魏 培 ，曹春泉 ，朱瑞娟 ，錢 淼 ，孫新堂 △

（1. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院食品與藥品科技系，山東 濰坊 261061； 2. 菏澤學(xué)院藥學(xué)院，山東 菏澤 274000）

腦安膠囊是由川芎、當(dāng)歸、紅花、人參、冰片5 味中藥組方的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、益氣通絡(luò)功效，用于治療腦血栓急性期、恢復(fù)期的氣虛血瘀證候，癥見急性起病，半身不遂，口舌歪斜，舌強(qiáng)語塞，偏身麻木，氣短乏力，口角流涎，手足腫脹舌黯或有瘀斑，苔薄白等［1-2］。臨床用于治療偏頭痛［3］、缺血性中風(fēng)氣虛血瘀癥［4］、高血壓腦血管功能異常［5］、老年性腦梗死［6］等。腦安膠囊收載于2020 年版《中國藥典（一部）》，以阿魏酸和人參皂苷Re 含量作為定量分析指標(biāo)。但單一指標(biāo)成分的定量分析無法完整、準(zhǔn)確地反映中藥制劑的復(fù)雜性和質(zhì)量一致性。指紋圖譜是采用色譜法、光譜法等分析方法得到的能體現(xiàn)中藥整體特征的圖譜，將圖譜某些重要特征信息或整體信息用于中藥材或中藥制劑真?zhèn)舞b別或中藥質(zhì)量整體控制和評價(jià)的方法［7］，可科學(xué)、系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥材或中藥制劑的整體性和復(fù)雜性，能較全面地反映中藥材及制劑所含化學(xué)成分的相對關(guān)系，體現(xiàn)中藥材和中藥制劑的復(fù)雜性和相關(guān)性［8］，具有穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［9］，廣泛應(yīng)用于中藥材及中藥制劑的質(zhì)量控制及評價(jià)［10-11］。但中藥的復(fù)雜性使獲取的色譜、光譜數(shù)據(jù)信息存在量大、多維的特點(diǎn)，具有宏觀性和模糊性，增加了人工識別的難度，故需借助化學(xué)模式識別技術(shù)對指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)信息的挖掘和解析?；瘜W(xué)模式識別是一種將數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)信息技術(shù)與化學(xué)圖譜解析整合起來，將海量、多維的原始數(shù)據(jù)通過數(shù)學(xué)算法進(jìn)行壓縮、降維和歸類分析，找到樣品集的內(nèi)部規(guī)律，從而實(shí)現(xiàn)中藥及中藥制劑的分類、快速鑒別和質(zhì)量控制［12］。目前，中藥分析主要有監(jiān)督模式識別分析和無監(jiān)督模式識別分析，有監(jiān)督模式識別分析常用偏最小二乘- 判別分析（PLS - DA）法、Fisher 判別等，無監(jiān)督模式識別分析常用聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）等。本研究中建立了2 個(gè)生產(chǎn)廠家的腦安膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合CA 和PLS-DA 化學(xué)模式識別方法，對腦安膠囊的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為其質(zhì)量評價(jià)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XPR105DR/ AC 型電子天平（梅特勒- 托利多國際有限公司，精度為十萬分之一）；JP - 100S 型數(shù)控超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

