肖萍，趙可欣，蔡倩倩，呂晴

（1.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300392；3.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500）

紅茶菌發(fā)酵產(chǎn)品是一種傳統(tǒng)的民間發(fā)酵飲品，因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和生物活性成分，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。紅茶是制作紅茶菌最常用的基質(zhì)，在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)生成有機(jī)酸、酚類(lèi)物質(zhì)、維生素、D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯等多種生物活性成分，因此紅茶菌發(fā)酵液具有抗氧化、提高免疫力、抗癌防癌、降低血清膽固醇和甘油三酯等多種保健功能[2-3]。為了賦予紅茶菌更好的功能特性和特殊風(fēng)味，近年來(lái)將果蔬汁或植物提取物等應(yīng)用于紅茶菌發(fā)酵的研究較多[4-6]。Watawana等[7]在紅茶菌中添加櫻桃花、決明子、紫苑花等10種花草茶，提高了紅茶菌發(fā)酵液的抗氧化活性和α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制活性；Vitas等[8]以蓍草的水提取物和亞臨界水提取物為發(fā)酵基質(zhì)，可以得到感官風(fēng)味更好的紅茶菌發(fā)酵飲品，且其抗氧化活性得到提高。除此之外，通過(guò)紅茶菌的發(fā)酵作用也可以為食品生產(chǎn)中的副產(chǎn)品提供新的利用途徑，如豆制品加工過(guò)程中的廢液——黃漿水，經(jīng)發(fā)酵后總黃酮濃度和抗氧化活性均得到明顯提高[9]；陳巧紅等[10]研究了大豆乳清紅茶菌發(fā)酵液的抑菌性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)。

藜麥為莧科藜屬一年生雙子葉C3植物，起源于南美洲安第斯高原地區(qū)，距今已有7 000多年的栽培歷史。2013年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織宣布該年為“國(guó)際藜麥年”，并將藜麥視為21世紀(jì)應(yīng)對(duì)糧食安全的重要谷物之一[11]。藜麥?zhǔn)侨珷I(yíng)養(yǎng)完全蛋白堿性食物，其主要的營(yíng)養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類(lèi)、維生素和礦質(zhì)元素等。近些年的藜麥產(chǎn)品大多是以藜麥為主要原料來(lái)制作的各種功能性食品，其中發(fā)酵類(lèi)產(chǎn)品是較為重要的一部分，如藜麥乳飲料、藜麥酸奶、藜麥酵素、藜麥啤酒、藜麥面包等[12-16]。

目前，藜麥和紅茶菌這兩種功能性較強(qiáng)的食品已成為研究熱點(diǎn)，但是，將兩者結(jié)合起來(lái)，以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵產(chǎn)品及其功能特性的研究鮮見(jiàn)。因此，本文將以藜麥為發(fā)酵基質(zhì)制備紅茶菌發(fā)酵液，選擇傳統(tǒng)以紅茶為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵液為對(duì)照，對(duì)2種發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)理化指標(biāo)和抗氧化活性進(jìn)行研究分析，以期為藜麥紅茶菌發(fā)酵食品的開(kāi)發(fā)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜麥：金昌西域神話食品有限公司；紅茶：福建正山堂茶葉有限公司；白砂糖：廣州福正東海食品有限公司；紅茶菌菌種：天津農(nóng)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選并保存；MRS肉湯、酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（yeast extract peptone and glucose broth medium，YPD）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、BSC-250恒溫恒濕箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；STARTER3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；KPBV1358攪拌機(jī)：深圳市康佳電器有限公司；LGR20-W高速冷凍離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅茶菌發(fā)酵液的制備

以藜麥為基質(zhì)的紅茶菌發(fā)酵液（quinoa kombucha fermentation broth，QFB）：按照課題組前期優(yōu)化確定的最佳工藝參數(shù)[料液比14:100（g/mL），接種量8%，溫度25℃，加糖量6%]發(fā)酵紅茶菌1 d～5 d后6 480×g離心15 min，上清液即為QFB[17]。

傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵液（traditional kombucha fermentation broth，TFB）：將2g的紅茶茶葉用300mL沸水沖泡，過(guò)濾后加入30 g白砂糖，充分?jǐn)嚢柚涟咨疤峭耆芙?。冷卻后按10%接種量接種紅茶菌，于25℃靜置培養(yǎng)1 d～5 d后 6 480×g離心15 min，上清液即為T(mén)FB。

1.3.2 紅茶菌發(fā)酵液不同發(fā)酵時(shí)間營(yíng)養(yǎng)理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 pH值的測(cè)定

取紅茶菌發(fā)酵液 10 mL，6 480×g離心 15 min，取上清液利用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.2.2 總酸含量的測(cè)定

采用GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》中酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3 紅茶菌發(fā)酵液中總酚含量的測(cè)定

以沒(méi)食子酸作為總酚含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalten法[18]測(cè)定發(fā)酵液總酚含量。

1.3.2.4 紅茶菌發(fā)酵液中黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁作為黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[19]測(cè)定發(fā)酵液黃酮含量。

1.3.2.5 微生物指標(biāo)的測(cè)定

吸取1 mL紅茶菌發(fā)酵液用9 mL滅菌后的生理鹽水梯度稀釋后分別涂布于醋酸菌培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上，其中醋酸菌和酵母菌30℃培養(yǎng)24 h，乳酸菌37℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)后記錄菌落數(shù)量，連續(xù)測(cè)定 1 d～5 d。

1.3.3 紅茶菌發(fā)酵液體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測(cè)定

取1mL紅茶菌發(fā)酵上清液加入試管中，加入3.9mL 0.1 mmol/LDPPH-乙醇溶液，混勻，避光37℃水浴1h后在517 nm下測(cè)定吸光值，以蒸餾水做空白對(duì)照。DPPH·清除率計(jì)算公式如下。

式中：Ab為空白對(duì)照管的吸光值；As為樣品測(cè)定管的吸光值。

1.3.3.2 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

取pH8.2 0.05 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液3 mL與1 mL紅茶菌發(fā)酵上清液混合，25℃保溫20 min后，加入同樣預(yù)熱的25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻后反應(yīng)4 min，用0.5 mL濃HCl終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)其吸光值。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下。

超氧陰離子自由基清除率/%=（Aj-Ak）/Aj×100

式中：Ak為以蒸餾水代替樣品的吸光值；Aj為樣品的吸光值。

1.3.3.3 羥基自由基清除率的測(cè)定

在具塞試管中加紅茶菌發(fā)酵上清液1 mL、9 mmol/L FeSO4溶液1mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL，混勻，再加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，37℃反應(yīng)30 min，510 nm處測(cè)其吸光值。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。

羥基自由基清除率/%=[A0-（Am-An）]/A0×100

式中：A0為用蒸餾水代替樣品時(shí)測(cè)得的吸光值；Am為用樣品測(cè)得的吸光值；An為用蒸餾水代替H2O2時(shí)測(cè)得的吸光值。

1.3.3.4 鐵離子還原力的測(cè)定

取1mL的紅茶菌發(fā)酵上清液，加入pH6.6 0.2mol/L的磷酸溶液1 mL和1%K3Fe（CN）6溶液1 mL，混勻后，50℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，加入1 mL 10%三氯乙酸，1 359×g離心10 min，取上層溶液2.5 mL，然后加入2.5 mL蒸餾水和0.1%FeCl30.5 mL，充分混勻，室溫靜置10 min，在700 nm處測(cè)定其吸光值，以蒸餾水取代樣品作為空白對(duì)照。

1.3.4 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)氧化損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

1.3.4.1 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)紫外損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的酵母細(xì)胞2 600×g離心15 min后，棄上清液，沉淀中加入5 mL pH7.4 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，混勻，制備酵母細(xì)胞懸浮液。向Φ90mm的培養(yǎng)皿中加入5mL酵母細(xì)胞懸浮液和1mL紅茶菌發(fā)酵液，30℃避光溫浴20min后，置于紫外燈（8W，45cm）下照射150 s，適當(dāng)稀釋后涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)24 h并計(jì)算細(xì)胞存活率，計(jì)算公式如下。

細(xì)胞存活率/%=A1/A2×100

式中：A1為紫外照射活菌數(shù)或經(jīng)H2O2處理活菌數(shù)；A2為未照射活菌數(shù)或未經(jīng)H2O2處理活菌數(shù)。

1.3.4.2 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)H2O2損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

