夏雪平，連子童，田海峰，李 忠，孫敬鋒，胡喬木

(1.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

黃鱔(Monopterusalbus)，屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)輻鰭亞綱(Actinopterygii)合鰓目(Synbranchiformes)合鰓科(Symbranchidae)黃鱔屬(Monopterus)，是我國重要淡水特色養(yǎng)殖魚類之一。黃鱔因其肉質(zhì)滑嫩，含有豐富的蛋白質(zhì)，而且脂肪含量較低，具有較高的藥用價值，深受國內(nèi)外廣大消費者喜愛。但是近年來，由于棲息環(huán)境的破壞和人類的過度捕撈，野生黃鱔的數(shù)量越來越少，為了滿足人們對于黃鱔的需要，黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和黃鱔人工繁殖技術(shù)的日漸成熟。黃鱔屬于雌雄同體魚類，具有典型的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[1]。由于黃鱔具有性逆轉(zhuǎn)的特點，其生殖性腺發(fā)育模式為：雌性發(fā)育階段到間性發(fā)育階段到最終的雄性發(fā)育階段，并且性腺的這一發(fā)育過程是單方向進行的不可逆的，即發(fā)生性變化后不再由雄性個體逆返為雌性個體[2]，這意味著性成熟的雌性黃鱔個體數(shù)量無法維持在一穩(wěn)定范圍內(nèi)，在一定程度上制約了我國黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，探究黃鱔性逆轉(zhuǎn)機制不僅具有非常重要的經(jīng)濟意義，還能豐富魚類性別調(diào)控機制[3]。

生物體內(nèi)存在兩種不同的RNA，一種是具備編碼蛋白質(zhì)能力的編碼RNA，即信使RNA(message RNA，mRNA)；一種是不具備編碼蛋白質(zhì)能力的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)[4]。在ncRNA中，一般認(rèn)為長度大于200核苷酸稱為長鏈非編碼RNA(Long non-codingRNA，LncRNA)。根據(jù)LncRNA與蛋白質(zhì)編碼基因的位置關(guān)系，可以分為5類，分別是：a．正義；b．反義；c．雙向；d．內(nèi)含子；e．基因間隔區(qū)[5]。LncRNA的作用機制非常眾多且復(fù)雜，涉及表觀遺傳學(xué)調(diào)控、性別分化、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運輸和染色體重塑，參與細(xì)胞分化、生長發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)和疾病發(fā)生發(fā)展等多個方面[6]。黑龍江鱘(Acipenserschrencki)精巢與卵巢的LncRNA研究中發(fā)現(xiàn)多條LncRNA靶向多個與性腺發(fā)育和配子發(fā)生相關(guān)的基因[8]。在中華鱉(Trionyxsinensis)的精巢與卵巢的LncRNA研究中，發(fā)現(xiàn)多條LncRNA靶基因，包括dmrt1、sox9、cyp19a、sox3等與性別分化相關(guān)的基因[9]。王偉佳等[7]在大黃魚(Larimichthyscrocea)性腺中挖掘到了3 984個基因位點的5 162條LncRNA，2 782個LncRNA在精巢與卵巢中差異表達(dá)高度相關(guān)的LncRNA-mRNA 1 227對，并在精巢中發(fā)現(xiàn)了多條與雄性性別決定和性腺發(fā)育相關(guān)基因的LncRNA，說明大黃魚的性別決定及性腺發(fā)育和分化也受到LncRNA的調(diào)控。LncRNA在魚類性別決定和分化調(diào)控中發(fā)揮著復(fù)雜且重要作用，這也一直是水產(chǎn)動物性別分化研究的熱點之一。本研究通過對黃鱔卵巢、間性性腺、精巢的組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到一條在黃鱔性腺不同發(fā)育時期差異表達(dá)的LncRNA 54770.30，通過生物信息學(xué)軟件分析其生物學(xué)特性，比較分析LncRNA 54770.30在不同組織和不同階段性腺組織表達(dá)水平，并定位其在不同階段性腺的表達(dá)位置，探究LncRNA 54770.30與黃鱔性逆轉(zhuǎn)的相關(guān)性，以期為揭示LncRNA在黃鱔性逆轉(zhuǎn)機制的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及制備

