景永帥，孫麗叢，張瑞娟，代立霞，李蘭，張丹參，吳蘭芳，國旭丹*

（1.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.石家莊市中醫(yī)院肛腸科，河北 石家莊 050051；3.河北中醫(yī)學院 藥學院，河北 石家莊 050200）

玉竹為百合科植物玉竹 [Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的干燥根莖[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，是常用的藥食兩用資源，具有生津止燥、養(yǎng)陰清咳等功效，其富含多糖、黃酮、生物堿和強心苷等物質(zhì)[2]。玉竹多糖作為其主要的活性成分之一，具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、降血糖[5]、調(diào)節(jié)血脂[6]等作用。

近年來，越來越多的研究表明，多數(shù)非淀粉植物多糖不能完全被消化道降解，進而到達結腸，被腸道微生物發(fā)酵利用，并且產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機體代謝[7]。但也有數(shù)據(jù)表明，人體消化液對于多糖的結構依舊存在一定的影響，可部分降解多糖[8]。故探究多糖在消化過程中的結構變化和對機體的作用方式顯得尤為重要。消化試驗最好方式是直接在生物體內(nèi)進行，但由于消化系統(tǒng)的復雜性及試驗成本等方面原因，大多數(shù)情況都是選擇體外試驗模擬體內(nèi)消化的方式進行，體外模擬已成為模擬人體內(nèi)消化吸收過程的有效途徑和趨勢[7]。近年來，對玉竹多糖的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化、分離純化、單糖組成及藥理活性等方面，而對玉竹多糖在體內(nèi)外消化和酵解的研究鮮見。

本研究旨在運用體外模擬消化系統(tǒng)和腸道微生物模型探究玉竹多糖消化過程中的變化，探究玉竹多糖發(fā)揮功能特征的作用機理，為相關產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉竹：安國墨源中藥材公司，經(jīng)河北中醫(yī)學院藥學院鄭玉光教授鑒定為百合科植物玉竹[Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的根莖；甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白酶（200 U/mg）、脂肪酶（200 U/mg），胃蛋白酶（500 U/mg）、α-淀粉酶（1 000 U/mg）：分析純，深圳市振芯嘉貿(mào)易有限公司；牛肉浸膏、硫酸銨，硫酸錳（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-2電熱恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏華儀器廠；752紫外可見分光光度儀：上海光譜儀器有限公司；ME204E/02電子秤：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-SG46-280SA立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TGL-15B高速離心機：上海安亭科學儀器廠；S-100傅里葉變換紅外光譜儀：德國珀金埃爾默公司；LC1220高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；THZ臺式恒溫振蕩器：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉竹多糖的提取

取玉竹，粉碎，過30目篩，25倍無水乙醇冷浸24h，除去脂溶性成分，抽濾后，藥渣通風處干燥，干燥后密封保存，備用。干燥粉末按固液比1:50（g/mL）加入蒸餾水，85℃水浴提取3 h，提取2次，合并液濾，濃縮至濾液體積1/4，用5倍體積的無水乙醇醇沉，靜置過夜，抽濾，回收沉淀，干燥后即得玉竹粗多糖。

1.3.2 體外模擬唾液消化

模擬唾液：根據(jù)文獻[9]配制模擬唾液消化液，稱取α-淀粉酶0.215 5 g加入到250 mL唾液電解質(zhì)（pH值為6.9）中溶解，磁力攪拌20 min后過濾，濾液中再加入250 mL的唾液電解質(zhì)溶液混勻，放置冰箱備用。取30 mL玉竹多糖溶液和30 mL模擬唾液、30 mL水和30 mL模擬唾液、30 mL多糖溶液和30 mL水的混合物分別加入錐形瓶中。所有錐形瓶在37℃水浴鍋中進行反應，在消化過程中（0.5 h），取出3 mL混合物，浸入沸水浴中使唾液酶失活后分別進行還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖組成及含量的測定。

