龔丹妮 綜述 嚴晨曦 傅瑤 審校

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院眼科 上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室,上海 200011

角膜緣干細胞(limbal stem cells,LSCs)位于角膜緣上皮基底層,可分化為短暫擴增細胞并遷移成為成熟的角膜上皮細胞,以維持角膜表面的完整性。先天性、創(chuàng)傷性或免疫性損傷,如熱化學燒傷、Stevens-Johnson綜合征、眼部瘢痕性類天皰瘡等可導致角膜緣干細胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency,LSCD),從而導致反復的上皮糜爛、持續(xù)的角膜潰瘍、慢性炎癥、角膜血管化及纖維化等問題,嚴重影響患者的視覺功能及舒適感[1]。在治療單側LSCD病例中首選體外培養(yǎng)的對側健康眼LSCs移植;當雙眼受影響時,可使用同種異體角膜緣組織。然而,鑒于長期免疫抑制治療的需要及其可能產生的不良反應,需考慮使用非角膜緣源性自體上皮組織。在過去的十多年中,體外構建培養(yǎng)的自體口腔黏膜上皮細胞(cultivated oral mucosal epithelial cells,COMECs)已成為眼表重建的重要細胞來源,并被廣泛證明具有良好的臨床效果。本文綜合近年來利用培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植(cultured oral mucosal epithelial transplantation,COMET)治療LSCD的研究進展,對體外培養(yǎng)方式的關鍵影響因素及細胞片臨床移植療效進行綜述。

1 口腔黏膜上皮的體外培養(yǎng)

1.1 培養(yǎng)載體

細胞片的成功培養(yǎng)在很大程度上依賴于載體質量。有效載體應具有高度的生物相容性、非炎癥性及非免疫原性,需維持角膜透明度和機械穩(wěn)定性,并能促進細胞的黏附和增生。目前,多種生物及合成載體已應用于研究。

1.1.1羊膜 人羊膜作為生物材料,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血管生成、促上皮化等特性,是LSCD治療中應用最廣泛的載體。在羊膜上培養(yǎng)的COMECs表現為復層上皮,可檢測到非角化復層上皮標志物CK3、CK4/13,部分研究報告了上皮祖細胞標志物p63的表達,透射電鏡可見橋粒、半橋粒和緊密連接等結構,與正常角膜上皮相似[2]。目前,對于羊膜載體是否應剝離上皮存在爭論。去上皮羊膜具有較低的免疫原性,有利于所培養(yǎng)上皮細胞的遷移和融合,且可促進細胞分化,而完整羊膜更有利于干細胞表型的維持[3-4],二者均可成功培養(yǎng)出口腔黏膜上皮細胞片,但前者在研究中的使用更為頻繁。值得注意的是,羊膜制備方法和批次間的可變性、疾病傳播的風險、制備的高成本等缺點均可影響培養(yǎng),因此需尋找替代的載體材料。

1.1.2纖維蛋白載體 纖維蛋白成本較低,支持上皮細胞生長,且可通過抗纖溶藥物控制降解,因此已作為載體被廣泛用于再生醫(yī)學。纖維蛋白凝膠是由凝血酶、纖維蛋白原和氯化鈣組成的止血復合物,可抑制纖維化、組織壞死及炎癥。在體內,凝膠可被完全吸收,有利于細胞片的直接移植,且可減少移植后新生血管的形成。Sheth等[5]的研究表明,在纖維蛋白凝膠上培養(yǎng)的COMECs可形成復層上皮,細胞片表達CK3、CK4/13,且高表達p63。Hirayama等[6]在培養(yǎng)過程中通過添加抑肽酶等蛋白酶抑制劑來防止纖維蛋白降解,并在培養(yǎng)完成后利用纖維蛋白的可降解性分離得到無載體細胞片。纖維蛋白已取得良好的臨床效果,但存在一定的安全問題,如術后的病毒傳播風險。

