金婧彧，王頡，吳紫茼，鎖然，馬倩云，張彤，馮佳齊，劉亞瓊

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

海灣扇貝（Argopeten iradians），別名大西洋內(nèi)灣扇貝，是我國最重要的海水養(yǎng)殖貝類之一[1]。扇貝閉殼肌即扇貝柱，是一種集食、藥、滋補(bǔ)為一體的重要水產(chǎn)品[2]。扇貝肉質(zhì)鮮美可口，主要營養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)，還含有?；撬?、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、膽堿、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老等多種生物功能[3]。海灣扇貝捕撈后，在微生物和體內(nèi)酶的作用下極易發(fā)生腐敗變質(zhì)，失去食用價(jià)值，直接影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，新鮮扇貝柱通常采用凍藏保存。隨著人們生活節(jié)奏的加快，即烹食材越來越受到消費(fèi)者的青睞，但未經(jīng)處理的冷藏水產(chǎn)品保鮮期短、極易敗壞，存在潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

超高壓（ultra-high pressure，UHP）技術(shù)是一種非熱加工處理方式，以水、油等液體作為媒介傳遞壓力，在100 MPa～1 000 MPa超高壓條件下處理食品，會(huì)導(dǎo)致食品中的微生物菌體死亡及蛋白質(zhì)變性等，從而達(dá)到殺菌保鮮的目的[4]。與傳統(tǒng)熱處理相比，超高壓技術(shù)既可以殺滅食品中的微生物、鈍化酶的活性，還可以較好地保持食品原有的品質(zhì)和營養(yǎng)成分。目前超高壓技術(shù)在魚糜加工、協(xié)助貝類脫殼和保鮮等方面均有廣泛應(yīng)用[5]。 王匯川等[6]研究壓力 200、300、400 MPa，保壓時(shí)間5、10 min的超高壓條件對鱸魚魚糜品質(zhì)和凝膠特性的影響，結(jié)果表明，在300 MPa/10 min時(shí)鱸魚魚糜品質(zhì)改善程度最大，較熱處理有顯著提升，是一種比較合適的處理?xiàng)l件。葉韜等[7]利用超高壓技術(shù)對中華絨螯蟹進(jìn)行輔助脫殼處理，結(jié)果表明，適宜工藝參數(shù)為壓力440 MPa，時(shí)間16 min，溫度60℃，此時(shí)分割得率為34.24%，產(chǎn)品品質(zhì)得分為42.50。趙宏強(qiáng)等[8]研究超高壓處理對冷藏鱸魚片品質(zhì)及組織結(jié)構(gòu)變化的影響，在 200、250、300 MPa，保壓時(shí)間為 9 min 的超高壓條件下測定菌落總數(shù)、pH值、持水率、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、質(zhì)構(gòu)等指標(biāo)，結(jié)果表明，超高壓處理能抑制樣品的脂肪氧化和微生物生長，但會(huì)對樣品外觀、色澤及持水力產(chǎn)生不利影響；250 MPa、9 min超高壓處理的綜合評(píng)價(jià)效果相對較好，鱸魚片的冷藏貨架期能至少延長4 d。然而超高壓處理后海灣扇貝柱在冷藏過程中品質(zhì)與蛋白質(zhì)氧化的研究較少。