1.3.3 體外模擬胃液消化

模擬胃液：根據(jù)文獻[9]配制模擬胃液消化液，稱取150 g胃電解質(zhì)溶液，向其中加入35.4 mg胃蛋白酶、37.5 mg胃脂肪酶以及1.5 mL CH3COONa（pH值為5.0、1.0 mol/L），在室溫下磁力攪拌10 min用0.1 mol/L鹽酸溶液將pH值調(diào)至1.5，置于冰箱備用。取30 mL水和30 mL模擬胃液、30 mL多糖溶液和30 mL模擬胃液的混合物分別加入錐形瓶中。所有錐形瓶在37℃臺式恒溫振蕩器（150 r/min）中進行反應，在消化過程中（0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h），取出 3 mL 混合物，浸入沸水浴中使胃蛋白酶失活后分別測定還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖的組成及含量。

1.3.4 體外模擬胃腸消化

模擬腸液：根據(jù)文獻[9]配制模擬腸液消化液，稱取26 mg的胰蛋白酶放置于棕色瓶中，向其中加入100 g胰酶溶液，200 g膽汁以及100 g腸電解質(zhì)溶液（simulated intestinal electrolyte solution，SIE），最后用 0.1 mol/L的NaOH把pH值調(diào)至7.5，置于冰箱中備用。取30 mL模擬胃液和30 mL水、30 mL模擬胃液和30 mL多糖溶液以及30 mL水和30 mL多糖溶液分別加入錐形瓶中，在37℃臺式恒溫振蕩器（150 r/min）中反應6.0 h后，再向錐形瓶中分別加入30 mL模擬腸液，在消化過程中（0.5、1.0、2.0、4.0 和 6.0 h），取出 3 mL 混合物，浸入沸水浴中使胰蛋白酶失活后分別測定還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖的組成及含量。

1.3.5 玉竹多糖對腸道菌群調(diào)節(jié)作用

1.3.5.1 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g牛肉膏，4.0 g酵母提取物，2.0 g檸檬酸氫二銨，20.0 g葡萄糖，2.0 g磷酸氫二鉀，1.6 g硫酸銨，5.0 g乙酸銨，0.2 g硫酸鎂，0.05 g硫酸錳，1 mL吐溫80，去離子水1 000 mL，混勻后保存于4℃下備用。

LB培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母，10.0 g氯化鈉，去離子水1 000 mL，混勻后保存于4℃下備用。

1.3.5.2 菌種活化及生長曲線的測定

將大腸桿菌（大腸埃希氏菌，CGMCC NO.1.1521）和乳桿菌（植物乳桿菌，CGMCC NO.1258）以0.1%接菌量分別接種于LB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基上，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h進行菌種活化。在體積100 mL的液體試驗培養(yǎng)基中分別加入10 mL的0.2 mg/mL的玉竹多糖，并均接種2%的大腸桿菌和乳桿菌菌懸液，37℃下靜止培養(yǎng)，采用比濁法在不同時間間隔（0、0.5、2、4、6、8、16、24、40 h）測定大腸桿菌、乳桿菌的生長曲線，用紫外可見分光光度計在560 nm下測定OD值及pH值，以基礎培養(yǎng)基為空白[10]。以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。同時測定在0、0.5、1.0、2.0、4.0、12.0、24.0 h時的還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖組成。

1.3.6 化學成分分析

玉竹多糖的總糖含量測定采用以葡萄糖為標準的苯酚-硫酸法[11]；玉竹多糖的蛋白質(zhì)含量測定采用以牛血清蛋白為標準的考馬斯亮藍法[12]；還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法。

1.3.7 紅外光譜掃描

采用KBr壓片法，在4 000 cm-1～450 cm-1范圍內(nèi)對玉竹多糖進行紅外光譜掃描[13]。

1.3.8 分子質(zhì)量的測定

采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）對玉竹多糖及其消化后產(chǎn)物進行相對分子質(zhì)量的測定。色譜條件如下：色 譜 柱 TSK-GEL G4000Pwxl，TSK-GEL G2500 Pwxl（10μm）；流動相為超純水，流速0.6mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL。各葡聚糖標準品配制成濃度為1 mg/mL的溶液，按上述色譜條件分析，以保留時間為橫坐標，分子質(zhì)量的常用對數(shù)為縱坐標作圖。根據(jù)保留時間和標準曲線（lgMw=-0.310 8x+11.749 0，R2=0.999 1），計算待測樣品的相對分子質(zhì)量[14]。

