梁楚容，王琴，肖更生，馬路凱,2，吳暉，肖建波，劉袆帆*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，廣東廣州 510225）（2.西藏農(nóng)牧業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品研究所，西藏拉薩 850000）（3.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（4.西班牙維戈大學食品科學與技術學院,西班牙加利西亞自治區(qū) 36310）

炎癥是各種致炎因子入侵時機體和受損細胞的自我保護反應，炎癥在機體內具有雙重作用，適度的炎癥反應有利于機體自我調控，但過度的炎癥反應會引起機體的不良反應并且會引發(fā)其他疾病的產(chǎn)生[1]。研究表明多肽具有抗氧化、抗炎癥及免疫調節(jié)等多種生理活性[2]。多肽主要由2~20個氨基酸以不同的排列順序組成，因氨基酸的種類、數(shù)量和排列順序等存在差異，從而使得不同多肽的生理活性存在很大的差異[3]。梁秋芳[4]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白酶解制備生物活性肽具有抗氧化活性并對結腸炎具有良好的抗炎效果，而且在血管內皮細胞模型具有良好的抗炎活性。武文佳[5]利用小麥胚芽蛋白中提取得到具有良好免疫調節(jié)功能的活性肽，經(jīng)凝膠層析后得到的多肽組分可顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞促炎因子（NO、IL-6和TNF-α）的分泌量，具有抗炎的效果。Ssa等[6]首次報道了體外胃腸道消化釋放的發(fā)芽莧菜活性肽，發(fā)現(xiàn)其中抗氧化活性最高的分解組分對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞具有較高的抗炎作用，也可稱為抗炎肽?？梢?，從植物中提取得到的活性肽段具有一定的研究價值。目前對兜唇石斛這類藥食同源植物的研究較少，對兜唇石斛中發(fā)酵多肽的報道就更少了。

兜唇石斛（Dendrobium aphyllum），為蘭科石斛屬附生植物，是藥用范圍較廣的中藥[7]。劉袆帆[8]選用一種乳酸桿菌對兜唇石斛進行固態(tài)發(fā)酵，選取其中活性最強小于1 ku的多糖組分，經(jīng)DEAE純化后得到一個肽段組分，后經(jīng) LC-TOF/MS-MS分析發(fā)現(xiàn)組成的肽分子序列含有：Asp-Asp-Asp-Tyr (DDDY)、Asp-Asp-Tyr-Asp (DYDD)、Met-Ala-Lys (MAK)等。發(fā)酵多肽DDDY和DYDD等具有天然可靠、無毒無害等優(yōu)點，本課題組前期對這些多肽分子做了大量的研究，Liu等[9]通過量子化學理論計算，發(fā)現(xiàn) DYDD上的O58-H59和DDDY上的N10-H12為抗氧化活性位點，對AAPH誘導的HepG2細胞在細胞內和細胞外起到保護作用，通過對自由基進行直接清除，而不是激活Nrf2/Keap1信號通路，從另一個角度來解釋細胞抗氧化機制。劉映君等[10]對其中一條肽MAK的抗菌機理進行了研究，發(fā)現(xiàn)MAK可以抑制銅綠假單胞菌的生長，起到抑菌的作用。另外 Zhuang等[11]利用代謝組和轉錄組結合分子動力學模擬進行分析，發(fā)現(xiàn)DDDY對銅綠假單胞菌的抑菌作用與膜轉運、氨基酸代謝通路和DDDY的n端c端氨基酸殘基有關。

基于本課題組前期對兜唇石斛發(fā)酵多肽在抗氧化和抑菌方面開展了深入的研究，為繼續(xù)探明發(fā)酵多肽在其他生理活性的作用，特別是抗炎癥方面的探究?？紤]到DDDY和DYDD具有相似的氨基酸組成，本研究以合成的DDDY和DYDD為研究對象，采用脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）刺激RAW264.7巨噬細胞構建體外炎癥模型，以一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和細胞因子白介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10 和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）為炎癥指標，探究DDDY和DYDD的體外抗炎活性，明確發(fā)酵多肽對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥是否有緩解作用，為下一步深入研究兩條發(fā)酵多肽的抗炎機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 材料與試劑

