吉哲慧，李 清，蔣 明，孫艷紅，陸 星，陳 見，李 佩，魏輝杰，李明光，王貴英

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，武漢 430207；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，武漢 430207)

雜交鲌(國審水產(chǎn)新品種名稱：雜交鲌“先鋒1號”)是以經(jīng)選育的丹江口水庫翹嘴鲌(Erythroculterilishaeformis，♀)與長江上游黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda，♂)通過屬間雜交的子代，其具有生長速度快，飼料最適蛋白質(zhì)含量低、飼料成本低，肉質(zhì)好，抗應(yīng)激、性情溫順、起捕率高，易活魚上市等優(yōu)良特點[1,2]，已經(jīng)成為我國鲌類養(yǎng)殖新品種。當(dāng)前對雜交鲌營養(yǎng)消化生理的研究還較為缺乏，對其食性也還存在不同的爭議。

消化系統(tǒng)是魚類消化食物和吸收營養(yǎng)的生理結(jié)構(gòu)[3]。目前，國內(nèi)外已有一些關(guān)于魚類消化道形態(tài)解剖和組織結(jié)構(gòu)的研究報道[4,5]，通過對魚體消化器官形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、組織化學(xué)等進行探索研究，有助于深入了解魚類對攝食餌料的選擇、分解、消化和吸收的內(nèi)在機制[6,7]，還可以為人工餌料開發(fā)[8-9]及苗種培育技術(shù)提供理論依據(jù)[10-11]。硬骨魚類的消化道結(jié)構(gòu)與其營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收特點相適應(yīng)，與食性具有極高的相關(guān)性，且不同魚種間存在差異。因此，本研究通過掃描電鏡技術(shù)、石蠟包埋切片及HE染色等方法，對雜交鲌消化道全長及其各消化器官的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等進行分析，旨在查明雜交鲌消化道形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征，為其營養(yǎng)生理學(xué)研究以及人工養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和科學(xué)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用雜交鲌來源于武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，體質(zhì)量為(192.04±40.45) g。樣品采集前，魚體饑餓24 h。

1.2 樣品采集及處理

采用80 mg/L MS 222將31尾雜交鲌麻醉，用2 mL注射器抽取尾靜脈血樣置于1.5 mL離心管中，4 ℃下靜置4 h后以3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存用于血清生化指標(biāo)測定。對樣本外部形態(tài)包括全長、體長、頭長、吻長、口咽腔長、口裂長和寬進行測量統(tǒng)計。然后自肛門沿腹中線縱剪至下頜，向左側(cè)背方橫剪至椎體附近，再向前縱剪至鰓蓋后部；取下左側(cè)體壁并剪去左側(cè)鰓蓋骨，打開魚體腔和口咽腔，對其消化系統(tǒng)中各組織進行拍照并測量食道和消化道長度，記錄鰓耙數(shù)目和咽齒數(shù)目。另取各段消化道組織用4%多聚甲醛固定。

組織HE染色切片的制作：取唇、口咽腔、食道、腸(前、中、后)、肝胰臟、膽囊組織，分別固定于多聚甲醛溶液，固定時間24 h，組織固定后用70%乙醇清洗多余的多聚甲醛溶液，再保存于70%乙醇中備用。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，連續(xù)石蠟切片，切片厚度為5～7 μm，HE染色，中性膠封片，Olympus顯微鏡下觀察拍照。

掃描電鏡切片的制作：取前、中、后腸部分，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定，之后酒精梯度濃度脫水，真空冷凍干燥、鍍金后，于HITACHI Regulus 8100 型掃描電鏡下觀察并拍攝。

1.3 數(shù)據(jù)處理

消化道組織學(xué)特征包括黏膜褶數(shù)量、黏膜褶高度、黏膜褶寬度、肌層厚度測量；隨機選取7張切片，每張切片隨機選取5個視野用Image pro plus 6.0軟件進行測量。杯狀細胞密度：分別計數(shù)每一視野中(50×50) μm2范圍內(nèi)粘液細胞的總數(shù)，作為粘液細胞的密度。

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計差異分析(SPSS Chicago IL，USA)。將所有數(shù)據(jù)分組后，進行單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)組間差異顯著(P<0.05)時，采用Tukey檢驗比較不同處理間的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交鲌外部形態(tài)學(xué)和消化系統(tǒng)生物學(xué)性狀