因此，本研究中以海灣扇貝柱為原料，測定新鮮海灣扇貝柱在凍藏過程中和經(jīng)超高壓處理后的海灣扇貝柱在4℃冷藏過程中，其菌落總數(shù)、TVB-N、色澤、羰基、總巰基和活性巰基含量以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 的變化規(guī)律，旨在為超高壓處理海灣扇貝柱的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮海灣扇貝：2020年10月捕撈于河北省秦皇島市。將剝殼后的海灣扇貝柱清洗后挑選，平均直徑為（15.0±0.5）mm，平均高度為（20.0±0.5）mm，平均質(zhì)量為（5.0±1.0）g。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；鹽酸胍、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNHP）、三氯乙酸、鹽酸、氯化鈉、乙二胺四乙酸、尿素、氧化鎂、三氯乙酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、硼酸：天津新通精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；Tris-甘氨酸電泳緩沖液（5×）、戊二醛固定液（2.5%）：北京雷根生物技術(shù)有限公司；彩色預(yù)染蛋白Maker：上海威奧生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液（還原，5×）、G250蛋白快速染色試劑：康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP 600MPa/5L超高壓設(shè)備：天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；CR-400色彩色差計(jì)：柯尼卡美能達(dá)控股公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱：太倉市科教器材廠；K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；CP214電子分析天平：奧斯豪儀器（上海）有限公司；JY300C電泳儀：北京君意設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

將新鮮的海灣扇貝柱隨機(jī)分成兩組（5kg/組），一組未經(jīng)任何處理于-18℃凍藏（對照組，CK），一組裝入聚乙烯袋子后真空包裝，放置于超高壓設(shè)備中的壓力腔內(nèi)，以水為壓力介質(zhì)，在常溫下，對其進(jìn)行600 MPa/5 min的超高壓處理（處理組，UHP）。每10 d對兩組樣品進(jìn)行指標(biāo)測定，所有樣品應(yīng)盡快完成各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.3.2 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)的測定采用平板計(jì)數(shù)法，具體操作參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》。

1.3.3 TVB-N含量測定

TVB-N含量按照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中自動(dòng)凱氏定氮儀法的操作方法進(jìn)行測定。

1.3.4 色澤測定

使用色彩色差計(jì)對海灣扇貝柱的顏色進(jìn)行測定，色彩色差計(jì)使用前應(yīng)該先進(jìn)行白板校正，然后再對樣品進(jìn)行測定。分別記錄樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*），每次對10個(gè)樣品進(jìn)行測定?；谝陨蠝y得的數(shù)據(jù)計(jì)算出樣品總顏色的變化（ΔE*），ΔE*計(jì)算公式如下。

式中：L0*、a0*、b0*為新鮮海灣扇貝柱的初始色澤參數(shù)；L*、a*、b*為經(jīng)過處理后海灣扇貝柱的色澤參數(shù)。

1.3.5 肌原纖維蛋白提取

海灣扇貝柱肌原纖維蛋白的提取參考姜晴晴[9]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取5 g樣品，按1:10（g/mL）與緩沖溶液A[20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA），pH7.0]混合均勻，均質(zhì) 1 min，離心（4℃，10 000 r/min，10 min）后取沉淀，重復(fù)上述操作兩次。將兩次沉淀混合并加入緩沖溶液B（25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，含 0.6 mol/L NaCl，pH7.0），勻漿后冰浴2 h，過濾除去不溶性部分，所得濾液即為肌原纖維蛋白溶液，肌原纖維蛋白溶液儲(chǔ)存在4℃冰箱不超過72 h。以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙縮脲法測定蛋白濃度，并用緩沖溶液B調(diào)節(jié)蛋白濃度。

1.3.6 羰基含量測定

參考石徑[10]的方法并作適當(dāng)修改，測定肌原纖維蛋白的羰基含量。將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL，取0.2mL的蛋白稀釋液加入0.4mL的DNHP，混合均勻后于37℃避光反應(yīng)1h，每隔10min振蕩1次。加入0.5mL的20%三氯乙酸溶液，混合均勻后離心（10 000 r/min，10 min，4℃）棄上清液，沉淀用1 mL乙醇和乙酸乙酯混合液（1:1，體積比）洗滌3次，然后在沉淀中加入3 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L），370 nm處測定吸光度?？瞻子?.2 mL鹽酸（2 mol/L）代替蛋白稀釋液，試驗(yàn)重復(fù)3次。羰基含量的計(jì)算公式如下。