酵母菌懸浮液的制備方法同1.3.4.1，取酵母細(xì)胞懸浮液5 mL，加1 mL紅茶菌發(fā)酵液和終濃度為2.5%的 H2O2溶液2.5 mL，37℃，50 r/min搖床培養(yǎng)1 h，適當(dāng)稀釋后涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)24 h并計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)營(yíng)養(yǎng)理化指標(biāo)的影響

2.1.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)pH值的影響

不同發(fā)酵時(shí)間紅茶菌發(fā)酵液對(duì)pH值的影響見(jiàn)圖1所示。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液pH值的影響Fig.1 Effect of different fermentation time on pH value

如圖1所示，QFB和TFB的pH值隨發(fā)酵時(shí)間的增加，不斷下降，培養(yǎng)至第3天后，pH值趨于平穩(wěn)。紅茶菌在發(fā)酵過(guò)程中分為兩個(gè)階段，一個(gè)是乙醇發(fā)酵階段，另一個(gè)是醋酸發(fā)酵階段，其中醋酸發(fā)酵階段是使發(fā)酵液中pH值下降的主要原因。研究證明，紅茶菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2溶于水后生成的HCO3－會(huì)與有機(jī)酸釋放的H＋反應(yīng)，即使在醋酸發(fā)酵階段會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，pH值仍然保持穩(wěn)定[20]。

同時(shí)，在培養(yǎng)第5天時(shí)，QFB和TFB的pH值分別為（2.63±0.08）和（3.30±0.01）。研究表明，以茶葉為發(fā)酵原料時(shí)，紅茶菌發(fā)酵液pH值為2.95～3.21[21]，Vitas等[8]利用紅茶菌發(fā)酵蓍草亞臨界水提取物時(shí)，其pH值更低，為2.39～2.60，說(shuō)明蓍草亞臨界水提取物更適合紅茶菌的發(fā)酵。本文研究結(jié)果與Vitas研究結(jié)果相似，說(shuō)明藜麥中的營(yíng)養(yǎng)成分更利于微生物生長(zhǎng)，發(fā)酵效果更好。

2.1.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量的影響

不同發(fā)酵時(shí)間紅茶菌發(fā)酵液對(duì)總酸含量的影響見(jiàn)表1所示。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量的影響Table 1 Effect of different fermentation time on total acid content

如表1所示，QFB和TFB的總酸含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)且QFB的總酸含量高于TFB。在發(fā)酵第5天時(shí)，總酸含量達(dá)到最大，QFB的總酸濃度是TFB的3.04倍。根據(jù)顯著性差異分析，QFB發(fā)酵第2天～第5天時(shí)的總酸含量與發(fā)酵第1天時(shí)的具有顯著性差異（p＜0.05），發(fā)酵第5天時(shí)的總酸含量與發(fā)酵第2天時(shí)的具有顯著性差異（p＜0.05）。TFB在整個(gè)發(fā)酵期間總酸含量的變化均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。 QFB和TFB在發(fā)酵第1天時(shí)的總酸含量無(wú)顯著性差異（p＞0.05），而在發(fā)酵第 2、3、4、5 天時(shí)的總酸含量均差異顯著（p＜0.05）。

2.1.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚含量的影響

不同發(fā)酵時(shí)間紅茶菌發(fā)酵液對(duì)總酚含量的影響見(jiàn)表2所示。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酚含量的影響Table2 Effect of different fermentation time on total phenol content

如表2所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，QFB和TFB中總酚含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵第2天時(shí)濃度達(dá)到最大值，分別為（0.580±0.009）mg/mL和（0.340±0.009）mg/mL，QFB的總酚含量明顯高于 TFB（p＜0.05），是TFB的 1.71倍；且 QFB 在發(fā)酵期間，1 d～5 d的總酚含量均具有顯著性差異（p＜0.05）。藜麥本身含有豐富的多酚類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)發(fā)酵作用可使結(jié)合態(tài)多酚轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)的酚類(lèi)物質(zhì)，使得發(fā)酵液中的總酚含量增加；而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物也會(huì)利用部分酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖[22]。韓林等[23]利用酵母菌發(fā)酵藜麥時(shí)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前3 d，總酚含量呈線性增加，而發(fā)酵3 d后則逐步減少，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