雜交鲌生物學(xué)性狀的相關(guān)參數(shù)見表1；表2列出了雜交鲌消化系統(tǒng)生物學(xué)性狀的相關(guān)指標(biāo)。

表1 雜交鲌外部形態(tài)學(xué)測量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=31)Tab.1 External morphological measurement of the hybrid culter(Mean ± SEM，n=31)

表2 雜交鲌消化道生物學(xué)性狀的測量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=31)Tab.2 Measurement of biological traits in the digestive indexes of hybrid culter(Mean±SEM，n=31)

2.2 消化系統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征

雜交鲌消化系統(tǒng)由消化道及其所粘附的各種消化腺組成，主要包括口、咽、食道、腸、肛門、肝胰臟和膽囊。其腹腔內(nèi)有大量脂肪堆積，大部分消化道被脂肪覆蓋(圖1-1)。

口：雜交鲌口位屬亞上位，口裂較大，無須。

口咽腔(圖1-2)：雜交鲌口腔和咽腔無明顯分界，上下頜之間關(guān)節(jié)靈活，口腹面可觀察到骨間有褶疊的皮膜，口可張開較大并向前伸出成管狀，口腔容積較大?？谇粌?nèi)上下皮層光滑，有色素分布，無顎褶。舌不明顯，僅基舌骨稍突出，結(jié)締組織和口腔黏膜稍增厚?？谇豁敱谟袃商幇咨琴|(zhì)凸起。上下顎均無牙齒，有五對鰓弓，鰓耙粗短而疏但很尖，鰓耙數(shù)約 13～14枚，第五鰓弓內(nèi)側(cè)具有咽齒；口咽腔與腹腔之間由一層薄膜隔開。

食道：雜交鲌食道直而粗短，管壁厚而具有彈性，是連接咽與腸的管道；食道背壁有肌肉層與體壁相連，內(nèi)壁有縱行黏膜褶，末端與腸連接處有一環(huán)形括約肌，當(dāng)吞咽食物時可借黏膜褶擴大或縮小食道的孔徑。

腸(圖1-3)：腸道呈z字形盤于腹腔中，以折疊位置為節(jié)點可將腸道大致分為三部分：前腸、中腸、后腸。通過掃描電鏡觀察(圖2所示)，雜交鲌腸道黏膜縱向隆起，形成黏膜初褶，其表面分布有大量次級黏膜褶。腸道粘膜表面有很多呈洞穴狀的分泌小孔(SP)和一些分泌的蛋白顆粒(P)。前腸的分泌小孔較少，表面上皮細胞形態(tài)邊界不明顯，微絨毛(MV)長度也較短，整體比較平整。中腸整體結(jié)構(gòu)與前腸相似，表面上皮細胞(EC)呈多邊形，細胞邊界不明顯，但分泌小孔大而多，微絨毛較長。后腸黏膜的表面上皮細胞呈現(xiàn)出明顯的多邊形態(tài)，分泌小孔小而密集，微絨毛短而粗。

圖1 雜交鲌解剖觀察圖Fig.1 Anatomical observation of hybrid culter1：全魚解剖圖；2：口咽腔解剖圖；3：腹腔解剖圖；SN：吻部；M：系膜；LP：脂肪；UO：口腔上顎；DO：口腔下顎；GB：膽囊；L：肝臟；G：腸；LP：脂肪；A：肛門。

圖2 雜交鲌前腸、中腸、后腸掃描電鏡圖Fig.2 Hybrid culter foregut，midgut，and hindgut scanning electron microscopy1、4、7、10：前腸；2、5、8、11：中腸；3、6、9、12：后腸；MF：黏膜褶；SMF：次級黏膜褶；P：蛋白顆粒；SP：分泌小孔；EC：上皮細胞；MV：微絨毛。

肝臟：雜交鲌肝臟呈淡紅色，位于腹腔前端，由腹腔隔膜將其與頭部隔開。肝臟借少數(shù)系膜連接并覆蓋住整個食道與部分前腸，半側(cè)游離于腹腔內(nèi)。膽囊緊貼其肝腹面右側(cè)，呈金綠色橢球狀裸露結(jié)構(gòu)，外觀上無明顯獨立的胰臟結(jié)構(gòu)。

2.3 消化系統(tǒng)組織學(xué)特征

圖3為雜交鲌消化系統(tǒng)的HE染色切片，各部位組織結(jié)構(gòu)特征如下。

唇(圖3，1)：由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成，細胞排列緊密、整齊、圓形細胞核在細胞中央；有部分色素沉著。