式中：A370為370 nm處的吸光度；D為稀釋倍數(shù)；ε為分子吸光系數(shù)，22 000 L/（mol·cm）；C為肌原纖維蛋白溶液的濃度，mg/mL。

1.3.7 總巰基和活性巰基含量測定

總巰基含量的測定根據(jù)Wei等[11]的方法并作適當(dāng)修改。將肌原纖維蛋白溶液用緩沖溶液B稀釋至1 mg/mL，取0.5 mL的蛋白稀釋液于離心管中，加入4 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素，pH7.0），混合均勻后，加入0.5 mL 10 mmol/L 2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DTNB），充分混勻，在4℃條件下避光反應(yīng)1 h，然后于412 nm處測定吸光度。測定活性巰基含量時(shí)去掉磷酸緩沖液中的尿素，其余步驟同上，每個(gè)樣品做3次平行。巰基含量計(jì)算公式如下。

式中：A412為412 nm處的吸光度；D為稀釋倍數(shù)11；ε為摩爾消光系數(shù)，13 600 L/（mol·cm）；C為肌原纖維蛋白溶液的濃度，mg/mL。

1.3.8 SDS-PAGE測定

參考李長樂等[12]的方法并作適當(dāng)修改，將肌原纖維蛋白溶液稀釋至2 mg/mL，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳電壓為120 V。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色1 h，脫色至背景清晰，用凝膠成像系統(tǒng)對電泳圖譜進(jìn)行掃描分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan檢驗(yàn)，并用Origin 2018版進(jìn)行圖表繪制。數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的變化

食品中微生物的生長繁殖會(huì)導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，因此菌落總數(shù)可以直接用來評(píng)價(jià)水產(chǎn)品的品質(zhì)好壞，是衡量新鮮度的一個(gè)重要指標(biāo)。新鮮的水產(chǎn)品菌落總數(shù)可接受上限為7 lg（CFU/g）[13]，超過這個(gè)上限就被判定為水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。海灣扇貝柱在貯藏過程中菌落總數(shù)的變化趨勢如圖1所示。

圖1 海灣扇貝柱貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig.1 Changes in aerobic bacterial count of Argopecten irradians adductor muscle during storage

從圖1中可以看出，對照組樣品第0天時(shí)菌落總數(shù)為3.34 lg（CFU/g），經(jīng)超高壓處理后，海灣扇貝柱的菌落總數(shù)降低，降低至1.81 lg（CFU/g）。這表明超高壓處理能夠有效地殺滅海灣扇貝柱中的部分微生物并抑制酶的活性，提高海灣扇貝柱的食用安全性。超高壓處理會(huì)使微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變，從而引起微生物死亡，菌落總數(shù)減少[14]。隨著貯藏時(shí)間的延長，海灣扇貝柱中的微生物大量繁殖，菌落總數(shù)均呈上升的趨勢，對照組樣品貯藏90 d后菌落總數(shù)達(dá)到4.88 lg（CFU/g），超高壓處理組樣品貯藏90 d后菌落總數(shù)為5.71 lg（CFU/g），均低于規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，超高壓處理能夠有效地抑制微生物的生長繁殖，保證冷藏海灣扇貝柱的食用安全性。

2.2 TVB-N含量的變化

TVB-N含量的多少能夠直接反映水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的程度，是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品新鮮度的一個(gè)重要參數(shù)，TVB-N的含量越高，水產(chǎn)品腐敗越嚴(yán)重。海灣扇貝柱在貯藏過程中TVB-N含量的變化如圖2所示。

圖2 海灣扇貝柱在貯藏過程中TVB-N含量的變化Fig.2 Changes in TVB-N content of Argopecten irradians adductor muscle during storage