發(fā)酵多肽 Asp-Asp-Asp-Tyr（DDDY）和Asp-Tyr-Asp-Asp（DYDD）是本課題組劉袆帆通過乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵兜唇石斛得到多糖組分，后經(jīng)DEAE純化后得到肽段DPP，最后經(jīng)LC-TOF/MS-MS分析發(fā)現(xiàn)的多肽分子序列。本研究使用的發(fā)酵多肽DDDY、DYDD由上海科多肽生物技術有限公司（中國上海）按照發(fā)現(xiàn)的分子序列合成；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、噻唑藍（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）購自Sigma-Aldrich公司（St.Louis, MO, USA）；胎牛血清（FBS）、青霉素和 DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基購自 Gibco公司（Carlsbad, CA, USA）。中性紅細胞染色液，購自上海源葉生物技術有限公司；一氧化氮（Nitric Oxide，NO）試劑盒、白介素（Interleukin，IL）-1β試劑盒、IL-6、IL-10試劑盒、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）試劑盒，購自Mibio酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

海爾超凈工作臺，上海海爾儀器設備有限公司；TECAN連續(xù)多功能酶標儀，美國Thermo公司；倒置顯微鏡，德國Leica公司；臺式多功能離心機，德國Eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7于DMEM高糖培養(yǎng)基（含體積分數(shù)10%胎牛血清和1%雙抗）中培養(yǎng)，37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細胞貼壁生長密度至80%左右進行傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗，分為空白對照組、試驗組和LPS組。

1.2.2 MTT細胞增殖實驗

參考胡夢君[12]的方法，稍作修改。以每毫升5×104個細胞的密度將細胞置于96孔板中，37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。空白對照組加入100 μL完全培養(yǎng)液，試驗組加入100 μL不同質量濃度（12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）的發(fā)酵多肽溶液，LPS組加入1 μg/mL的LPS 100 μL作為陽性對照，每組設置3個平行孔。37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入0.5%的MTT試劑200 μL，放入37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h，棄去孔內液體，每孔加入 DMSO 150 μL，酶標儀中低速震蕩15 min使藍紫色晶體充分溶解，于490 nm波長處檢測各孔OD值。根據(jù)OD值和公式（1）計算每孔細胞的存活率，以此判斷 LPS和發(fā)酵多肽對細胞存活率（A，%）的影響。

式中：

A——細胞存活率，%；

OD0——空白孔OD值；

OD1——對照組OD值；

OD2——實驗組OD值。

1.2.3 中性紅吞噬作用評價

參照Yu等[13]的方法，稍作修改。細胞培養(yǎng)方法和處理方法同1.2.2，結束后棄去培養(yǎng)液，空白對照組僅加入150 μL紅細胞裂解液，其余各組加入質量分數(shù)0.075%中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后棄去中性紅溶液，用PBS清洗2次，加入150 μL紅細胞裂解液，在540 nm波長處檢測各孔吸光度值（OD），根據(jù)公式（2）計算細胞的相對吞噬率。

式中：

B——相對吞噬率，%；

OD3——空白組OD值；

OD4——實驗組OD值。

1.2.4 光學顯微鏡對RAW264.7細胞的形態(tài)觀察

（1）細胞培養(yǎng)方法：同1.2.2。

（2）細胞處理分組：PBS清洗過后96孔板細胞中，空白對照組加入100 μL的完全培養(yǎng)液，試驗組先加入1 μg/mL的LPS，后加入50 μg/mL的DDDY或50 μg/mL 的DYDD 共100 μL，LPS組加入 100 μL 1 μg/mL 的 LPS。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