1.3.9 單糖組成的測定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對玉竹多糖及消化后產(chǎn)物進行單糖測定。取甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）配制成 1 mg/mL的混合標樣，取0.2 mL于離心管中，分別加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.2 mL，70℃水浴鍋加熱30 min。冷卻后加入0.2 mL 0.3 mol/L的鹽酸，加入1 mL氯仿進行萃取，離心。取上清液重復上述操作3次，稀釋，定容[15]。色譜條件：流動相為0.1 mol/mL磷酸鹽緩沖溶液（pH值為7.0）:乙腈（體積比為83:17），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，紫外檢測波長245 nm，進樣量為20 μL。

精密稱定玉竹多糖20 mg，加入5 mL的2.0 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，110℃下加熱水解6 h。取出，放冷，加入甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去TFA，加入2 mL蒸餾水溶解，即為玉竹多糖的水解液，水解液按上述單糖標品處理方式采用相同色譜條件進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0處理和分析數(shù)據(jù)，使用Origin 8.0和Microsoft Excel 2003作圖。

2 結果與分析

2.1 玉竹多糖的理化性質(zhì)

2.1.1 玉竹多糖的可溶性總糖、蛋白質(zhì)和還原糖含量

總糖含量標準曲線為y=12.392 0x+0.142 9（R2=0.992 0）；蛋白質(zhì)含量標準曲線為y=7.312 9x+0.703 5（R2=0.992 0），還原糖標準曲線為y=0.933 7x+0.173 5（R2=0.995 0）。經(jīng)計算玉竹多糖可溶性總糖含量為77.74%，蛋白質(zhì)含量為3.98%，未在玉竹多糖中檢測到還原糖。

2.1.2 玉竹多糖紅外光譜分析

玉竹多糖紅外光譜結果如圖1所示。

圖1 玉竹多糖的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of P.odoratum polysaccharides

由圖1可知，3 400.55 cm-1附近具有光滑而寬的強吸收峰，此為羥基（O—H）的伸縮振動，2 935.17 cm-1處的吸收峰與甲基或亞甲基的C—H的伸縮振動有關，1 740 cm-1左右吸收峰為酯基（—COOR）中的伸縮振動且吸收較弱，1 644.02 cm-1為O—H彎曲振動吸收峰，1 247.45 cm-1為 C—O 吸收峰，1 375.28 cm-1為C—H內(nèi)彎曲振動，1 024.75 cm-1為醇羥基的變角振動，805.24 cm-1處為α-型糖苷鍵產(chǎn)生的吸收峰。

2.1.3 玉竹多糖的相對分子質(zhì)量

玉竹多糖分子質(zhì)量測定結果如圖2所示。

由圖2可知，玉竹多糖有2種分子質(zhì)量分布，依據(jù)標準曲線（lgMw=-0.310 8x+11.749 0，R2=0.999 1），計算出分子質(zhì)量分別為 1.37×106、6.75×103Da。

圖2 玉竹多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 HPGPC chromatogram of P.odoratum polysaccharide

2.1.4 玉竹多糖的單糖組成分析

玉竹多糖水解后產(chǎn)物的色譜結果如圖3所示。

由圖3可知，玉竹多糖的單糖由Man、GalA、Glc、Gal組成，比例為13.55:2.42:1.00:2.81。

圖3 標準品及玉竹多糖的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of standard and P.odoratum polysaccharides

2.2 玉竹多糖的體外模擬消化試驗

2.2.1 模擬唾液消化

α-淀粉酶是口腔唾液中最主要的蛋白質(zhì)成分，能分解淀粉及其他碳水化合物的α-（1→4）糖苷鍵[16]。模擬唾液消化0.5 h后玉竹多糖還原糖、單糖組成、相對分子質(zhì)量的變化如圖4所示。

圖4 玉竹多糖的體外模擬唾液消化試驗結果Fig.4 Results of the in vitro simulated saliva digestion test of P.odoratum polysaccharide