川芎（批號為220513，產(chǎn)地四川彭州市），當(dāng)歸（批號為220907，產(chǎn)地甘肅岷縣），紅花（批號為220402，產(chǎn)地新疆塔城），人參（批號為221027，產(chǎn)地吉林長白山），均為飲片，購自亳州市滕王藥業(yè)有限責(zé)任公司；藁本內(nèi)酯對照品（批號為111737-201507，含量以99.3%計(jì)），阿魏酸對照品（批號為110773-201614，含量以99.0%計(jì)），羥基紅花黃色素A 對照品（批號為111637 -201609，含量以91.9%計(jì)），人參皂苷Re 對照品（批號為110754-201827，含量以93.4%計(jì)），人參皂苷Rg1對照品（批號為110703-201731，含量以99.7%計(jì)），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704 - 201726，含量以91.1%計(jì)），山柰素對照品（批號為110861-201812，含量以93.8%計(jì)），均購自中國食品藥品檢定研究院；川芎嗪對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號為A0188，含量不低于98%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；腦安膠囊（安徽譽(yù)隆亞樂藥業(yè)有限公司，批號分別為20190414，20190529，20190913，20191107，20191122，20191205，20200311，20200427，20200608，20200630，20200904，20201016，編號為S1 - S12；上海祥鶴藥業(yè)有限公司，批號分別為180714，180721，180904，181013，190714，190921，190929，編號為S13-S19）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo ScientificTMHypersil GOLDTM-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min 時(shí)7%A，6～25 min時(shí) 7%A → 40%A，25～45 min 時(shí) 40%A → 60%A，45～60 min時(shí)60%A，60～70 min時(shí)60%A → 90%A，70～75 min時(shí)90%A → 7%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：316 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取對照品藁本內(nèi)酯、阿魏酸、川芎嗪、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re 和山柰素各適量，精密稱定，加70%甲醇溶解，制成藁本內(nèi)酯、阿魏酸、川芎嗪、羥基紅花黃色素A，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re 和山柰素質(zhì)量濃度分別為26.31，33.05，17.41，22.96，24.37，28.20，30.19，24.75μg/mL的混合對照品溶液。

取樣品內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

分別取川芎、當(dāng)歸、紅花、人參4味中藥飲片細(xì)粉適量，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備單味對照藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號為20190414）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD低于 1.17%（n= 6），相對峰面積的RSD低于2.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為20190414）樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD低于0.75%（n=6），相對峰面積的RSD低于2.61%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為20190414）樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，16，24，48 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果各色譜峰相對保留時(shí)間的RSD低于1.03%（n=6），相對峰面積的RSD低于3.42%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜分析

2.4.1 指紋圖譜建立

將19 批（編號為S1 - S19）樣品的HPLC 圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012A版軟件，以S1號色譜圖為參考圖譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度0.5，采用中位數(shù)法生成HPLC 指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），詳見圖1。根據(jù)指紋圖譜匹配結(jié)果，提取的21 個(gè)色譜峰的峰面積之和占總峰面積和的93%以上，故確定這21 個(gè)色譜峰為腦安膠囊指紋圖譜的共有峰。

圖1 19批腦安膠囊高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 19 batches of Naoan Capsules

2.4.2 共有峰歸屬及指認(rèn)

由圖2可知，1，3，4，5，6，7，8，9，10，13，14，15，19號峰歸屬于川芎，1，3，5，6，7，8，9，10，13，14，15，19 號峰歸屬于當(dāng)歸，1，2，3，7，8，11，12，13，21號峰歸屬于紅花，1，3，7，16，17，18，20 號峰歸屬于人參。結(jié)合混合對照品溶液HPLC 圖，比對指認(rèn)出8個(gè)特征峰，分別為2號峰羥基紅花黃色素 A、4 號峰川芎嗪、7 號峰阿魏酸、15 號峰藁本內(nèi)酯、16 號峰人參皂苷Rg1、18 號峰人參皂苷Re、20號峰人參皂苷Rb1、21號峰山柰素。詳見圖3。

圖2 腦安膠囊及各單味對照藥材溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Naoan Capsules solution and reference solution of single herb medicine

圖3 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.4.3 相似度評價(jià)

由圖1可知，15號峰（藁本內(nèi)酯）峰面積響應(yīng)值和保留時(shí)間均符合指紋圖譜參照峰要求，與相鄰色譜峰分離度符合規(guī)定，故選擇藁本內(nèi)酯色譜峰為參照峰。相似度計(jì)算結(jié)果見表1。19 批（編號為S1-S19）樣品與對照指紋圖譜的相似度均不低于0.911，說明2 個(gè)生產(chǎn)廠家的腦安膠囊指紋圖譜一致性較好。