（3）細胞觀察：光學顯微鏡下對空白對照組、試驗組和LPS組的細胞進行觀察，調整視野，放大 10倍比較細胞形態(tài)差異。

1.2.5 對細胞信號物質NO分泌的影響

參照胡夢君[12]的方法，稍作修改。以每毫升1×106個細胞的密度將細胞置于24孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。按照1.2.4的分組方法設計空白對照組、試驗組和LPS組，每孔0.5 mL，每組設置3個平行孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，將孔板中的細胞培養(yǎng)液轉入離心管，2 500 r/min離心10 min后收集細胞上清液。采用ELISA試劑盒測定細胞上清液的NO水平。

1.2.6 RAW264.7 細胞TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10分泌量的影響

細胞培養(yǎng)與處理方法同1.2.5中，培養(yǎng)結束后吸取培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10分泌量的水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個處理做3次重復試驗，數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結果以平均值±標準差（mean±SD）表示，以 Duncan多邊檢驗對實驗均值進行差異顯著分析（p＜0.05），用Origin 2018對分析數(shù)據(jù)作圖。

2 結果與討論

2.1 DDDY和DYDD對RAW264.7細胞活力的影響

單核-巨噬細胞在機體免疫體系中扮演著非常重要的角色，RAW264.7巨噬細胞受到脂多糖刺激后構建的體外炎癥模型，通過檢測其各個炎癥指標的變化，從而探究闡明該藥物的抗炎效果及作用機制[14]。但是藥物的毒性會抑制細胞增殖，進而影響細胞炎性因子分泌量，會降低對藥物抗炎效果判斷的準確性，MTT法是檢測細胞活性常用的方法，結果可以反映藥物對細胞的毒性大小[15]。

因此，本研究首先采用 MTT法考察不同質量濃度發(fā)酵多肽（DDDY和DYDD）對RAW264.7巨噬細胞活性的影響。圖1反映的是不同質量濃度的DDDY和DYDD作用于RAW264.7小鼠巨噬細胞24 h后細胞的活性情況。從圖可以看出，一定質量濃度范圍的DDDY和DYDD能顯著（p＜0.05）促進RAW264.7細胞的增殖，并且1 μg/mL的 LPS處理可以明顯地（p＜0.05）促進細胞的活性。不同質量濃度 DDDY溶液對RAW264.7細胞的增殖影響如圖1a所示，當DDDY質量濃度在12.5~100 μg/mL范圍內，隨著質量濃度的增加，細胞的存活率也明顯增加，證明此質量濃度范圍增強了細胞的增殖率。但是當質量濃度超過100 μg/mL，細胞的活性下降，最低下降到87.23%。不同質量濃度DYDD溶液對細胞的增殖作用如圖1b所示，與空白對照組（細胞存活率為100.00%）相比，DYDD質量濃度在12.5~100 μg/mL范圍內細胞活性維持在 100.40%~126.08%之間；質量濃度在 200~400 μg/mL 范圍內，細胞的存活率顯著降低（p＜0.05）。結果表明，12.5~100 μg/mL的 DDDY和 DYDD對RAW264.7小鼠巨噬細胞無顯著毒性，故選取12.5、25、50和100 μg/mL四種質量濃度的兩種發(fā)酵多肽分別作為后續(xù)試驗的試驗組。選取對細胞無毒性的1 μg/mL作為構建炎癥模型的 LPS刺激質量濃度，這個 LPS質量濃度也是炎癥模型常用的質量濃度[16,17]。

圖1 不同質量濃度DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞的增殖影響Fig.1 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on proliferation of RAW264.7 cells