實驗用魚均采自湖北省仙桃市忠善合作社養(yǎng)殖基地，取不同時期的健康黃鱔共100尾，另取健康的60日齡黃鱔160尾，均充氧分箱暫養(yǎng)于長江水產(chǎn)研究所的活體養(yǎng)殖室內(nèi)。采集3組不同發(fā)育時期黃鱔的性腺、心、肝、脾、腎、腦、胃、腸、肌肉和皮膚等組織，投入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存用于提取RNA。采集雌性、間性、雄性發(fā)育時期黃鱔性腺組織各3組，每組各兩份，一份保存于RNA store Reagent中用于RNA提?。涣硪环荼４嬗?%的多聚甲醛(pH 7.5)用于制作組織切片，進行后續(xù)組織學(xué)鑒定及原位雜交實驗。

1.2 甲基睪酮刺激處理

將160尾60日齡的黃鱔隨機等量分為A、B、C和D 4組，在相同室溫環(huán)境下分別飼養(yǎng)于容積約為20 L的塑料箱中，每箱注入曝氣自來水約6 L，其中A、B和C 3組為實驗組，將17α-甲基睪酮(17-Methyltestosterone，MT)用無水乙醇溶解至500、1 000和1 500 μg/L的濃度，早晚向?qū)嶒灲M水箱中分別注入不同濃度的MT 400 μL至終濃度分別為100、200和300 μg/L；D組為對照組注入等量的無水乙醇，每日換水一次，1～2 d喂食等量紅蟲漿一次。兩月后采集性腺樣品分別保存于RNA store Reagent與4%多聚甲醛(pH=7.5)中，用于RNA提取、制作石蠟組織切片、HE染色。通過顯微鏡觀察性腺組織形態(tài)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)選取有明顯退化的性腺樣品，用干提取性腺組織RNA。

1.3 黃鱔總RNA提取與cDNA合成

將樣品從-80 ℃冰箱中取出置于預(yù)冷的研缽中研磨至粉末狀，取約0.1 g的各樣品組織于1 mL TRIzol中，使用TRIzol(Invitrogen)法提取各組織中的總RNA。1.5%瓊脂凝膠電泳測定RNA完整性，用NanoPhotometer-NP60測定其濃度和純度。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa)說明書合成cDNA，存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 熒光定量PCR

根據(jù)前期對黃鱔不同發(fā)育階段性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得LncRNA 54770.30序列，利用Primer 5軟件設(shè)計特異性引物(表1)，選EF-1α作內(nèi)參基因，cDNA作模板，每個組織3個樣本，每個反應(yīng)3個重復(fù)。遵照2×T5 Fast qPCR Mix(Vazyme)的使用說明，配成10 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)在Quant Studio 5實時定量PCR系統(tǒng)上進行，2-△△CT法計算相對表達(dá)量；所得數(shù)據(jù)在統(tǒng)計軟件SPSS 26.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan′s法多重比較分析，當(dāng)P<0.05差異顯著，用*表示；多重比較中，用不同字母表示差異顯著性。

表1 引物信息Tab.1 Primers used in this study

1.5 組織切片原位雜交

以LncRNA54770.30序列設(shè)計原位雜交引物(表1)，通過PCR技術(shù)對探針片段進行擴增，按膠回收試劑盒(QIAGEN)說明書，對擴增產(chǎn)物進行膠回收，檢測DNA片段完整性與濃度，通過T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific)制備探針。選取雌性階段、間性階段和雄性階段黃鱔性腺切片各兩組，首先使用二甲苯溶液進行3次時長為5 min的脫蠟反應(yīng)，然后將切片置于不同濃度的乙醇(100%，100%，95%，70%，50%)依次浸洗5 min；將脫蠟后的切片置于4% PFA-PBS中固定10 min；PBS洗滌3次后用0.2 mol/L的HCl處理10 min；PBST洗滌3次后用10 μg/mL蛋白酶K消化處理。加入預(yù)雜交液(含tRNA、肝素)，70 ℃預(yù)雜交2～5 h；加入預(yù)雜交液(含反義RNA探針100～200 ng)，70 ℃過夜；50%預(yù)雜交液(無tRNA和肝素)+50% 2×SSC，70 ℃，15 min；2×SSC，70 ℃，2×30 min；0.2×SSC，70 ℃，2×30 min；1×MAB(100 mmol/L馬來酸，150 mmol/L NaCl，pH7.5)室溫5 min。室溫用Blocking Buffer(10%山羊血清，2%BMB，1×MAB)封閉4 h?？贵w雜交：加Blocking Buffer 1 000倍稀釋的抗體(Roche Applied Science，Germany)，4 ℃過夜，PBST室溫沖洗樣品。按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(Beyotime)說明書進行顯色處理；顯色后PBS沖洗終止顯色；4% PFA-PBS固定10 min，PBST洗滌3×5 min；待切片稍干后用甘油封片，稍后進行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 LncRNA 54770.30在不同組織的表達(dá)分析