表1 19批腦安膠囊相似度評價(jià)結(jié)果Tab.1 Results of similarity evaluation of 19 batches of Naoan Capsules

2.4.4 相對峰面積及相對保留時(shí)間計(jì)算

設(shè)置參照峰藁本內(nèi)酯的峰面積和保留時(shí)間為1，計(jì)算相對其他色譜峰的峰面積及相對保留時(shí)間，結(jié)果見表2 和表3。21 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD為0.41%～1.57%（n= 19），表明各共有峰的保留時(shí)間較穩(wěn)定；相對峰面積的RSD為6.60%～40.70%（n= 19），表明各批次間共有峰峰面積差異較大，且12號峰和17號峰差異最大。

表2 19批腦安膠囊高效液相色譜指紋圖譜共有峰相對保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprint of 19 batches of Naoan Capsules

表3 19批腦安膠囊高效液相色譜指紋圖譜相對峰面積Tab.3 Relative peak area of HPLC fingerprint of 19 batches of Naoan Capsules

2.5 化學(xué)模式分析

2.5.1 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

以共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，選擇描述統(tǒng)計(jì)項(xiàng)下的描述對原始變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到19×21新的標(biāo)準(zhǔn)化變量矩陣。

2.5.2 CA

將標(biāo)準(zhǔn)化變量矩陣導(dǎo)入SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行CA，結(jié)果19 批腦安膠囊依生產(chǎn)廠家的不同聚為兩類，即 S1 - S12 歸為一類，S13 - S19 歸為一類。詳見圖4。

圖4 19批腦安膠囊聚類分析Fig.4 CA of 19 batches of Naoan Capsules

2.5.3 PLS-DA 模型建立及分析

將標(biāo)準(zhǔn)化變量矩陣導(dǎo)入Simca-P 14.1 版軟件，建立 PLS-DA 模型。共提取 2 個(gè)主成分，PLS-DA 模型的3 個(gè)關(guān)鍵參數(shù)解釋率（R2）X為 0.938 > 0.5，R2Y為1.000 > 0.5，預(yù)測力（Q2）為0.996 > 0.5，且R2X和R2Y與Q2的差距均小于0.2，表明所建模型的解釋能力和預(yù)測能力均較強(qiáng)，可有效監(jiān)督、分析19批腦安膠囊的指紋圖譜信息。設(shè)置分類Y矩陣變量隨機(jī)排列20 次做置換檢驗(yàn)，R2和Q2回歸線的斜率均大于1，表明所建模型可靠，不存在過度擬合現(xiàn)象。經(jīng)PLS-DA 模型擬合分析生成散點(diǎn)得分圖和變量投影重要性（VIP）圖，詳見圖5和圖6。

圖5 PLS-DA模型散點(diǎn)得分圖Fig.5 Scoring plot of PLS-DA

由圖5 可知，19 批腦安膠囊均勻分布在95%置信區(qū)間內(nèi)，S1-S12聚為一類，S13-S15聚為一類，聚類良好，區(qū)分明顯，說明2 個(gè)生產(chǎn)廠家的腦安膠囊指紋圖譜存在明顯差異。VIP>1的成分對分類有顯著影響，即為差異標(biāo)志物。由圖6 可知，腦安膠囊的差異標(biāo)志物按權(quán)重大小依次為19 號峰、7 號峰（阿魏酸）、15 號峰（藁本內(nèi)酯）、10 號峰、4 號峰（川芎嗪）、3 號峰、12 號峰，表明這7 個(gè)化合物對腦安膠囊指紋圖譜的差異影響較大，生產(chǎn)時(shí)應(yīng)高度重視這7個(gè)化合物，同時(shí)有必要進(jìn)一步借助質(zhì)譜分析等手段鑒定19號峰、10號峰、3號峰和12號峰。