2.2 DDDY和DYDD對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

吞噬能力是巨噬細胞的一個重要功能，吞噬能力的增強是巨噬細胞活化的一種表現(xiàn)[18]，吞噬能力的大小可以反映出細胞的活性的高低[19]，而中性紅吞噬實驗就是用來研究細胞的吞噬能力的。所以，接下來本研究采用中性紅吞噬實驗來研究DDDY和DYDD對細胞吞噬率的影響。圖2反映的是不同質量濃度的DDDY和DYDD對RAW264.7細胞吞噬能力的影響，不同質量濃度的DDDY對細胞的相對吞噬率如圖2a所示，質量濃度在 12.5 μg/mL~100 μg/mL范圍內，DDDY能顯著增強細胞的吞噬作用（p＜0.05），而且隨著質量濃度的增加，細胞的吞噬能力越強，其中100 μg/mL DDDY處理組的細胞吞噬能力比空白對照組的上升1.05倍；同時如圖2b所示不同質量濃度DYDD對細胞的吞噬能力，與空白對照組相比，DYDD能顯著提高細胞的吞噬能力（p＜0.05），四個質量濃度DYDD處理組的細胞吞噬能力在 1.75%~1.97%之間，無明顯差異。從圖中也可以看出，1 μg/mL的LPS處理也能提高RAW264.7細胞的吞噬能力，此研究結果與王潔[18]不同質量濃度的林蛙骨肉小肽促進RAW264.7細胞吞噬能力的研究相似。結果表明，12.5、25、50和100 μg/mL四個質量濃度的DDDY和DYDD和1 μg/mL LPS處理可以激活RAW264.7細胞，顯著增強細胞的吞噬能力。猜測可能此質量濃度的發(fā)酵多肽和LPS可以很好的與RAW264.7細胞表面的特異性受體結合，對細胞進行活化，活力高的巨噬細胞吞噬能力增強，進而細胞的殺菌功能抗炎功能顯著上調。

圖2 不同質量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞吞噬能力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on phagocytosis of RAW264.7 cells

2.3 RAW264.7細胞形態(tài)的光學顯微鏡觀察

RAW264.7作為一種在微生物學免疫學等中常用的試驗性細胞，具有很強的粘附能力和抗原吞噬能力，作為類單核細胞，它的理想形態(tài)應該是小圓而透亮，較少偽足和類似“觸角”樣的東西[14]。倒置顯微鏡 10倍鏡下觀察不同處理組中RAW264.7細胞的形態(tài)，如圖3所示分別為空白對照組、LPS處理組、DDDY作用組、DYDD作用組?？瞻讓φ战M中RAW264.7細胞形態(tài)正常，呈正常圓形或者橢圓形，細胞之間緊密接觸生長（圖3a）；LPS刺激后RAW264.7細胞出現(xiàn)分支情況，細胞觸角分明，細胞間距明顯增大，多數(shù)細胞沒有緊密連接在一起（圖3b）；DDDY和DYDD分別與LPS共作用于RAW264.7細胞后，分支狀細胞明顯減少，大部分細胞形態(tài)為圓形或橢圓形，細胞恢復正常形態(tài)（圖3c和圖3d）。

圖3 不同處理下的RAW264.7細胞光學顯微鏡形態(tài)（10×）：空白對照組（a）、LPS處理組（b）、DDDY+LPS處理組（c）、DYDD+LPS處理組（d）Fig.3 Optical microscope morphology of RAW264.7 cells under different treatments (10×): Blank control group (a), LPS treatment group (b), DDDY+LPS treatment group (c),DYDD+LPS treatment group (d)

根據(jù)顯微鏡對細胞形態(tài)的觀察，可知，1 μg/mL的LPS可成功誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生炎癥，使巨噬細胞形態(tài)有明顯分化，形成了許多偽足，出現(xiàn)不規(guī)則的圓形，這樣與蛋白樣品接觸面積增加，這也可能是LPS增強了巨噬細胞的吞噬能力的原因；而50 μg/mL的DDDY和50 μg/mL的DYDD發(fā)酵多肽處理后可有效抑制細胞分化，改善LPS誘導的巨噬細胞形態(tài)，緩解細胞的炎癥反應，促進細胞增殖。猜測可能是發(fā)酵多肽的加入，占據(jù)巨噬細胞表面上的某種特定識別受體，使LPS與細胞的接觸減少或者功能減弱，從而緩解了LPS對巨噬細胞的過度刺激，改善RAW264.7細胞的形態(tài)。這些研究結果與陳磊研究的山梨酸對LPS誘導的RAW264.7細胞形態(tài)的變化具有較好的保護作用[1]和王潔研究的林蛙骨肉小肽對RAW264.7細胞形態(tài)恢復正常并且有增殖的結果相似[18]。

