羅蘭心，張靜，劉洋，姜青，滕杰*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西婺源茶業(yè)職業(yè)學(xué)院，江西 上饒 333200）

茶多糖（tea polysaccharides，TPs）又稱(chēng)為茶活性多糖或茶葉多糖，是醛糖和（或）酮糖通過(guò)α-糖苷鍵或β-糖苷鍵連接成的天然聚合物，主要由阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖等組成高聚合度的多糖苷鍵聚糖類(lèi)，并與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，約占茶葉干物質(zhì)重的0.8%～3.5%[1]，茶多糖具有降低血糖、血脂、改善胰島素抵抗、增強(qiáng)葡萄糖耐受、抗血凝等功效，對(duì)糖尿病并發(fā)癥也有積極預(yù)防效果[2-5]，是現(xiàn)階段極具開(kāi)發(fā)潛質(zhì)的天然物質(zhì)之一，廣泛應(yīng)用于功能食品、醫(yī)藥保健、美容日化等領(lǐng)域，其提取、純化方法也受到廣泛關(guān)注[6-7]。

江西省修水縣古稱(chēng)義寧州，所產(chǎn)紅茶稱(chēng)為寧州工夫紅茶，又簡(jiǎn)稱(chēng)為“寧紅”，是當(dāng)前江西省重點(diǎn)打造“四綠一紅”茶產(chǎn)業(yè)中的唯一紅茶品牌[8]。目前，對(duì)于寧紅茶營(yíng)養(yǎng)功效研究相對(duì)較薄弱，特別是在功能成分提取制備方面的報(bào)道較少。傳統(tǒng)的茶多糖提取方法多采用水提醇沉法[9]、酸堿提取法[10]、超聲波或微波輔助浸提法[11]、超臨界萃取法[12]等，上述方法多存在提取得率低、儀器設(shè)備要求嚴(yán)或經(jīng)濟(jì)成本高等問(wèn)題[13]，而采用酶法的提取反應(yīng)條件較溫和，有效成分浸出率和生物活性較高等優(yōu)勢(shì)[14-15]。為推動(dòng)寧紅茶深加工利用并提高其茶多糖提取量，基于響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取工藝技術(shù)，探討提取時(shí)間、復(fù)合酶用量和料液比等關(guān)鍵因素對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響，為寧紅茶開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧紅茶：2020年5月產(chǎn)自江西省寧紅集團(tuán)有限公司，按照寧紅茶傳統(tǒng)工夫紅茶的“萎調(diào)→揉捻→發(fā)酵→干燥→提香”加工工序制作。干茶粉碎后過(guò)40目篩備用。

果膠酶（11 000 U/g）、中性蛋白酶（30 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：成都埃法生物科技有限公司；蒽酮、濃硫酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204電子分析天平：梅特勒-托利多（常州）儀器有限公司；UV-722紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：河南鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 寧紅茶多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及含量測(cè)定

寧紅茶多糖含量測(cè)定依據(jù)蒽酮-硫酸法[16]進(jìn)行。稱(chēng)取0.33 g蒽酮加入到100 mL濃硫酸于棕色瓶中溶解；0.25 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于250 mL容量瓶中定容，搖勻后分別取 2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL 于 100 mL 定容，分別取 1 mL置于標(biāo)有 1、2、3、4、5 編號(hào)試管，冰水浴中分別加入4 mL蒽酮-硫酸溶液，搖勻后3 min沸水浴后快速冷卻，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，以蒸餾水代替葡萄糖溶液為空白對(duì)照。以質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，吸光值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.083 4x-0.033 1（R2=0.999 1），說(shuō)明測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

寧紅茶提取液中茶多糖測(cè)定：抽濾樣品于100 mL容量瓶中定容，取0.2 mL試液于具塞刻度試管中，各管中準(zhǔn)確移入4 mL蒽酮試劑，搖勻后置于沸水浴中準(zhǔn)確加熱7 min，冷卻至室溫后于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各提取液中寧紅茶多糖提取量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 酶種類(lèi)篩選