2.1.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響

不同發(fā)酵時(shí)間紅茶菌發(fā)酵液對(duì)黃酮含量的影響見(jiàn)表3所示。

如表3所示，QFB和TFB中的黃酮含量變化趨勢(shì)與總酚相似，均是先升高，再降低，在發(fā)酵第2天時(shí)含量達(dá)到最大，分別是（0.240±0.002）mg/mL和（0.120±0.001）mg/mL，QFB是TFB的2.0倍。根據(jù)顯著性差異分析可知，QFB和TFB在發(fā)酵期間，每一天的黃酮含量均具有顯著性差異（p＜0.05）。

表3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響Table 3 Effect of different fermentation time on flavone content

2.1.5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物總數(shù)的影響

不同發(fā)酵時(shí)間紅茶菌發(fā)酵液對(duì)微生物總數(shù)的影響見(jiàn)表4～表6所示。

表4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌菌落數(shù)的影響Table 4 Effect of different fermentation time on the number of lactic acid bacteria colonies

表5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌菌落數(shù)的影響Table 5 Effect of different fermentation time on the number of yeast colonies

表6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸菌菌落數(shù)的影響Table 6 Effect of different fermentation time on the number of acetic acid bacteria colonies

如表4～表6所示，紅茶菌發(fā)酵液在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，醋酸菌數(shù)量最多，其次是乳酸菌，最后是酵母菌。培養(yǎng)前期，醋酸菌、酵母菌和乳酸菌的數(shù)量均呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵第2天時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最高，QFB中的醋酸菌、乳酸菌、酵母菌的數(shù)量分別為（8.970±0.007）、（8.460±0.009）、（7.460±0.015）lg（CFU）/g；TFB 中的醋酸菌、乳酸菌、酵母菌的數(shù)量分別為（8.890±0.010）、（8.110±0.008）、（7.230±0.029）lg（CFU）/g，之后開(kāi)始下降。發(fā)酵第4天時(shí)，醋酸菌數(shù)量有一個(gè)小幅度上升趨勢(shì)。其原因一方面可能是在取菌液時(shí)，破壞了菌膜，導(dǎo)致氧氣進(jìn)入發(fā)酵液，造成醋酸菌生長(zhǎng)；另一方面可能是酵母菌和乳酸菌的死亡，釋放的代謝產(chǎn)物正好是醋酸菌所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

同時(shí)，發(fā)現(xiàn)QFB和TFB在相同發(fā)酵時(shí)間，乳酸菌和酵母菌菌落數(shù)均具有顯著性差異（p＜0.05），QFB和TFB在發(fā)酵第1、2、5天的醋酸菌總量具有顯著性差異（p＜0.05）。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，醋酸菌是紅茶菌液中的優(yōu)勢(shì)菌群，與廖盧燕等[24]和王春龍[25]所研究的醋酸菌是紅茶菌液中的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)果相吻合。從整體試驗(yàn)來(lái)看，以藜麥為基質(zhì)發(fā)酵紅茶菌時(shí)的菌落總數(shù)明顯大于以茶葉發(fā)酵紅茶菌時(shí)的菌落總數(shù)，表明添加藜麥發(fā)酵紅茶菌可以提高紅茶菌液中的菌落數(shù)量，增強(qiáng)紅茶菌發(fā)酵效果。

2.2 紅茶菌發(fā)酵液體外抗氧化活性研究

2.2.1 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)DPPH·清除能力的影響

不同發(fā)酵時(shí)間紅茶菌發(fā)酵液對(duì)DPPH·清除能力的影響見(jiàn)表7所示。

如表7所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，QFB和TFB對(duì)DPPH自由基的清除效果呈現(xiàn)先升高再緩慢降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵2 d時(shí)達(dá)到最大，QFB和TFB清除率分別為（76.520±0.082）%和（53.500±0.160）%，QFB 是 TFB 的1.43倍。根據(jù)顯著性差異分析，QFB和TFB 1 d～5 d的自由基清除率均與其余4 d的具有顯著性差異（p＜0.05）。