2.4 DDDY和DYDD對RAW264.7細胞NO分泌量的影響

LPS可誘導巨噬細胞釋放NO、IL-1s等多種炎癥因子，其中NO可經(jīng)一氧化氮誘導合酶iNOS催化可短時大量生成，可以通過測定其含量反映炎癥發(fā)生的程度[20]。由圖4可知，不同處理組的NO分泌量有顯著的差異（p＜0.05），LPS處理組的NO分泌量高于其他處理組，這是因為巨噬細胞受LPS刺激，影響了機體中iNOS的表達，進而影響了NO的生成量[21]。如圖4a所示，與LPS處理組對比，DDDY處理降低了 NO 的分泌量，而且質量濃度在 12.5 μg/mL~100 μg/mL范圍內呈劑量依懶性，LPS處理組NO分泌量為100 μg/mL DDDY處理質量濃度的2.46倍；由圖4b可以看出，不同質量濃度 DYDD處理組的NO生成量顯著高于空白組（p＜0.05），低于LPS組（p＜0.05），其中 12.5 μg/mL DYDD 處理組為空白對照組的 16.28倍，兩種發(fā)酵多肽對 RAW264.7細胞NO分泌量的刺激呈劑量相關性。

圖4 不同質量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞NO分泌量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on NO secretion in RAW264.7 cells

NO分泌量是炎癥反應中重要的促炎分子，細胞NO的分泌量可間接反映炎癥發(fā)生的程度[22]，因此，藥物對炎癥反應的作用可通過測定NO的含量高低來進行判斷。結果表明，LPS處理能增加細胞NO的分泌，添加四種質量濃度的DDDY和DYDD處理后，能對細胞NO的分泌產(chǎn)生抑制作用，使NO的分泌量明顯下降，起到抗炎作用。我們猜測發(fā)酵多肽的加入影響了細胞中與iNOS表達的相關蛋白的產(chǎn)生，從而影響了NO的分泌，改善了LPS對巨噬細胞的過度刺激，降低了細胞的炎癥程度，同時證明活性發(fā)酵多肽能對細胞起到抗炎的效果，He等[23]表明小米糠生物活性肽在LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞以劑量依賴的方式顯著降低NO的產(chǎn)生。這與與本試驗結果相似。

2.5 DDDY和DYDD對細胞因子分泌量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，當巨噬細胞受到外界抗原刺激時（如LPS）會釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等重要的細胞因子[24,25]。其中促炎細胞因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6等可與抑炎細胞因子IL-10等相互影響，共同發(fā)揮對炎癥的調節(jié)作用[12]。為更全面地對 DDDY和DYDD的體外抗炎效果進行研究，以 LPS誘導RAW264.7巨噬細胞作為體外抗炎模型，分別探究四個質量濃度的DDDY和DYDD對細胞分泌因子分泌量的影響。

2.5.1 TNF-α分泌量

TNF-α能夠誘導其它免疫因子的分泌，TNF-α具有上調iNOS的表達，促進NO的生成，所以通常被選為藥物對巨噬細胞免疫調節(jié)作用的指標[24]。如圖5實驗結果所示，LPS誘導RAW264.7巨噬細胞24 h后，與空白對照組相比，LPS處理組的TNF-α分泌量顯著升高（p＜0.05），當用不同質量濃度的DDDY和DYDD作用后，TNF-α分泌量明顯下降。DDDY處理后如圖5a所示，與LPS處理組相比，隨著DDDY質量濃度升高，TNF-α分泌量越低，當經(jīng)100 μg/mL DDDY處理后，TNF-α分泌量下降到 86.73 pg/mL。12.5~100 μg/mL質量濃度范圍的DYDD處理后如圖5b所示，TNF-α的分泌量降低到LPS處理組的0.68~0.86倍，隨著DYDD質量濃度的升高而抑制更多，表現(xiàn)出質量濃度依賴性。Yang等[26]表明車前花乙醇提取物對LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中TNF-α分泌有較強的抑制作用。He等[23]發(fā)現(xiàn)谷糠發(fā)酵多肽能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中TNF-α等炎癥因子的水平。我們的研究結果與前人的研究結果相似，結果表明，DDDY和 DYDD能顯著降低 LPS誘導的RAW264.7細胞中TNF-α的分泌量，并且發(fā)酵多肽的質量濃度越高TNF-α分泌量越低，均具有質量濃度依賴性。我們猜測，由于發(fā)酵多肽的介入，影響了LPS誘導的炎癥模型細胞中促炎癥因子 TNF-α合成蛋白或基因的表達，導致TNF-α分泌量下降，下調了iNOS的表達，進而影響NO的生成。這也解釋了DDDY和DYDD處理后RAW264.7細胞中TNF-α分泌量的變化趨勢與NO分泌量相似。