從圖2中可以看出，對照組樣品的初始TVB-N含量在3.03 mg/100 g左右，經(jīng)超高壓處理后海灣扇貝柱的TVB-N含量降低，減少了28.79%。TVB-N含量的減少可能是由于較高的壓力使得揮發(fā)性鹽基氮中的一些物質(zhì)隨著水分的流失而減少[15]。隨著貯藏時(shí)間的延長，對照組樣品和處理組樣品的TVB-N含量均呈現(xiàn)增加的趨勢。根據(jù)GB 2733—2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》的規(guī)定，我國冷凍貝類中的TVB-N含量應(yīng)低于15 mg/100 g。貯藏結(jié)束后，對照組樣品和處理組樣品的TVB-N含量分別達(dá)到11.20、11.99 mg/100 g，仍在規(guī)定的限量范圍之內(nèi)。以上結(jié)果表明，超高壓處理能夠顯著抑制海灣扇貝柱冷藏過程中TVB-N的生成，減緩其腐敗變質(zhì)。

2.3 色澤的變化

色澤是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，直接影響著水產(chǎn)品的外觀，也是決定消費(fèi)者可接受度的一個(gè)主要因素。海灣扇貝柱在貯藏過程中L*、a*、b*、ΔE*值的變化如表1所示。

由表1可知，超高壓處理后海灣扇貝柱的顏色發(fā)生明顯變化，L*值和b*值高于未處理樣品，這可能是因?yàn)槌邏禾幚砗蠛成蓉愔鞍踪|(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致其表面顏色發(fā)生變化。隨著貯藏時(shí)間的延長，對照組樣品的L*值呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，b*值呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，a*值沒有明顯的變化，說明凍藏的時(shí)間越長，海灣扇貝柱被氧化的程度越大，顏色越暗；而處理組樣品的L*值和b*值隨貯藏時(shí)間延長呈上升趨勢，a*值逐漸降低。處理組和對照組樣品的總色差（ΔE*）變化趨勢相同，均隨貯藏時(shí)間的延長色澤變化越來越明顯[16]。綜上所述，超高壓處理顯著提高了海灣扇貝柱的亮度，但隨著貯藏時(shí)間的延長，海灣扇貝柱的顏色可能會(huì)由于蛋白質(zhì)的氧化變性、脂肪的氧化以及色素降解等反應(yīng)而發(fā)生一定程度的變化，從而導(dǎo)致消費(fèi)者的可接受程度下降[17]。

表1 海灣扇貝柱貯藏過程中顏色的變化Table 1 Changes in color of Argopecten irradians adductor muscle during storage

2.4 羰基含量的變化

蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)氧化的一個(gè)顯著特性，羰基是蛋白質(zhì)氧化過程中重要的生成物[18]。因此，蛋白質(zhì)羰基含量通常被用來表示蛋白質(zhì)氧化的程度，含量越高表明蛋白質(zhì)氧化程度越大，是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)氧化最常用的一個(gè)重要指標(biāo)。海灣扇貝柱貯藏過程中肌原纖維蛋白羰基含量變化如圖3所示。

圖3 海灣扇貝柱貯藏過程中羰基含量的變化Fig.3 Changes in carbonyl content of Argopecten irradians adductor muscle during storage

由圖3可以看出，海灣扇貝柱肌原纖維蛋白的羰基含量隨著貯藏時(shí)間的延長呈逐漸升高的趨勢。表明兩組樣品在貯藏過程中蛋白質(zhì)均發(fā)生了一定程度的氧化，并且貯藏時(shí)間越長，蛋白質(zhì)氧化程度越嚴(yán)重。對照組樣品的羰基含量由最初的4.54 nmol/mg增長至14.12 nmol/mg，處理組樣品的羰基含量由8.70 nmol/mg增長至17.86 nmol/mg，分別增長了2.11倍和1.05倍。羰基含量的增加說明海灣扇貝柱在貯藏期間發(fā)生了明顯的蛋白氧化，經(jīng)超高壓處理后海灣扇貝柱的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生改變，肌原纖維蛋白發(fā)生聚集和折疊，表征為羰基含量上升[19]。結(jié)果表明，超高壓處理在一定程度上會(huì)導(dǎo)致海灣扇貝柱在貯藏過程中肌原纖維蛋白的變性和氧化。