表7 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響Table 7 Effects of different fermentation time on DPPH·scavenging

2.2.2 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)·O2-清除能力的影響

不同發(fā)酵時(shí)間兩種紅茶菌發(fā)酵液對(duì)·O2-清除能力的影響見(jiàn)表8所示。

表8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)·O2-清除率的影響Table 8 Effects of different fermentation time on·O2-scavenging

如表8所示，發(fā)酵過(guò)程中，2種發(fā)酵液清除·O2-的能力均在第2天顯著增加，而后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，清除能力呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；發(fā)酵第2天時(shí)，TFB的·O2-清除率為（18.310±0.123）%，而 QFB的·O2-清除率達(dá)到（33.930±0.284）%，是TFB的1.85倍。根據(jù)顯著性差異分析，QFB、TFB 1 d～5 d的·O2-清除率均與其余 4 d的具有顯著性差異（p＜0.05）。

2.2.3 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)·OH清除能力的影響

不同發(fā)酵時(shí)間兩種紅茶菌發(fā)酵液對(duì)·OH清除能力的影響見(jiàn)表9所示。

表9 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)·OH清除率的影響Table 9 Effects of different fermentation time on·OH scavenging

從表9可以看出，發(fā)酵1 d～5 d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，清除·OH能力先升高后降低，QFB的·OH清除率明顯高于TFB，QFB、TFB均在發(fā)酵第2天時(shí)達(dá)到最高值，分別是（52.950±0.221）%、（31.430±0.342）%，QFB是TFB發(fā)酵液的1.68倍。根據(jù)顯著性差異分析，QFB、TFB 1 d～5 d的自由基清除率均與其余4 d的具有顯著性差異（p＜0.05）。

2.2.4 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)鐵離子還原力的影響

不同發(fā)酵時(shí)間兩種紅茶菌發(fā)酵液對(duì)鐵離子還原力的影響見(jiàn)表10所示。

表10 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)鐵離子還原力的影響Table 10 Effect of different fermentation time on iron reduction power

還原力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，抗氧化物質(zhì)通過(guò)提供電子可使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性，許多研究證實(shí)抗氧化活性同還原力是密切相關(guān)的。從表10發(fā)酵過(guò)程中的還原力變化可以看出，2種發(fā)酵液的還原力均呈先增大后減小的趨勢(shì)。發(fā)酵過(guò)程中，QFB的還原力明顯大于TFB的還原力，說(shuō)明QFB的抗氧化活性要強(qiáng)于TFB，均在發(fā)酵第2天時(shí)達(dá)到最大，其還原力OD值分別為0.682±0.002（QFB）和 0.549±0.001（TFB），QFB 對(duì)鐵離子還原力是TFB的1.24倍。根據(jù)顯著性差異分析，QFB和TFB在相同發(fā)酵時(shí)間，對(duì)鐵離子的還原力均具有顯著性差異（p＜0.05）。

綜上，在發(fā)酵前期，酵母菌快速增長(zhǎng)，分解原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生大量的抗氧化性物質(zhì)（如小分子的酚類(lèi)物質(zhì)和黃酮類(lèi)物質(zhì)等），抗氧化性隨之增強(qiáng)，隨著酵母菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期及在發(fā)酵過(guò)程中氧氣的進(jìn)入，抗氧化物質(zhì)被分解或發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而抗氧化性隨之下降[4，26]。丁艷如等[27]研究表明傳統(tǒng)的紅茶菌發(fā)酵液清除DPPH·能力可達(dá)90%以上，經(jīng)10d發(fā)酵，·O2-的清除率高達(dá)100%，對(duì)·OH的清除率保持在20%左右；以咖啡液為發(fā)酵基質(zhì)時(shí)，紅茶菌對(duì)于·O2-的清除率在12%左右[28]；當(dāng)以蛇果為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行紅茶菌發(fā)酵14d，其對(duì) DPPH·清除率為（18.03±0.36）%[29]。可見(jiàn)，紅茶菌發(fā)酵基質(zhì)不同時(shí)，對(duì)于不同的自由基的清除能力不同。

2.3 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)紫外損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