稱(chēng)取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），酶解溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間3 h條件下，分別檢測(cè)0.8%（以底物質(zhì)量計(jì)）酶用量的5種類(lèi)型[纖維素酶（種類(lèi)1），果膠酶（種類(lèi)2），果膠酶與纖維素酶組合酶（種類(lèi)3），果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶組合（種類(lèi)4），中性蛋白酶（種類(lèi)5）]對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響，確定適合的酶種類(lèi)。

1.3.2.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），復(fù)合酶用量0.8%（以底物質(zhì)量計(jì)），酶解溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間3 h條件下，分別考察果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.3 復(fù)合酶用量對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），酶解溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間3 h條件下，分別考察復(fù)合酶用量（果膠酶:纖維素酶=2:1，質(zhì)量比）0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.4 酶解溫度對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），復(fù)合酶用量0.9%（果膠酶:纖維素酶=2:1，質(zhì)量比），反應(yīng)時(shí)間3 h條件下，分別考察酶解溫度35、40、45、50、55℃對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.5 提取時(shí)間對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），復(fù)合酶用量0.9%（果膠酶:纖維素酶=2:1，質(zhì)量比），酶解溫度45℃條件下，分別考察提取時(shí)間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.6 料液比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g寧紅茶粉末，復(fù)合酶添加量0.9%（果膠酶:纖維素酶=2:1，質(zhì)量比），酶解溫度45℃，提取時(shí)間3.5 h條件下，分別考察料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（g/mL）對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

按照響應(yīng)面Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取時(shí)間（A）、復(fù)合酶用量（B）和料液比（C）為響應(yīng)因子，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factor levels and variables of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007軟件分析相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和顯著性分析，Design-expert 8.0軟件中Box-Behnken構(gòu)建響應(yīng)面試驗(yàn)和分析回歸模型結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 酶種類(lèi)的確定

不同酶種類(lèi)對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同酶種類(lèi)對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響Fig.1 Effect of enzyme types on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖1可知，以種類(lèi)3（果膠酶與纖維素酶組合）獲得寧紅茶多糖提取量最高，達(dá)到27.32 mg/g（P＜0.05），其次是種類(lèi)2（果膠酶）和種類(lèi)4（果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶組合），寧紅茶多糖提取量為23 mg/g左右，二者間無(wú)顯著差異（P＞0.05），而種類(lèi)1（纖維素酶）獲得寧紅茶多糖提取量最低，僅有16.70 mg/g（P＜0.05），與種類(lèi)5（中性蛋白酶）獲得18.70 mg/g寧紅茶多糖提取量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明中性蛋白酶的存在可能會(huì)抑制復(fù)合酶的綜合作用，且單獨(dú)使用時(shí)效果亦不佳。確定以種類(lèi)3（果膠酶與纖維素酶組合）為酶解體系提取寧紅茶中的茶多糖。

2.1.2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比的影響

果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比2:1～1:3內(nèi)，隨著纖維素酶的用量增加，寧紅茶多糖提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由 27.87 mg/g降低到 18.70 mg/g（P＜0.05）。以果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為2:1時(shí)，兩種酶活性復(fù)合作用發(fā)揮最優(yōu)，此時(shí)寧紅茶多糖提取量最高（27.87 mg/g），但與果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為1:1時(shí)的寧紅茶多糖提取量無(wú)顯著差異（P＞0.05），綜合試驗(yàn)結(jié)果和原料成本確定果膠酶和纖維素酶質(zhì)量比為2:1適宜。

圖2 果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase-cellulose content ratio on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