口咽腔(圖3，3-5)：口腔內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)可分為漿膜、肌層和黏膜層。最外層有一層角化細胞。口腔內(nèi)分布有味蕾，較多粘液細胞。咽部固有膜基部也可見味蕾結(jié)構(gòu)(圖3，5)；肌層比口腔內(nèi)更厚，肌纖維排列較為緊密，也為橫紋??；漿膜層稍發(fā)達，分布大量粘液細胞。肌層中都為橫紋肌，黏膜層由復(fù)扁平上皮細胞構(gòu)成。

食道(圖3，6)：其壁由內(nèi)向外分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜。黏膜上皮為復(fù)層鱗狀上皮，上皮細胞間夾有大量杯狀細胞，固有層向內(nèi)凸起，形成褶皺；肌層較發(fā)達，由骨骼肌構(gòu)成，可分為內(nèi)部縱肌層和外部環(huán)肌層，外部環(huán)肌層較內(nèi)縱基層厚；最外層為漿膜，由結(jié)締纖維細胞及單層扁平上皮細胞組成。食道內(nèi)粘液細胞的密度顯著高于前腸、中腸和后腸(表3)。

表3 雜交鲌食道和前、中、后腸形態(tài)學(xué)特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=31)Tab.3 Morphological features of the esophagus and anterior，middle and posterior intestines of the hybrid culter(Mean ± SEM，n=31)

腸道(圖3，7-12、15)：腸道組織同樣由粘膜層、粘膜下層、肌肉層和漿膜層構(gòu)成。粘膜層向管腔內(nèi)伸出形成豐富的褶皺；肌層可分為內(nèi)部環(huán)肌層和外部縱肌層。前腸、中腸和后腸結(jié)構(gòu)相似但數(shù)量不同。在黏膜褶最外層的上皮細胞間有大量的杯狀細胞，它們在皺褶頂部、中部與基部均有分布，形狀有梨形、圓形與橢圓形等，染色多呈空泡狀且靠近表層。

從食道、前腸、中腸到后腸其管腔直徑和肌層厚度均呈依次降低的變化趨勢；褶皺長度和褶皺寬度也逐漸減小。

肝臟(圖3，14、16)：HE切片顯示20倍鏡下可觀察到肝小葉，但邊緣不清晰，組織中的中央靜脈及分布大量毛細血管，細胞核位于細胞中央；40倍鏡下觀察到一些彌散的胰腺細胞。

膽囊(圖3，13)：HE切片顯示20倍鏡下可觀察到多個管狀腺結(jié)構(gòu)。

肛門(圖3，2)：肛門處呈近似圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，周圍肌肉發(fā)達，由較厚的內(nèi)部縱肌和外部環(huán)肌構(gòu)成。

3 討論

3.1 消化系統(tǒng)形態(tài)組織結(jié)構(gòu)與攝食的關(guān)系

魚類對物質(zhì)消化吸收能力的強弱與其消化道表面結(jié)構(gòu)特征以及腸腺的分泌能力有關(guān)[12]。粘液細胞會分泌不同的物質(zhì)導(dǎo)致其在HE染色后呈現(xiàn)不同形態(tài)[13]。根據(jù)目前國內(nèi)外對魚類消化道粘液細胞的分類研究[13-15]，可將本研究中雜交鲌消化道內(nèi)觀察到的粘液細胞分為三種類型：Ⅰ型細胞HE染色后呈顏色較淺的橢圓形空泡狀；Ⅱ型粘液細胞個體較大，在HE染色狀態(tài)下呈顏色較淺的杯狀空泡；Ⅲ型粘液細胞在HE染色狀態(tài)下其分泌的顆粒物質(zhì)著色較深?？谘是皇鞘澄镞\輸?shù)闹匾ǖ?，是消化系統(tǒng)與環(huán)境接觸的第一通道。雜交鲌口、咽部有味蕾結(jié)構(gòu)和大量粘液細胞，這表明雜交鲌可以對攝入進腸道消化的食物進行選擇和鑒別[16-17]。在口、咽部大部分為Ⅰ類粘液細胞，它可以與上皮細胞一起分泌中性黏液物質(zhì)[18]起到潤滑作用，此外口、咽部的上皮細胞還能分泌含硫糖蛋白和唾液酸糖蛋白以增加分泌物的粘性[19]，更大程度保護了消化道黏膜免受機械損傷和細菌感染[20]。雜交鲌食道中的I型粘液細胞的數(shù)量遠遠多于腸道，這大大增加了食道內(nèi)的潤滑程度。此外食道內(nèi)壁有很多縱行黏膜褶，當(dāng)吞咽食物時，可以借助這些縱行黏膜褶擴大或縮小食道內(nèi)徑，使食物快速通過。食道肌層厚度也遠遠高于腸道，這不僅極大地避免了攝入物帶來的機械損傷，還能增強食道蠕動幫助吞咽[21]。當(dāng)咽部和食道前端的味蕾感覺有異時，食道發(fā)達的外部環(huán)肌可以有力收縮將異物拋出口外。最后通過環(huán)肌的波狀收縮，可以將食物與黏液充分混合并將初步擠壓形成的食靡推向腸道深處。