1.1.3膠原蛋白載體 人角膜的主要成分是膠原,而膠原蛋白具有天然的生物相容性和低免疫原性,可作為上皮細胞擴增的載體。Ilmarinen等[1]將Ⅳ型膠原蛋白應用于COMECs的培養(yǎng),在無血清和3T3飼養(yǎng)細胞的條件下,在Ⅳ型膠原涂層培養(yǎng)皿中培養(yǎng)出了復層上皮,結果顯示CK3/12、CK4/13呈陽性,基底層細胞表達增生標記Ki67和祖細胞標記p63;此外,培養(yǎng)物顯示緊密連接蛋白ZO-1和occludin陽性以及高跨上皮電阻值,表明其具有良好的屏障功能。Petsch等[7]分析了非交聯(lián)和紫外線/核黃素交聯(lián)Ⅰ型膠原膜用于角膜表面重建的適宜性和生物相容性,實驗證明膠原膜適合作為COMECs生長載體,且在體內顯示出高度的生物相容性,為COMET提供了新方案。

1.1.4溫敏性培養(yǎng)皿 所有人或動物來源的載體,包括纖維蛋白和膠原蛋白,都有可能造成感染,而溫敏性培養(yǎng)皿可避免此問題。培養(yǎng)皿表面共價偶聯(lián)的溫度敏感性聚合物,可隨溫度變化在親水與疏水狀態(tài)間轉換,使細胞片自發(fā)從皿底分離。獲取的COMECs細胞片基底側細胞間連接及細胞外基質完整,可增強與受體角膜表面的黏附。研究表明,培養(yǎng)的COMECs高表達E-鈣黏蛋白,有利于促進細胞黏附并形成眼表的保護性屏障[8]。移植到重度LSCD兔模型角膜的COMECs可促進角膜表面的上皮化,同時可減少病變角膜的血管化和纖維化[9]。此外,COMECs在LSCD患者的臨床治療中也取得了良好的療效[10]。

1.1.5接觸鏡 作為合成支架,接觸鏡在上皮細胞的培養(yǎng)及轉移中具有實用性。Bj?rkblom等[11]首次將接觸鏡用于COMECs的培養(yǎng),細胞在培養(yǎng)3 d后存活率高,可見融合的鵝卵石樣形態(tài),且p63、ABCG2表達呈陽性。Zsebik等[12]實現了在無動物源性材料和飼養(yǎng)層條件下人口腔黏膜組織塊在接觸鏡上的培養(yǎng),同樣得到了理想的細胞片。接觸鏡培養(yǎng)得到的復層上皮有利于增強對感染的抵抗力,并具有較高的機械強度來耐受手術中的各項操作。由于細胞轉移至裸露角膜后還需重新排列,當前對于最佳的細胞培養(yǎng)層數尚未達成共識。

1.1.6新型培養(yǎng)載體 隨著研究的進展,許多新型載體在COMECs的培養(yǎng)中得到了研究。Wang等[13]以脫細胞豬角膜基質(acellular porcine corneal stroma,APCS)為載體培養(yǎng)了功能性COMECs,細胞片表達上皮細胞及干細胞標記,且APCS移植有望成為深層角膜病變行板層角膜移植的良好替代品。以離體角膜為載體進行口腔黏膜上皮片的移植培養(yǎng),結果表明上皮細胞可向角膜表面遷移生長,從而實現角膜的再上皮化[14-15]。Irani等[16]使用多孔硅膜裝載COMECs重建干細胞龕,多孔硅膜具有生物相容性,可通過表面修飾來促進降解和細胞附著,并且可以裝載蛋白質和生長因子。多孔硅支架上擴增得到的COMECs形態(tài)及表型良好,并可成功移植至活體大鼠眼內。Yazdani等[17]則對透明質酸水凝膠支架進行了優(yōu)化,通過Ⅳ型膠原涂層促進干細胞附著,培養(yǎng)得到的COMECs細胞片可用于眼表重建。新型培養(yǎng)載體為COMECs的培養(yǎng)提供了新的方式與研究思路,但仍需進一步進行臨床試驗以證明其可行性。

1.2 培養(yǎng)條件

除培養(yǎng)載體外,能提供適宜生長因子的培養(yǎng)條件也十分重要。COMECs標準培養(yǎng)條件通常需要小鼠來源3T3飼養(yǎng)層和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),但為了避免污染,無動物源性成分的培養(yǎng)條件也得到了大量研究。