由圖4A可知，多糖和模擬唾液本身不含還原糖，經(jīng)唾液消化后，吸光度并未發(fā)生明顯變化，沒有產(chǎn)生還原糖；由圖4B可以看出，多糖水溶液和模擬唾液不含游離單糖，消化后并沒有產(chǎn)生游離的單糖；由圖4C可知，相對于多糖水溶液，經(jīng)唾液消化后的多糖的分子質(zhì)量分布并未發(fā)生變化。以上結果說明，玉竹多糖不能被模擬唾液消化，與鼠尾藻多糖體外模擬唾液消化試驗結果一致[17-18]。

2.2.2 模擬胃液消化

模擬胃液消化 0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h 后玉竹多糖的還原糖、單糖組成、相對分子質(zhì)量的變化如圖5所示。

圖5 玉竹多糖的體外模擬胃液消化試驗結果Fig.5 Results of the in vitro simulated gastric juice digestion test of P.odoratum polysaccharide

由圖5A可知，多糖和模擬胃液本身不含還原糖，經(jīng)胃液消化后，吸光度并未發(fā)生明顯變化，沒有產(chǎn)生還原糖；由圖5B可以看出，多糖水溶液和模擬胃液不含游離單糖，消化后并沒有產(chǎn)生游離的單糖；由圖5C可知，玉竹多糖有2種分子質(zhì)量分布，模擬胃液有2種分子質(zhì)量分布，經(jīng)胃液消化后，相對于多糖溶液和模擬胃液的分子質(zhì)量分布，多糖的分子質(zhì)量分布并未發(fā)生變化；以上結果說明玉竹多糖不能被模擬胃液消化，與桑葚多糖在模擬胃液消化的試驗結果相一致。

2.2.3 模擬胃腸液消化

模擬胃腸液消化 0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h 后玉竹多糖的還原糖、單糖組成和相對分子質(zhì)量的變化結果如圖6所示。

圖6 玉竹多糖的體外模擬胃腸液消化試驗結果Fig.6 Results of the in vitro simulated gastrointestinal fluid digestion test of P.odoratum polysaccharide

由圖6A可知，多糖和模擬胃腸液本身不含還原糖，經(jīng)胃腸液消化后，雖然吸光度值有顯著性變化，但是并沒有產(chǎn)生還原糖；由圖6B可以看出，多糖水溶液不含游離單糖，模擬胃腸液含葡萄糖，經(jīng)胃腸液消化后并沒有產(chǎn)生新的游離單糖；由圖6C可知，與多糖溶液和模擬胃腸液分子質(zhì)量分布對比，經(jīng)胃腸液消化后，多糖的分子質(zhì)量分布并未發(fā)生變化；以上結果說明玉竹多糖不能被模擬胃腸液消化。

綜上所述，經(jīng)唾液、胃液、胃腸液消化后，多糖還原糖、單糖組成、分子質(zhì)量均不發(fā)生變化，說明玉竹多糖在體外模擬胃腸液模型中不被消化。

2.3 玉竹多糖與腸道菌群的相互影響

2.3.1 玉竹多糖對乳桿菌的影響

玉竹多糖對乳桿菌的影響如圖7所示。

圖7 多糖對乳桿菌的影響Fig.7 Effect of polysaccharide on Lactobacillus bulgaricus

由圖7A可以看出，與空白組相比，加入多糖后，乳桿菌的pH值變化不明顯；由圖7B乳桿菌的生長曲線可以看出，在6 h后乳桿菌生長進入對數(shù)生長期，菌數(shù)加速分裂，迅速生長，生長至20 h后，菌種生長基本保持在恒定狀態(tài)，乳桿菌的生長進入穩(wěn)定期，與空白組相比，加入多糖后，OD560值大于空白組，說明玉竹多糖對乳桿菌生長可能存在促進作用。