通過qRT-PCR對黃鱔LncRNA 54770.30進行不同組織的表達(dá)分析，結(jié)果顯示LncRNA 54770.30在各組織中均有表達(dá)(圖1)，肌肉中表達(dá)量最高，且顯著性高于精巢與肝，在其它各組織中表達(dá)較低且無顯著性差異。

圖1 LncRNA 54770.30在不同組織中的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of LncRNA 54770.30 in different tissues

2.2 LncRNA 54770.30在不同階段性腺的表達(dá)分析

黃鱔不同階段性腺的表達(dá)結(jié)果顯示(圖2)，LncRNA 54770.30在黃鱔精巢中表達(dá)量最高、且顯著性高于雌性卵巢與間性性腺，在黃鱔雌性卵巢至間性性腺中表達(dá)量呈上升趨勢，但無顯著性差異。

圖2 LncRNA 54770.30在不同發(fā)育時期性腺中的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of LncRNA 54770.30 in gonads at different developmental stages

2.3 LncRNA 54770.30組織表達(dá)定位

通過RNA原位雜交定位LncRNA 54770.30在黃鱔卵巢、間性性腺和精巢中的位置表達(dá)。結(jié)果顯示，反義RNA探針原位雜交的卵巢、間性性腺和精巢組織中均可檢測到陽性信號(圖3B、C、D)，正義探針均檢測不到陽性信號(圖3A)。LncRNA 54770.30在卵巢組織中，主要在初級卵母細(xì)胞和II期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)；在間性性腺中，主要在初級卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、顆粒細(xì)胞以及體細(xì)胞中表達(dá)；在雄性組織中陽性信號在初級精母細(xì)胞及次級精母細(xì)胞中表達(dá)明顯。

圖3 LncRNA 54770.30在不同發(fā)育時期性腺中的表達(dá)定位Fig.3 Localization of LncRNA 54770.30 in gonads at different developmental stages

2.4 MT處理后LncRNA 54770.30性腺中表達(dá)模式分析

對60日齡的黃鱔進行MT處理兩月后，HE染色切片觀察結(jié)果顯示：MT組大量卵母細(xì)胞退化，與對照組相比卵母細(xì)胞的濾泡膜與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)有明顯分離的現(xiàn)象，并伴隨著中空小葉出現(xiàn)且生殖脊明顯增粗，但未見明顯解體的卵巢(圖4A)。根據(jù)其HE染色切片從MT組選取退化較明顯的樣品提取RNA合成cDNA并進行qRT-PCR，結(jié)果顯示(圖4B)LncRNA 54770.30在卵巢中表達(dá)量降低，且與對照組表達(dá)量存在顯著差異。

圖4 MT處理后LncRNA 54770.30在性腺中的表達(dá)Fig.4 Expression of LncRNA 54770.30 in gonad after MT treatment

3 討論與分析

黃鱔是一種雌雄同體并且雌性先熟的淡水魚類，不同于其他硬骨魚類，黃鱔早期發(fā)育為雌性，中間經(jīng)歷一個雌雄同體的間性發(fā)育時期，后期則發(fā)育為雄性，該發(fā)育過程是不可逆的。黃鱔的所有個體決定性別的遺傳因素是相同的，沒有遺傳因素上的雌雄之分，因而是一種發(fā)育上的而非遺傳上的雌雄同體[10]。