圖6 PLS-DA 模型的VIP圖Fig.6 VIP plot of PLS-DA

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

方中，川芎為君藥，標(biāo)志性成分為阿魏酸，同時(shí)含有酰胺類生物堿川芎嗪、苯酞類化合物藁本內(nèi)酯等。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪是一種新型鈣離子拮抗劑，具有抑制自由基產(chǎn)生、清除自由基［13］，抑制腦缺血再灌注（I/R）損傷［14］，改善微循環(huán)、抗血小板凝集、抗炎、抗腹膜間皮細(xì)胞損傷和防治腹膜纖維化［15］，影響腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移［16-17］等作用；藁本內(nèi)酯為苯酞類化合物的主要活性物質(zhì)，具有抗動脈粥樣硬化、保護(hù)神經(jīng)、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性［18］，阿魏酸和藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸的主要活性成分；羥基紅花黃色素A和山柰素是《中國藥典（一部）》紅花的定性指標(biāo)；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1是《中國藥典（一部）》人參的定性指標(biāo)，故確定本研究中的定性指標(biāo)分別為阿魏酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A、山柰素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 和人參皂苷Rb18 個(gè)化合物。

3.2 色譜條件選擇

本研究中采用二極管陣列檢測器（DAD）于200～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，發(fā)現(xiàn)HPLC 圖于316 nm 波長處基線平穩(wěn)，色譜峰信息豐富，峰面積響應(yīng)值適中，與相鄰色譜峰分離度較好，故確定檢測波長為316 nm。同時(shí)，考察由甲醇、乙腈水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液組成的11 種不同流動相梯度洗脫體系對HPLC 圖的影響，結(jié)果以乙腈- 0.1%磷酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜峰信息更全面，峰形較好，基線平穩(wěn)，故確定以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。

3.3 供試品提取方法選擇

本研究中考察了加熱回流、浸提和超聲提取3種提取方法、不同體積比甲醇水溶液、不同超聲提取時(shí)間對腦安膠囊HPLC指紋圖譜的影響，綜合指標(biāo)成分提取率、指紋圖譜色譜峰信息等，最終選擇2.2項(xiàng)下處理方法。

3.4 結(jié)果分析

由相似度結(jié)果可知，腦安膠囊化學(xué)成分一致性較好。共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別為0.40%～1.57%和6.60%～40.70%，表明方法穩(wěn)定性良好，但不同批次腦安膠囊中部分化合物含量差異較大。CA和PLS-DA將19批腦安膠囊依生產(chǎn)廠家的不同聚為兩類，同時(shí)PLS - DA 篩選出影響分組的7 個(gè)差異標(biāo)志物，分別為 19 號峰、3 號峰、10 號峰、12 號峰、阿魏酸、川芎嗪、藁本內(nèi)酯。建議評價(jià)腦安膠囊穩(wěn)定性時(shí)應(yīng)著重關(guān)注這7個(gè)化合物的含量。

3.5 方法評價(jià)

本研究中首次采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)對腦安膠囊不同生產(chǎn)廠家、不同生產(chǎn)批次的質(zhì)量進(jìn)行深入探索，較系統(tǒng)、整體、全面地分析及評價(jià)了中藥復(fù)雜指紋圖譜，可快速篩選腦安膠囊質(zhì)量控制過程中需重點(diǎn)關(guān)注的指標(biāo)成分。該方法科學(xué)、快速、有效，可較全面地反映腦安膠囊所含化學(xué)成分，結(jié)合相似度評價(jià)及CA 和PLS - DA 化學(xué)模式識別技術(shù)，補(bǔ)充了腦安膠囊現(xiàn)有質(zhì)量評價(jià)方法的不足，為腦安膠囊HPLC 指紋圖譜的分析提供了有效手段，為完善腦安膠囊的藥品標(biāo)準(zhǔn)提供了試驗(yàn)依據(jù)。