乳桿菌降解多糖 0.5、1、2、4、12 h 和 24 h 后玉竹多糖中的還原糖、單糖組成和相對分子質(zhì)量的變化結果如圖8所示，由圖8A可知，多糖降解12 h和24 h時，還原糖含量顯著增加（p<0.05，p<0.01），說明乳桿菌可以降解多糖，產(chǎn)生了還原糖；由圖8B可以看出，玉竹多糖經(jīng)乳桿菌作用后，在12 h和24 h時檢測到甘露糖，說明乳桿菌可以降解多糖，進而被機體利用；由圖8C可知，與多糖溶液和乳桿菌分子質(zhì)量分布對比，經(jīng)乳桿菌作用后，在32 min出現(xiàn)新的峰，進一步說明乳桿菌可以降解多糖；以上結果說明玉竹多糖可以被乳桿菌降解。

圖8 玉竹多糖經(jīng)乳桿菌降解試驗結果Fig.8 The results of P.odoratum polysaccharide degradation by Lactobacillus bulgaricus

2.3.2 玉竹多糖對大腸桿菌的影響

玉竹多糖對大腸桿菌的影響結果如圖9所示。

由圖9A的pH值變化可以看出，與空白組相比，加入多糖后，大腸桿菌的pH值變化不明顯；由圖9B大腸桿菌的生長曲線可以看出，在4 h后大腸桿菌生長進入對數(shù)生長期，生長至20 h后，生長進入穩(wěn)定期，與空白組相比，加入多糖后，OD560值小于空白對照組，說明玉竹多糖對大腸桿菌生長存在抑制作用。

圖9 玉竹多糖對大腸桿菌的影響Fig.9 Effect of P.odoratum polysaccharide on Escherichia coli

大腸桿菌降解玉竹多糖 0.5、1、2、4、12 h 和 24 h后其中的還原糖、單糖組成和相對分子質(zhì)量的變化結果如圖10所示。

由圖10A可知，多糖降解4 h和12 h時，還原糖含量顯著增加，說明大腸桿菌可以降解多糖，產(chǎn)生了還原糖；由圖10B可以看出，玉竹多糖經(jīng)大腸桿菌作用后，在4 h和12 h時檢測到甘露糖，這與圖8A結果一致。24 h時，甘露糖的峰消失，說明大腸桿菌可以降解多糖，進而被機體利用，并且降解的多糖可能作為碳源再次被大腸桿菌利用；由圖10C可以看出，與玉竹多糖和大腸桿菌的分子質(zhì)量分布相比，玉竹多糖經(jīng)大腸桿菌作用后，出現(xiàn)了新的峰，進一步說明大腸桿菌可降解玉竹多糖。龔雯等[19]在對金茶花多糖的體外消化及酵解特性研究中發(fā)現(xiàn)，金茶花多糖未被體外模擬胃腸道試驗消化，但能被大腸桿菌等分解利用，與本研究的結果類似。

圖10 玉竹多糖經(jīng)大腸桿菌降解試驗結果Fig.10 The results of P.odoratum polysaccharide degradation by Escherichia coli

綜上所述，玉竹多糖對乳桿菌的生長有促進作用，可抑制大腸桿菌的生長，并且乳桿菌和大腸桿菌可部分降解多糖。

3 結論

玉竹多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖組成，含有2種分子質(zhì)量分布，分別為1.37×106、6.75×103Da。在體外模擬消化系統(tǒng)中，經(jīng)唾液、胃液和胃腸液消化后，發(fā)現(xiàn)多糖分子質(zhì)量沒有變化，而且消化前后的還原糖含量無顯著變化，說明其均不能消化分解玉竹多糖。但是在乳桿菌和大腸桿菌的作用下，玉竹多糖在開始反應時均無單糖生成，隨著時間的變化產(chǎn)生甘露糖，多糖分子質(zhì)量降低，結果表明乳桿菌和大腸桿菌均能部分降解玉竹多糖。兩者不同的是大腸桿菌在分解玉竹多糖后產(chǎn)生的甘露糖能夠被機體再次吸收利用，而乳桿菌則不能；玉竹多糖存在與否對乳桿菌的對數(shù)生長期無明顯影響，但對乳桿菌的生長起到促進作用，而添加玉竹多糖能延長大腸桿菌對數(shù)生長期，但總體上對其增長起到抑制作用。綜上所述，玉竹多糖在體外模擬胃腸道模型中不被消化，但在體外模擬菌種進行消化時能夠被消化，并進一步被機體利用。