1.2.1飼養(yǎng)層 3T3飼養(yǎng)層可促進表皮干細胞的長期存活和連續(xù)擴增,因此廣泛應用于COMECs的培養(yǎng)。考慮到動物源性感染或未知病原體的傳播風險,各種人類來源飼養(yǎng)細胞,如真皮成纖維細胞、骨髓間充質干細胞和結膜成纖維細胞,已作為替代細胞應用至研究中。最新的研究表明,人角膜緣龕細胞(limbal niche cells,LNCs)也是一種優(yōu)良的飼養(yǎng)細胞。作為角膜緣龕的主要成分,LNCs具有間充質和胚胎干細胞的表型特征,可支持LSCs的自我更新,且在兔模型中證明可有效預防LSCD[18]。與培養(yǎng)的角膜上皮細胞相比,COMECs在3T3飼養(yǎng)層的存在下會表達更多的促血管生成因子,而LNCs可降低COMECs的血管生成潛能[19-20]。研究表明,外泌體miRNAs介導的細胞間信號轉導可能是LNCs滋養(yǎng)的COMECs抑制血管生成的重要因素,其具體機制有待進一步研究[21]。此外,大鼠LNCs可在體外誘導COMECs轉分化,使其形成角膜上皮樣細胞,并表達角膜特異性標記CK12和Pax6。

1.2.2血清 除飼養(yǎng)細胞外,FBS是COMECs培養(yǎng)過程中促進其黏附和增生的關鍵成分。使用FBS同樣具有感染的風險,而自體血清可避免這種問題。研究表明自體血清在培養(yǎng)過程中對于上皮細胞未分化狀態(tài)的維持要優(yōu)于FBS[4]。Ang等[22]發(fā)現添加自體血清的培養(yǎng)基能有效促進COMECs的增生,并成功將細胞片應用到了臨床。此外,人血小板衍生物PLTMax也已作為FBS替代物應用于COMECs的培養(yǎng),PLTmax的添加能促進分離細胞的黏附,取得了良好的實驗結果[23]。

1.2.3無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系 盡管飼養(yǎng)細胞和血清的使用極大促進了上皮細胞片的研究,但微生物感染的可能性以及培養(yǎng)方案難以標準化,均阻礙了培養(yǎng)系統(tǒng)的廣泛使用,而開發(fā)無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系成為理想的選擇。Ilmarinen等[1]在不使用血清和3T3飼養(yǎng)細胞條件下,利用Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板成功培養(yǎng)了COMECs細胞片。Nakamura等[24-25]利用添加了多種生長因子的DMEM/F12和defined K-SFM混合培養(yǎng)基,培養(yǎng)出包含全克隆型干細胞的功能性COMECs,并成功移植到兔角膜表面。Dhamodarn等[26]將上皮組織置于去上皮羊膜上,在含有自體血清的人角膜上皮生長培養(yǎng)基中進行組織塊培養(yǎng),結果顯示該方案可促進COMECs向角膜細胞系分化。Oliva等[27]則使用添加了牛腦垂體提取物的DMEM/BEGM混合培養(yǎng)基,發(fā)現COMECs融合并形成復層片狀細胞片,且形態(tài)和表型與使用血清和飼養(yǎng)層的對照組相近。由此可見,無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系具有廣闊的應用空間,今后應進一步探索最適宜的COMECs標準化培養(yǎng)條件。

1.3 培養(yǎng)技術

除載體和培養(yǎng)條件外,培養(yǎng)中涉及到的各項技術也對上皮細胞片的質量至關重要。良好培養(yǎng)技術的運用可減少組織的取材量,提高細胞片的機械性能,且可將細胞片保存再利用,為基礎研究及臨床應用提供便利。