圖5 不同質量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞TNF-α分泌量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on TNF-α secretion in RAW264.7 cells

2.5.2 IL-1β分泌量

IL-1β作為一種關鍵的促炎細胞因子，參與多種自身免疫性炎癥反應和多種細胞活動[27]。不同質量濃度的DDDY和DYDD對RAW264.7細胞IL-1β分泌量的影響如圖6所示，空白對照組的IL-1β分泌量均比較低，經(jīng)過LPS刺激后，LPS處理組的 IL-1β釋放量明顯升高（p＜0.01），當采用 12.5、25、50、100 μg/mL質量濃度的DDDY和DYDD分別處理后，IL-1β分泌量逐步降低（p＜0.05）。不同質量濃度的 DDDY 對RAW264.7細胞 IL-1β分泌量影響如圖6a所示，100 μg/mL質量濃度的DDDY處理后，IL-1β分泌量下降至原來的 0.51倍；不同質量濃度的 DYDD對RAW264.7細胞IL-1β分泌量影響如圖6b所示，隨著DYDD處理質量濃度越高，IL-1β分泌量越低，顯現(xiàn)出明顯的劑量效應關系。結果表明，DDDY和DYDD能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-1β的分泌量，其中兩種發(fā)酵多肽的質量濃度在100 μg/mL時，IL-1β分泌量顯著降低。He等[23]發(fā)現(xiàn)小米糠活性肽能顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-1β等炎癥因子的水平。Kim等[28]發(fā)現(xiàn)蓼乙醇提取物可下調 LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中促炎介質如NO和細胞因子IL-1β的表達。這些結果與我們的試驗結果相似。

圖6 不同質量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞IL-1β分泌量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on IL-1 βsecretion in RAW264.7 cells

2.5.3 IL-6分泌量

IL-6是一種重要的促炎細胞因子，在炎癥的發(fā)病機制中起重要的作用[29]。不同質量濃度的 DDDY和DYDD對RAW264.7細胞IL-6分泌量的影響如圖7所示，LPS誘導RAW264.7巨噬細胞24 h后，與空白對照組相比，LPS處理組中 IL-6分泌顯著增加（p＜0.01），當逐漸增加DDDY和DYDD兩種發(fā)酵多肽的作用質量濃度后，IL-6分泌量降低，并且呈依賴性。由圖7a可知，經(jīng)過100 μg/mL DDDY處理后，與 LPS處理組對比，IL-6分泌量下降 1.67倍；由圖7b可知，經(jīng)過四種質量濃度的DYDD處理后，與LPS處理組對比，IL-6分泌量下降1.28~1.76倍。結果表明，DDDY和 DYDD能顯著降低 LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-6的分泌量，對巨噬細胞的過度刺激有作用進而對炎癥反應有作用。這與Hong等[30]發(fā)現(xiàn)的臍帶菌顯著抑制LPS刺激的RAW264.7細胞中NO、PGE2和IL-6的產(chǎn)生，顯著抑制LPS刺激的炎癥反應結果相似。IL-6作為一種促炎細胞因子，發(fā)酵多肽處理后的 RAW264.7細胞的分泌量變化趨勢與TNF-α和IL-1β相似，我們猜測發(fā)酵多肽對LPS誘導的細胞影響與促炎因子相關基因表達受到干擾有關。