2.1.3 復(fù)合酶用量的影響

復(fù)合酶用量對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)合酶用量對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響Fig.3 Effect of compound enzymatic addition on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖3可知，在選取的果膠酶與纖維素酶組合的復(fù)合酶用量范圍內(nèi)，寧紅茶多糖提取量隨著復(fù)合酶用量的增加呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)復(fù)合酶用量為0.9%（以底物質(zhì)量計(jì)）時(shí)，寧紅茶多糖提取量達(dá)到最高 30.72 mg/g（P＜0.05），繼續(xù)增加復(fù)合酶用量，寧紅茶多糖提取量顯著降低，在復(fù)合酶用量為1.3%時(shí)僅有21.98 mg/g，其原因是酶量達(dá)到一定臨界時(shí)，反應(yīng)體系會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)，隨著復(fù)合酶用量的繼續(xù)增加會(huì)抑制酶活性或加速產(chǎn)物轉(zhuǎn)變[17]。綜合表明果膠酶和纖維素酶組合的復(fù)合酶用量以0.9%最佳。

2.1.4 酶解溫度的影響

酶解溫度對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖4可知，在35℃～45℃內(nèi)寧紅茶多糖提取量隨著溫度升高顯著增加，由最初的22.37mg/g顯著增加到30.73 mg/g（P＜0.05），達(dá)到寧紅茶多糖提取量最大值。而隨著溫度繼續(xù)升高，寧紅茶多糖提取量顯著下降，在55℃時(shí)寧紅茶多糖提取量?jī)H有21.29 mg/g，但與35℃時(shí)的提取效果無(wú)顯著差異（P＞0.05），其原因是酶具有最適溫度，低溫不能發(fā)揮酶的最適活性，溫度過(guò)高會(huì)抑制酶活性甚至是破壞酶結(jié)構(gòu)，直至完全喪失其活性[18]。45℃～55℃的酶解溫度抑制了酶活性，而活性物質(zhì)溶出率的上升往往依靠溫度的提高，但提取效果不及酶解效果。結(jié)果表明酶解溫度以45℃適宜。

2.1.5 提取時(shí)間的影響

提取時(shí)間對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖5可知，在選取2.0h～4.0h內(nèi)，茶多糖提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，在3.0h時(shí)達(dá)到寧紅茶多糖提取量最大值32.33mg/g（P＜0.05），而提取時(shí)間2.0h寧紅茶多糖提取量最低，僅為18.57mg/g（P＜0.05）。表明短時(shí)間的提取時(shí)間，酶解作用和浸提效果不充分，而酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)提高寧紅茶多糖的提取量無(wú)顯著促進(jìn)作用，存在反應(yīng)體系抑制酶活性的現(xiàn)象或不利于產(chǎn)物的穩(wěn)定因素[19]。確定提取時(shí)間以3.0 h最佳。

2.1.6 料液比的影響

料液比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響見(jiàn)圖6。

圖6 料液比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響Fig.6 Effect of ratio of solid to liquid on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖 6 可知，在 1:10（g/mL）～1:30（g/mL）內(nèi)，寧紅茶多糖提取量隨溶劑添加量的減小而呈現(xiàn)顯著的先升高后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)料液比1:20（g/mL）時(shí)，寧紅茶多糖提取量達(dá)到最大值32.27 mg/g（P＜0.05），隨后顯著下降，在料液比 1:30（g/mL）時(shí)僅有 18.49 mg/g（P＜0.05），該結(jié)果與 1:10（g/mL）時(shí)提取量（17.93 mg/g）無(wú)顯著差異。其原因?yàn)榱弦罕容^大時(shí)易受到傳質(zhì)阻力影響，寧紅茶多糖溶出量偏低；在一定的料液比范圍內(nèi)，傳質(zhì)阻力減弱，包括寧紅茶多糖在內(nèi)的活性物質(zhì)溶出量會(huì)升高，當(dāng)溶劑添加量過(guò)小時(shí)大量的液體溶劑形成稀釋效應(yīng)[20]。確定料液比以1:20（g/mL）最佳。