1.3.1酶解法與組織塊培養(yǎng)法 目前,口腔黏膜上皮細胞片的培養(yǎng)主要有酶解法和組織塊培養(yǎng)法,其中酶解法的使用更為廣泛。酶解法使用單細胞懸浮技術,將口腔黏膜組織用中性蛋白酶Ⅱ以及胰蛋白酶-EDTA處理成單細胞后播種于培養(yǎng)基,經培養(yǎng)使其形成細胞片。Hsueh等[23]發(fā)現利用膠原酶分離細胞可保留上皮基底膜,而細胞與基底膜間的相互作用可調節(jié)細胞增生。Rovere等[28]則將膠原酶運用于細胞片與培養(yǎng)皿的分離,認為其可提供具有足夠抗性及黏附性的COMECs。

由于細胞片的制造需要將細胞高密度播種,而大面積切除口腔黏膜組織會導致嚴重的口腔疼痛、不適及瘢痕。與酶解法不同,組織塊培養(yǎng)法將組織碎片接種于培養(yǎng)皿,上皮細胞從碎片邊緣遷移并增生,可產生足夠數量的上皮細胞,因此僅需少量供體組織即可培養(yǎng)為上皮細胞移植物應用于再生醫(yī)學。Morino等[29]在角質形成細胞培養(yǎng)基中進行原代組織塊培養(yǎng),再用胰蛋白酶-EDTA進行處理后將細胞播種在溫敏性培養(yǎng)皿中,傳代后通過降溫獲取無載體細胞片。實驗表明利用組織塊培養(yǎng)法得到的細胞片與酶解法無明顯差異,而前者的高播種密度增加了細胞片的獲取成功率,并縮短了所需的培養(yǎng)時間。

1.3.2氣-液界面培養(yǎng)法 氣-液界面培養(yǎng)法是一種通過降低培養(yǎng)基高度,使細胞暴露于空氣從而促進其分化及分層的技術,可增加細胞片的機械強度。這種方法在LSCs的培養(yǎng)中得到了很好的研究,并運用于大多數的COMECs培養(yǎng)。與非氣-液界面培養(yǎng)得到的2～5層COMECs細胞片相比,氣-液界面培養(yǎng)下可獲得4～9層的復層細胞片[30]。而當前對于此方法的應用仍存在爭議,贊同的觀點認為其可促進細胞的遷移、增生、上皮分層并增強細胞的屏障功能,反對的觀點則認為其可誘導鱗狀化生并使干細胞逐漸損失及分化[2]。因此,在使用COMECs進行角膜再生時,氣-液界面培養(yǎng)技術的潛在優(yōu)勢是否大于劣勢還有待研究。

1.3.3凍存再培養(yǎng)技術 在LSCD治療期間,凍存技術有利于組織或細胞的保存以備再次手術的需要。Promprasit等[31]將混合了DMSO、丙二醇及FBS的DMEM作為凍存劑,通過高濃度凍存劑和高降溫速率結合的玻璃化冷凍過程來減少滲透和有毒有害影響。該研究將組織凍存2個月后復蘇再培養(yǎng),結果表明凍存組織培養(yǎng)片的干細胞和分化細胞的形態(tài)及標志表達與新鮮組織相似,但培養(yǎng)上皮片移植的結果仍有待深入研究。Morino等[29]使用CELLBANKER1凍存培養(yǎng)基,將上皮細胞凍存3個月后復蘇,細胞存活率大于80%,將其在溫敏性培養(yǎng)皿培養(yǎng)后成功得到了細胞片。Oliva等[32]用不同凍存劑將COMECs玻璃化冷凍并保存,結果表明乙二醇和DMSO組成的溶劑會導致p63表達的缺失,而COMECs在液氮中凍存后形態(tài)及表型保持良好,證明其可以在液氮中長期保存。

2 口腔黏膜上皮移植的臨床應用

臨床上雙側LSCD遠比單側疾病常見,而應用非角膜緣組織在雙側LSCD病例中進行自體移植,可避免與同種異體移植相關的問題。在所有治療性非角膜緣細胞類型中,COMET已在世界范圍內得到了廣泛應用。