圖7 不同質量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞IL-6分泌量的影響Fig.7 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on IL-6 secretion of RAW264.7 cells

2.5.4 IL-10分泌量

IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，調節(jié)細胞的生長與分化，參與炎癥反應和免疫反應，是公認的炎癥中的抑炎與免疫抑制因子[31]。不同質量濃度的DDDY和DYDD對RAW264.7細胞IL-10分泌量的影響如圖8所示，LPS誘導細胞24 h后，IL-10分泌量明顯降低，與空白對照組相比有顯著性差異（p＜0.01）。12.5、25、50、100 μg/mL質量濃度DDDY和DYDD作用于LPS誘導后的細胞，IL-10 質量濃度逐漸升高，與LPS處理組相比均有顯著性（p<0.01）。由圖8a可知，經(jīng)過100 μg/mL DDDY處理后，與LPS處理組對比，IL-10含量上升到原來的 2.52倍；由圖8b可知，經(jīng)過四個質量濃度的DYDD處理后，IL-10分泌量為LPS處理組的1.52~2.73倍。結果表明，DDDY和DYDD能顯著升高LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-10的分泌量，對炎癥反應有作用。結果與Kim等[32]對綠頭仙鶴根提取物在LPS誘導炎癥反應中的抗炎作用IL-10分泌量變化相似。

圖8 不同質量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對RAW264.7細胞IL-10分泌量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on IL-10 secretion in RAW264.7 cells

LPS為革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的病原體，具有激活巨噬細胞的作用[33]。LPS誘導RAW264.7小鼠巨噬細胞是體外抗炎研究中常用的炎癥模型，活化后的RAW264.7細胞的吞噬能力明顯增強，且能分泌大量生物活性物質如NO和多種細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等[34]；因此，巨噬細胞NO及相關細胞因子的分泌量可作為評價DDDY和DYDD是否具有激活巨噬細胞從而起到抗炎功效的試驗依據(jù)。

有研究報道細胞因子如TNF-α和IL-6可通過激活 NF-κB和 MAPK等信號通路的關鍵蛋白引發(fā)炎癥[35]。本實驗結果表明，與空白對照組的RAW264.7細胞相比，LPS刺激后細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量均有明顯提高，與LPS處理組比較，不同質量濃度的DDDY和DYDD處理能不同程度地抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。但與空白對照組相比，LPS刺激后細胞中的抑炎因子IL-10質量濃度顯著降低，與 LPS組相比，不同質量濃度的DDDY和DYDD作用后細胞中IL-10的質量濃度均有顯著升高。根據(jù)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等細胞因子含量的測定，一定質量濃度的DDDY和DYDD處理可有效抑制RAW264.7細胞中促炎細胞因子的分泌，同時促進抑炎因子的分泌，由此緩解LPS誘導產(chǎn)生的細胞炎癥反應的發(fā)生。這與胡夢君[12]的研究結果相符。

3 結論

綜上所述，適度濃度的兜唇石斛發(fā)酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr（DDDY）和Asp-Tyr-Asp-Asp（DYDD）具有激活RAW264.7巨噬細胞、促進細胞的增殖和提高吞噬能力的功效；通過構建LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)DDDY和DYDD可以有效抑制LPS誘導的RAW264.7細胞的分化，使細胞恢復正常形態(tài)；并且能抑制 LPS誘導的 RAW264.7細胞NO分泌能力，進一步對細胞炎癥因子的分泌量分析，一定質量濃度的DDDY和DYDD處理能抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中促炎因子的產(chǎn)生，對抗炎因子的分泌有促進作用，表明DDDY和DYDD對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型有一定的抗炎作用。本研究為進一步探究發(fā)酵多肽DDDY和DYDD的抗炎機制提供了基礎，后續(xù)將從基因水平和細胞信號通路關鍵蛋白方面予以研究。