圖3 雜交鲌消化道HE染色切片圖Fig.3 Hybrid culter gastrointestinal HE slice

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位，腸道的絨毛長度、黏膜厚度及肌層厚度是衡量腸道消化吸收功能的重要指標(biāo)[22-23]。有研究表明，腸黏膜厚度和腸肌層厚度會影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運過程[24]，與腸道的節(jié)律性收縮運動和食糜的機械消化效率也密切相關(guān)[25]。相比于食道，雜交鲌腸道的肌層厚度顯著下降，這減緩了食靡向腸道深處移動的速度，增加了消化吸收的時間。前腸中Ⅱ類粘液細胞較多。這些夾在上皮細胞之間，開口于絨毛表面的粘液細胞具有分泌潤滑液、吸收轉(zhuǎn)運大分子、輔酶因子、抵御外來致病因子等作用[20]，其分泌的粘液還可以使上皮細胞免受一些消化酶的破壞[6]。另外由固有層向內(nèi)凸起形成的黏膜褶可以增加腸道對食物的消化、吸收接觸表面積，從而增強對食物的消化、吸收能力[26]。不同魚類的絨毛形態(tài)變化較大，絨毛長度一般由前向后逐漸降低[27]。前腸部分的黏膜褶高度顯著大于中腸和后腸，黏膜褶數(shù)量也較多，這表明雜交鲌的前腸可能是消化吸收的主要場所，中腸和后腸黏膜褶數(shù)量雖有所降低但也有一定的消化和吸收能力。黏膜褶最外層是一層上皮細胞，上皮細胞游離面的細胞膜和細胞質(zhì)深處的微細指狀突起形成了微絨毛，可增加吸收面積15～20倍[28]。這些微絨毛在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收中起重要作用。相比前腸和后腸，電鏡下中腸的分泌孔大而密，微絨毛沿分泌孔伸出，與其消化酶的分泌與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有密切聯(lián)系。后腸黏膜上皮存在大量的黏液細胞，且肌層占比率逐漸增大[29]，可便于食物殘渣的排出[19]和對水分及鹽分的吸收[30]。

3.2 消化道系數(shù)與食性的關(guān)系

腸道系數(shù)作為一個重要的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，已經(jīng)被廣泛用于劃分魚類的營養(yǎng)類型。魚類腸道的長短一般與其攝取食物的易消化程度相關(guān)[31]。一般來說，肉食性或者掠食性魚類腸道系數(shù)值低，而雜食性魚類則為中間數(shù)值，草食性魚類腸道系數(shù)最高[32]。有研究指出，肉食性金頭鯛(Sparusaurata)腸道系數(shù)為0.5～0.6，哲羅魚(Huchotaimen)、鲇(Silurusasotus)兩種肉食性魚類腸道系數(shù)分別為0.47和0.78，雜食性的小口脂鯉科魚類(Leporinusfriderici和L.taeniofasciatus)腸道系數(shù)分別為1.25和1.14[13]。雜交鲌腸道系數(shù)為0.94±0.09，比腸重為0.98±0.14，符合雜食性偏肉食性魚類特征。另外，根據(jù)目前大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)肉食性魚類口腔長/頭長的比值一般大于雜食性、草食性和濾食性魚類[33-34]。本研究中雜交鲌口咽腔長/頭長比值為0.21±0.05，與雜食性魚類比值接近。

4 結(jié)論

基于腸道系數(shù)和口咽腔長/頭長的值，可判定雜交鲌屬于雜食性魚類。雜交鲌的腸道分為三段，前腸，中腸和后腸的組織結(jié)構(gòu)存在一定差異。前腸是營養(yǎng)吸收的主要部位，中腸內(nèi)食靡進一步分解，后腸吸收營養(yǎng)成分的能力減弱。