2.2 響應(yīng)面模型建立與分析

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合原理設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Response surface methodology and analysis results

對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到寧紅茶多糖提取量（Y）與提取時(shí)間（A）、復(fù)合酶用量（B）、料液比（C）的回歸模型方程：Y=31.18+2.58A+2.24B+6.08C+0.19AB+1.18AC+1.89BC-1.41A2-5.85B2-6.65C2。

方差分析見(jiàn)表3。

表3 寧紅茶多糖提取量的回歸模型方程方差分析Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model on tea polysaccharides from Ninghong black tea

由表3可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚉<0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P=0.368 0>0.05，不顯著，說(shuō)明該模型具有很高可信度[21]。本試驗(yàn)選取的3個(gè)因子對(duì)寧紅茶多糖提取量Y的影響強(qiáng)弱順序：C（料液比）>A（提取時(shí)間）>B（復(fù)合酶用量）；一次項(xiàng) A、B、C 均呈極顯著；二次項(xiàng) B2、C2和交互項(xiàng)AC、BC均呈極顯著，二次項(xiàng)A2呈顯著。相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8，表明響應(yīng)值的變化有99.38%來(lái)源于所選變量；校正相關(guān)系數(shù)R2adj=0.985 9，表明該模型可以解釋98.59%的響應(yīng)值變化；變異系數(shù)C.V.%=3.39<5%，說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的精確性和重復(fù)性極其顯著。綜上證明該模型擬合程度高，可應(yīng)用于分析和預(yù)測(cè)寧紅茶中茶多糖的提取工藝。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面圖分析

各響應(yīng)因素交互作用對(duì)寧紅茶多糖提取量影響如圖7所示。

由圖7可知，提取時(shí)間與料液比、復(fù)合酶用量與料液比對(duì)寧紅茶多糖提取量影響的響應(yīng)曲面坡度較陡峭，等高線呈橢圓形且各曲線之間密集，說(shuō)明各因子的交互效應(yīng)對(duì)寧紅茶多糖提取量的作用顯著。同時(shí)，結(jié)合曲面陡峭變化，說(shuō)明料液比對(duì)寧紅茶多糖提取量的影響更顯著，其次是提取時(shí)間和復(fù)合酶用量，與方差分析結(jié)果一致。

圖7 各響應(yīng)因素交互作用對(duì)寧紅茶多糖提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plots of the interaction of each factor to the extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

2.4 最佳條件確定與回歸模型驗(yàn)證

通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到復(fù)合酶法提取寧紅茶多糖最佳工藝參數(shù)：提取時(shí)間3.211h，復(fù)合酶用量0.933%（以底物質(zhì)量計(jì)），料液比1:20（g/mL），此條件下獲得寧紅茶多糖提取量為31.905 mg/g。為便于實(shí)際操作，優(yōu)化調(diào)整工藝技術(shù)參數(shù)：提取時(shí)間3.2 h，復(fù)合酶用量0.93%（以底物質(zhì)量計(jì)），料液比1:20（g/mL），并在此參數(shù)下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，寧紅茶多糖提取量平均值為31.62 mg/g，與理論值31.905 mg/g接近（P>0.05），表明基于Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取寧紅茶多糖的工藝技術(shù)可靠。

3 結(jié)論

本研究以江西省寧紅茶的茶多糖提取量為考察目標(biāo)，在單因素試驗(yàn)篩選基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取寧紅茶多糖的工藝技術(shù)，獲得最佳提取工藝參數(shù)：提取時(shí)間3.2 h，復(fù)合酶用量0.93%（以底物質(zhì)量計(jì)），料液比1:20（g/mL），在此工藝參數(shù)下其提取量為31.62 mg/g，接近模型預(yù)測(cè)的提取值31.905 mg/g（P>0.05），綜合說(shuō)明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果可靠，且該提取方法優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法效果，試驗(yàn)為寧紅茶的深加工利用提供科學(xué)依據(jù)。