LncRNA作為生物中含量較多的非編碼RNA，廣泛參與了各種生物活動的調(diào)控，有研究表明LncRNA參與了生物的性腺發(fā)育[11]。本研究通過對黃鱔卵巢、間性性腺、精巢轉(zhuǎn)錄組測序中獲的差異表達(dá)LncRNA 54770.30，通過比較分析LncRNA 54770.30在不同組織和不同階段性腺組織表達(dá)差異，結(jié)果顯示LncRNA 54770.30在肌肉中顯著性高表達(dá)(P<0.05)，精巢、肝臟中次之，在胃、腸、腦、心、脾、腎、皮膚中低表達(dá)(圖1)。對比不同階段性腺表達(dá)結(jié)果顯示，LncRNA 54770.30在黃鱔雌性卵巢至間性性腺中表達(dá)量呈上升趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)，間性性腺至雄性精巢中表達(dá)量持續(xù)上升且有顯著差異(P<0.05)(圖2)?？梢奓ncRNA 54770.30在雌性發(fā)育時期表達(dá)量較低，隨著卵母細(xì)胞生長到后期的退化，與此同時精原細(xì)胞開始增殖、分化，性腺逐漸發(fā)育到雄性階段，LncRNA 54770.30表達(dá)量在此程中逐漸上升。在小鼠(Musmusculus)、sox9上游約1.3 kb處存在LncRNA TESCO，通過與轉(zhuǎn)錄因子sf1的相互作用維持sox9的表達(dá)，從而維持雄性小鼠的發(fā)育，在小鼠中還發(fā)現(xiàn)了位于5號染色體上的LncRNA DMR通過結(jié)合dmrt1的3’UTR抑制dmrt1的表達(dá)[12]。在果蠅(Drosophilamelanogaster)中，sxlpe是一個位于果蠅X染色體上的雌性性別決定啟動子，可表達(dá)R1S、R1A、R2S和R2A四條LncRNAs，其中R2A通過激活sxlpe的轉(zhuǎn)錄使果蠅發(fā)育為雌性，而R1A、R1S和R2S通過抑制sxlpe使果蠅發(fā)育為雄性[13]。RONDEAU等[14]在果蠅精巢中的研究也證明了LncRNA在果蠅精子發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的功能。王偉佳[15]對大黃魚性腺LncRNA的研究中篩選得到了61個在卵巢中特異表達(dá)的LncRNA，得到了803個在精巢中特異表達(dá)的LncRNA，通過對這些LncRNA的預(yù)測獲得多條可能與精子發(fā)生發(fā)育相關(guān)的LncRNA，這些LncRNA可能發(fā)揮著促進性腺向精巢分化或維持精巢正常生理功能的作用；同時還發(fā)現(xiàn)一條與dmrt1呈現(xiàn)強烈正相關(guān)性的LncRNA MSTRG.24346，推測其可能在大黃魚的性別決定中發(fā)揮著重要作用。馮博[16]在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)的研究中，通過高通量測序分析獲得精巢特異LncRNA 41個，mRNA 18個；卵巢特異LncRNA 33個，mRNA 21個；偽雄魚精巢特異LncRNA 26個，mRNA 12個，發(fā)現(xiàn)LncRNA DMRT2-AS在精巢中表達(dá)最高，而在卵巢和腎臟中的表達(dá)最低，LncRNA DMRT2-AS的表達(dá)在雄魚的精巢中的表達(dá)均表現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢，這些結(jié)果表明LncRNA DMRT2-AS可能對dmrt2的表達(dá)具有調(diào)控作用。彭錕等[17]在羅非魚的研究中，通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得了尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)雌、雄性腺中呈現(xiàn)差異表達(dá)的LncRNA，并選取LncRNA TCONS-02477925開展研究，結(jié)果表明LncRNA TCONS-02477925在羅非魚卵母細(xì)胞發(fā)育和性別分化中可能有重要的作用。SONG等[18]在關(guān)于鯉魚(Cyprinuscarpio)的研究中通過對干擾igf3前后的性腺組織進行測序，得到了124個差異表達(dá)的LncRNA，這些LncRNA可能在鯉魚的性別分化和性腺發(fā)育中起到重要的作用。目前LncRNA在黃鱔性逆轉(zhuǎn)中的研究報導(dǎo)較為罕有，但參照以上LncRNA在其他魚類和其他物種中的研究結(jié)果，對比分析本研究結(jié)果所展示的LncRNA 54770.30在黃鱔的卵巢和精巢中的表達(dá)存在十分顯著的差異且在精巢中的表達(dá)明顯高于在卵巢中的表達(dá)，可推測LncRNA 54770.30可能在黃鱔的性腺發(fā)育和性別分化中起到重要的作用。另外，本研究中黃鱔LncRNA 54770.30在肌肉中顯著性高表達(dá)(P<0.05)，推測性腺分化與LncRNA 54770.30在肌肉中的高表達(dá)有可能存在一定聯(lián)系。