2.5 總巰基和活性巰基含量的變化

巰基是水產(chǎn)品蛋白質(zhì)中最具活性的功能性基團(tuán)，對于穩(wěn)定肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)具有重要作用[20]，可以通過測定貯藏過程中海灣扇貝柱總巰基和活性巰基含量的變化來反映其蛋白質(zhì)氧化程度。貯藏過程中海灣扇貝柱肌原纖維蛋白總巰基與活性巰基含量變化趨勢如圖4所示。

由圖4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，總巰基與活性巰基含量均呈下降趨勢，與貯藏第0天相比，貯藏結(jié)束時(shí)，對照組和處理組樣品的總巰基含量分別減少了68.45%和90.91%，活性巰基的含量分別減少了91.84%和93.05%。總巰基和活性巰基含量下降是因?yàn)榧∏虻鞍最^部區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，并且蛋白質(zhì)在氧化過程中空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，巰基被暴露，極易氧化生成二硫鍵等化合物，導(dǎo)致巰基含量的降低[21]。結(jié)果表明，超高壓處理組和凍藏對照組樣品在貯藏期間均易產(chǎn)生蛋白質(zhì)氧化。

圖4 海灣扇貝柱在貯藏過程中總巰基和活性巰基含量的變化Fig.4 Changes in total and reactive sulfhydryl content of Argopecten irradians adductor muscle during storage

2.6 SDS-PAGE電泳

肌原纖維蛋白又稱為鹽溶性蛋白，主要有肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，220 kDa）、肌動(dòng)蛋白（actin，AC，42 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）、肌原蛋白（33 kDa） 和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC，17 kDa）等，其中肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白是最重要的兩個(gè)條帶。在貯藏過程中海灣扇貝柱肌原纖維蛋白的SDS-PAGE譜圖如圖5所示。

圖5 海灣扇貝柱在貯藏過程中的SDS-PAGE電泳譜圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoregram of Argopecten irradians adductor muscle during storage

從圖5a可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，對照組樣品的220 kDa（肌球蛋白重鏈）、97 kDa（副肌球蛋白）以及42 kDa（肌動(dòng)蛋白）條帶在一定程度上變淺，并且在肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白附近出現(xiàn)了新的小分子量條帶，這表明凍藏會(huì)引起肌原纖維蛋白氧化，降解為小分子的蛋白或者多肽甚至游離氨基酸，在電泳圖譜上表現(xiàn)為蛋白條帶變淺；而超高壓處理組樣品（圖5b）肌球蛋白重鏈條帶消失，說明超高壓處理使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，并隨著貯藏時(shí)間的延長，處理組樣品的97 kDa（副肌球蛋白）及36 kDa（原肌球蛋白）條帶逐漸變淺，說明肌原纖維蛋白在冷藏過程中發(fā)生了降解。綜上表明，超高壓對冷藏期間海灣扇貝柱蛋白質(zhì)降解有一定的抑制作用，可以緩解海灣扇貝柱品質(zhì)的劣化。

3 結(jié)論

超高壓處理能夠有效保證新鮮海灣扇貝柱的冷藏安全性，真空包裝新鮮海灣扇貝柱經(jīng)600 MPa/5 min超高壓殺菌后，在4℃貯藏90 d過程中，菌落總數(shù)和TVB-N含量均未超標(biāo)，接近冷凍保鮮效果；隨貯藏時(shí)間延長，處理組樣品L*值和b*值增加，而對照組冷凍樣品L*值減少，b*值增加；處理組樣品肌原纖維蛋白的羰基含量上升，總巰基和活性巰基含量下降，表明超高壓處理在一定程度上能夠減少海灣扇貝柱在冷藏過程中肌原纖維蛋白的變性和氧化。綜合考慮，超高壓處理可以為新鮮海灣扇貝柱的冷藏保鮮提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。