不同發(fā)酵時(shí)間兩種紅茶菌發(fā)酵液對(duì)紫外損傷釀酒酵母細(xì)胞保護(hù)作用的影響見(jiàn)表11所示。

表11 發(fā)酵液對(duì)紫外損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用Table 11 Protective effect of fermentation broth on UV-damaged S.cerevisiae

紫外線輻射產(chǎn)生的活性氧自由基會(huì)引發(fā)細(xì)胞損傷和凋亡[30-31]，抗氧化劑具有清除自由基的作用，可有效減緩紫外輻射對(duì)細(xì)胞造成的損傷。通過(guò)建立釀酒酵母損傷模型評(píng)價(jià)紅茶菌發(fā)酵的抗氧化活性，對(duì)于開(kāi)發(fā)更有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的紅茶菌飲品具有一定的參考價(jià)值。如表11所示，添加不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，釀酒酵母細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)添加第2天的發(fā)酵液時(shí)釀酒酵母細(xì)胞存活率達(dá)到最大值，分別為（24.92±0.73）%（QFB）、（20.79±1.22）%（TFB），且添加QFB的存活率大于TFB釀酒酵母細(xì)胞的存活率，是TFB的1.23倍，之后逐漸降低。根據(jù)顯著性差異分析，添加發(fā)酵1 d-5 d的QFB與不添加發(fā)酵液的空白組之間的釀酒酵母存活率差異顯著（p＜0.05）；添加第2天和第3天的TFB與空白組之間差異顯著（p＜0.05），添加其他發(fā)酵時(shí)間的紅茶菌發(fā)酵液與空白組之間無(wú)顯著性差異（p＞0.05）；添加整個(gè)發(fā)酵期間的QFB對(duì)釀酒酵母細(xì)胞存活率的影響均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

2.4 紅茶菌發(fā)酵液對(duì)H2O2損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

不同發(fā)酵時(shí)間兩種紅茶菌發(fā)酵液對(duì)H2O2損傷釀酒酵母細(xì)胞保護(hù)作用的影響見(jiàn)表12所示。

表12 發(fā)酵液對(duì)H2O2損傷釀酒酵母細(xì)胞的保護(hù)作用Table 12 Protective effect of fermentation broth on H2O2-damaged S.cerevisiae

H2O2在誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型等方面應(yīng)用非常廣泛，是一種常用的細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑。H2O2能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體造成傷害的羥自由基，而抗氧化劑可降低H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷。由表12可知，與空白組比較，添加不同發(fā)酵時(shí)間的QFB和TFB對(duì)釀酒酵母細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，可明顯提高釀酒酵母存活率（p＜0.05）。當(dāng)添加發(fā)酵第2天的QFB和TFB釀酒酵母存活率最高，分別為（19.400±0.600）%和（15.460±0.861）%，QFB 釀酒酵母細(xì)胞存活率高于TFB，是其存活率的1.42倍，二者之間存在顯著差異性（p＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究以紅茶菌為菌種、以藜麥為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，與以傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵液相比，其營(yíng)養(yǎng)和抗氧化活性均呈顯著升高。當(dāng)發(fā)酵第2天時(shí)TFB和QFB中的微生物總數(shù)總酸、總酚和黃酮含量均達(dá)到最高值，QFB發(fā)酵液中總酚和黃酮含量分別是TFB中總酚和黃酮含量的1.71倍和2.0倍，且在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，TFB中的總酚和黃酮含量均顯著高于TFB（p＜0.05）。在此基礎(chǔ)上，采用體外抗氧化試驗(yàn)和建立釀酒酵母細(xì)胞損傷模型評(píng)價(jià)紅茶菌發(fā)酵的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)與TFB比較，發(fā)酵1d～5 d的QFB體外抗氧化活性均得到了明顯的提高，二者具有顯著性差異（p＜0.05）；同時(shí)，當(dāng)添加發(fā)酵2 d的QFB時(shí)對(duì)H2O2誘導(dǎo)酵母細(xì)胞形成的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，細(xì)胞存活率顯著高于添加2 d的TFB。由此可知，QFB具有更強(qiáng)的抗氧化活性，總酚和黃酮含量的增加是其抗氧化活性提高的重要因素。