HPS培養(yǎng)條件要求較高，分離難度大，病料樣本數(shù)量、采集時間、部位和分離培養(yǎng)等因素都會影響調(diào)查結(jié)果，此外不同地區(qū)豬場的飼養(yǎng)環(huán)境和管理水平也與調(diào)查結(jié)果密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示，河南省安陽市豬場存在一定程度的HPS 感染。因HPS 為條件致病菌，會在外部環(huán)境和飼養(yǎng)管理發(fā)生變化時導(dǎo)致感染豬群發(fā)病，且常與其他病原發(fā)生混合感染。因此，對于該病應(yīng)開展常態(tài)化監(jiān)測，加強綜合防控，避免疫病暴發(fā)流行。

HPS 血清型較多，國內(nèi)不同地區(qū)流行的血清型差異性較大，因此明確本地區(qū)HPS 血清型對本病防控具有非常重要意義。張青嫻等[12]報道，2017—2018 年在河南省46 株HPS 菌株中，共檢測出7 種血清型（2、4、5/12、6、7、11、13），其中血清型5/12 和4 型為優(yōu)勢血清型；李新果等[4]從2017—2018 年采自河南省不同地區(qū)的45份疑似病料中，分離鑒定出12 株HPS，血清型包括1、2、4、5、7、13 型；徐引弟等[13]報道，河南省流行的主要血清型包括4、5、7、13 型；郭龍等[14]2017 年對全國20 個省市疑似HPS 感染的樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR 鑒定分型，發(fā)現(xiàn)我國規(guī)?；i場中主要流行的血清型為4、5/12 和14 型。本研究結(jié)果顯示，河南省安陽市流行的HPS 血清型為4、5、6 和13，其中血清4 型為優(yōu)勢血清型，與上述學(xué)者報道基本一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在25 家豬場中有9 家豬場分離出2 種血清型HPS 菌株，其中4 家豬場的菌株來自不同的病料組織。從175 份病料組織的HPS 分離菌株數(shù)量看，有20 株來自肺臟，占比最高，分離率為42.55%（20/47），其次是關(guān)節(jié)液16.67%（3/18）、心血15.79%（3/19）、氣管10.34%（3/29）、腦9.09%（4/44）、肝臟5.56%（1/18）。該結(jié)果與丁文文等[15]研究報道的發(fā)病豬不同組織器官分離的HPS 結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果表明，HPS 最易導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)感染，主要存在肺部，也可以進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)造成全身性感染。不同血清型HPS 菌株的致病性也不同，其中血清1、5、10、12、13、14 型為高毒力菌株，2、4、5 型為中等毒力菌株，其他血清型為無毒力[16]。本研究表明，該地區(qū)流行的血清型較多，至少4 種，且主要為中等毒力和高毒力菌株。

養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素對HPS 形成持續(xù)的藥物選擇壓力，造成其耐藥性逐漸增強，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。通過分離菌耐藥性檢測了解豬場HPS 對常見抗生素的耐藥情況，可以為臨床用藥提供指導(dǎo)。本研究采用K-B 紙片法進(jìn)行34 株HPS 對16 種抗生素耐藥性試驗發(fā)現(xiàn)：分離菌株對阿莫西林、青霉素G、鏈霉素、土霉素耐藥性4 種抗生素耐藥率較高；多重耐藥性比較嚴(yán)重，介于5～12 種，耐9 種抗生素菌株最多，占菌株總數(shù)的29.41%。與其他學(xué)者對HPS 耐藥性研究報道的結(jié)果[17]有所不同，這是因為細(xì)菌耐藥性形成機制復(fù)雜，菌株耐藥性與耐藥基因攜帶、傳播，以及細(xì)菌結(jié)構(gòu)特性、地區(qū)環(huán)境及抗生素使用等諸多因素密切相關(guān)。

HPS 感染是豬場常見的呼吸道疫病，流行于世界各地養(yǎng)豬場，也是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的典型細(xì)菌性疫病之一，且隨著豬場規(guī)?；粩喟l(fā)展，呈現(xiàn)地方流行性散發(fā)態(tài)勢。HPS 是存在于正常健康豬群體內(nèi)上呼吸道的共生菌和條件菌，如果豬體發(fā)生免疫抑制，導(dǎo)致免疫力下降，就會出現(xiàn)臨床癥狀，也可引起全身性感染，在肺部、肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等部位能檢測出HPS。HPS 常作為繼發(fā)性病原菌，在感染圓環(huán)病毒2 型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、流感病毒和偽狂犬病病毒等病原后導(dǎo)致豬群發(fā)病，也通常與巴氏桿菌、放線桿菌和鏈球菌等混合感染豬群，使豬病情復(fù)雜，診斷和防治難度增大。因此，病原的分離鑒定、敏感藥物篩選是控制本病的重要前提。同時，要強化豬群日常管理，尤其是斷奶豬和保育豬，應(yīng)給豬群提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)均衡的日糧，提高豬體免疫力；積極實施疫苗免疫接種，盡量保持疫苗株和流行株一致。臨床治療用藥要結(jié)合藥敏檢測分析結(jié)果，篩選敏感性藥物，輪換交替用藥，以減少HPS 耐藥性。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)：河南省安陽市豬場存在一定程度的HPS 流行；流行菌株血清型主要為4、5、6和13 型，其中血清4 型為優(yōu)勢血清型；流行菌株存在較高的耐藥性，且多重耐藥較嚴(yán)重。因此，當(dāng)?shù)貞?yīng)加強對HPS 感染的綜合防治，合理使用抗生素。