2.1 口腔黏膜上皮移植的優(yōu)勢

臨床上,LSCD治療成功的標準包括:穩(wěn)定透明角膜上皮的重建、角膜結膜化/血管化的消退以及持續(xù)性上皮缺損的修復。在一項比較研究中,接受同種異體培養(yǎng)角膜緣上皮移植的患眼中約一半視覺明顯改善,而接受COMET的患眼中則達68%[33]。Dobrowolski等[34]對17例無虹膜患眼行COMET并隨訪12～18個月,術后76.4%患眼有規(guī)則的透明上皮,88.2%的病例視力有所提高。Prabhasawat等[35]對COMET術后20例患者20眼平均隨訪31.9個月,75%取得了臨床成功,患者不適、結膜炎癥和纖維血管組織形成明顯減少,70%患者術后視力提高。對2004-2019年已發(fā)表病例的綜述顯示,70.8%的LSCD患眼在COMET術后可獲得穩(wěn)定的眼表[30]。2021年6月,全球首個用于LSCD治療的COMET產品Ocural?在日本上市,已成功應用于臨床眼表移植且術后并發(fā)癥少[36]。由此可見,COMET是LSCD患者有效的治療方式。

針對伴有明顯角膜混濁和/或內皮功能障礙的嚴重LSCD,通常在COMET手術恢復眼表穩(wěn)定后行穿透性角膜移植術(penetrating keratoplasty,PKP),以獲得更佳的角膜透明度。Baradaran-Rafii等[37]評估了化學燒傷所致的雙側LSCD患者行兩步法手術的中期療效,術后平均隨訪28.2個月,14只患眼中有13只術后眼表穩(wěn)定,無上皮缺損,無明顯新生血管形成,移植物總存活率和無排斥存活率分別為92.9%和69.2%。在另一項研究中,對1例具有10年化學燒傷病史、雙眼Roper-Hall 4級的患者行COMET及PKP系列手術,成功恢復了一側眼的視功能,證明了手術方式對晚期LSCD患者視覺功能恢復的有效性[38]。

2.2 口腔黏膜上皮移植的不足

COMET治療LSCD的有效性和安全性已被基礎實驗和臨床試驗證明,然而仍有多種因素會導致移植的失敗。首先,COMET術后新生血管生成及持續(xù)性角膜上皮缺損(persistent corneal epithelial defects,PED)發(fā)生率較高。多項研究表明口腔黏膜細胞比角膜緣細胞具有更大的血管生成潛能,導致移植后對新生血管的抑制能力相對較弱[39]。術后PED的發(fā)生率與術前PED密切相關。有研究提出術后PED與COMECs抗氧化能力弱及黏附相關分子表達低有關[40]。COMET術后常見的并發(fā)癥為瞼球粘連,初診為瘢痕性眼表疾病的患者行再次修復手術的概率最高,而對于術前即患瞼球粘連或眼瞼異常的患者,角膜移植的風險較高[41-42]。此外,結膜微生物菌群具有導致術后感染的可能,受損眼表缺乏正常結膜組織,加上免疫機制的減弱,可導致?lián)p傷的加劇[43]。而盡管口腔黏膜上皮與角膜緣上皮表達相似的基因標志物,兩者的形態(tài)、功能和微環(huán)境仍存在差異。在當前的臨床研究中,COMET后上皮細胞仍維持口唇黏膜的表型,可能會導致上皮增厚,視覺效果不佳[44]。

總體來說,COMET能在嚴重LSCD患者中實現眼表上皮的持續(xù)重建,但需注意術后并發(fā)癥的防護。術前行結膜菌群培養(yǎng)及抗感染治療,術后進行PED和新生血管管理,術前術后及時糾正眼瞼異常,可能會進一步提高此類手術的臨床療效。

3 展望

COMET已成為臨床領域治療LSCD的重要方法,但不同研究中培養(yǎng)方式的差異性以及臨床應用中可能出現的移植并發(fā)癥,都對COMECs培養(yǎng)的進一步優(yōu)化提出了要求。建立上皮細胞片培養(yǎng)、儲存、質量評估和標本運輸的標準化體系,培養(yǎng)符合GMP標準的口腔黏膜上皮細胞片,探究良好的體內誘導口腔黏膜上皮轉分化方案,將有利于未來COMET臨床療效的提升。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突