原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。本研究通過RNA原位雜交來定位LncRNA 54770.30在黃鱔卵巢、間性性腺、精巢細(xì)胞中的位置表達(dá)(圖3)，結(jié)果顯示在使用反義RNA探針原位雜交的卵巢組織、間性性腺、精巢組織中均可檢測到陽性信號(圖3B、C、D)，與本研究qPCR結(jié)果中顯示的LncRNA 54770.30在不同發(fā)育時期性腺結(jié)中均有表達(dá)保持高度一致。LncRNA 54770.30在卵巢組織中主要在初期卵母細(xì)胞和II、IV時相期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞中表達(dá),V時相期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中無明顯陽性信號；在間性組織中主要初級卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞中表達(dá)，在性腺外膜中有少量表達(dá)，在V時相期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中無明顯陽性信號，陰性對照組中未見陽性信號。何智等[19]對不同發(fā)育時期黃鱔性腺中Caspase-3定位分析中也有類似情況，推測可能是因為此時的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中充滿了大量卵黃物質(zhì)和脂質(zhì)，使細(xì)胞質(zhì)中陽性信號無法觀察到。在雄性組織中，陽性信號在初級精母細(xì)胞及次級精母細(xì)胞中表達(dá)明顯，在性腺外膜中有少量表達(dá)。蔣嬌云等[3]的研究中黃鱔的f4基因原位雜交分析結(jié)果顯示與半定量具有類似的表達(dá)情況，即f4基因從IV期卵巢開始表達(dá)，一直持續(xù)到后期精巢，間期性腺到后期精巢表達(dá)量有增高趨勢，最終性腺性逆轉(zhuǎn)為精巢。與本研究中LncRNA 54770.30在卵巢至間性性腺和精巢中的表達(dá)呈逐漸上升趨勢且在精巢中最高具有相同的表達(dá)趨勢。

17α-甲基睪酮(17-Methyltestosterone，MT)是一種人工合成的白色結(jié)晶性粉末狀雄性激素，屬于固醇類激素，能夠干擾動物正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進并維持雄性性器官的發(fā)育及第二性征的形成和維持，對雌激素產(chǎn)生拮抗作用，抑制雌性性器官的發(fā)育，可做為魚類性轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑，常用于苗種培育和性別控制等方面的特效藥物據(jù)[20]。TANG等[21]報導(dǎo)多種雄激素(甲基睪酮、睪酮和11-酮睪酮)均對成鱔提早性轉(zhuǎn)化無效，但對黃鱔胚胎后期以及仔鱔進行雄激素處理可以促使黃鱔提早性轉(zhuǎn)換。本研究通過在飼養(yǎng)黃鱔的水體和餌料中添加甲基睪酮，對仔鱔進行激素刺激處理，通過對比觀察性腺樣品的HE切片，MT組大量II期卵母細(xì)胞退化，與對照組相比發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的卵膜與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)有明顯分離的現(xiàn)象，并伴隨著中空小葉出現(xiàn)且生殖脊明顯增粗，但未見明顯解體的卵巢。MT處理后LncRNA54770.30表達(dá)相較于對照組明顯下降，具有顯著性差異(P<0.05)。卓孝磊等[22]在外源性甲基睪丸酮對黃鱔性腺發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)MT可促進雌鱔卵母細(xì)胞退化，但不能使卵巢完全解體；MT可促進雌性和間性黃鱔性腺生殖板擴大、延伸并出現(xiàn)中空小葉；MT對雌雄間體早期的黃鱔的雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育有促進作用。KUO等[23]報道了雌雄同體、雌性先熟的藍(lán)點鮨(Epinephelinaefario)自然生長需要7年才會變?yōu)樾埕~，但是用甲基睪酮可誘發(fā)2齡魚提前性轉(zhuǎn)變?yōu)樾埕~。方永強等[24,25]最初用17α-甲基睪酮研究對赤點石斑魚(E.akaara)性逆轉(zhuǎn)的影響，并認(rèn)為17α-甲基睪酮引起石斑魚性逆轉(zhuǎn)的作用機制為：17α-甲基睪酮抑制卵母細(xì)胞生成卵黃，使卵母細(xì)胞出現(xiàn)閉鎖，最終退化，并通過刺激生精細(xì)胞的增值使精巢增值，激發(fā)精子發(fā)生機制，最終引起石斑魚性逆轉(zhuǎn)。綜上所述與本實驗結(jié)果可推測甲基睪酮可能抑制黃鱔卵母細(xì)胞積累卵黃，阻止了卵母細(xì)胞的進一步發(fā)育；同時也能刺激原始精母細(xì)胞的發(fā)育而使黃鱔由雌性發(fā)育階段提早進入性逆轉(zhuǎn)階段，而LncRNA 54770.30在此過程中可能參與黃鱔卵母細(xì)胞發(fā)育及性逆轉(zhuǎn)過程中的卵母細(xì)胞的凋亡和精母細(xì)胞的增殖。