徐汪洋 黃麗珊 姚 舜 黃子祥 張 力 張 輝 王業(yè)楊

（廣東省第二人民醫(yī)院骨科中心，廣州 510317）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱損傷后嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，具有極高的致殘、致畸與死亡率，往往引起患者機(jī)體運(yùn)動功能及感覺功能損傷，給社會及家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的身心健康［1-2］。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）一直是SCI研究的熱點(diǎn)，但外源干細(xì)胞移植面臨著免疫排斥和移植后腫瘤形成的風(fēng)險［3］。從醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化角度來看，如何激活內(nèi)源性NSCs產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，以進(jìn)行脊髓修復(fù)值得探究。研究表明，與正常的脊髓組織相比，受傷的脊髓基質(zhì)剛度明顯降低［4-5］。細(xì)胞周圍基質(zhì)剛度的變化對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的分化和激活產(chǎn)生影響［6-8］。但脊髓基質(zhì)剛度如何影響NSCs細(xì)胞分化激活，以及細(xì)胞如何將細(xì)胞外力學(xué)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)生化信號還有待研究。

壓電型機(jī)械敏感離子通道組件1（piezo type mechanosensitive ion channel component 1，Piezo1）是一種機(jī)械敏感性陽離子通道，可以響應(yīng)機(jī)械信號并通過調(diào)節(jié)鈣離子的流入進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞密度和干細(xì)胞活化。在多種細(xì)胞中，Piezo1都可調(diào)控力學(xué)刺激引起的陽離子內(nèi)流，且其是神經(jīng)發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)器，參與軸突生長、少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘形成和祖細(xì)胞分化［9］。Piezo1介導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞機(jī)械敏感性，Piezo1敲低改變了大腦的剛度，導(dǎo)致軸突生長減緩［10］。體內(nèi)外實驗也表明，藥理性激活Piezo1可誘導(dǎo)脫髓鞘，而抑制Piezo1減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘［11］。激活Piezo1通道會減慢脂多糖刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移速度及細(xì)胞因子和趨化因子的釋放［12］。上述研究提示Piezo1調(diào)節(jié)的局部組織剛度參與神經(jīng)發(fā)育過程。本文擬研究基質(zhì)剛度變化及Piezo1響應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)剛度變化對NSCs分化的影響，以期為基于生物材料的脊髓損傷治療提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購自南方科技大學(xué)實驗動物中心。兔抗Piezo1多克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗雙皮質(zhì)醇（doublecortion，DCX）單克隆抗體及兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或抗羊IgG、IV型膠原（collagen IV）及纖連蛋白（fibronectin）抗體購自英國Abcam公司；過硫酸銨購自北京化學(xué)試劑公司；四甲基乙二胺和重組纖連蛋白購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；Piezo1短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）質(zhì)粒由上海吉凱公司制備。

1.2 大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建

麻醉后將大鼠（2月齡）剪除手術(shù)切口周圍2 cm范圍毛發(fā)，消毒，定位T8~T10位置后行背部正中切口，長約2 cm，剪開皮膚，鈍性分離皮下筋膜組織，將T9~T11椎板全切除后暴露相應(yīng)節(jié)段脊髓，顯露硬脊膜并保持其完整和表面干潔，采用10 g×25 mm致傷勢能對大鼠脊髓進(jìn)行垂直墜落打擊損傷，打擊完畢后可見損傷區(qū)硬膜下血腫、大鼠雙后肢抽搐及鼠尾痙攣性擺動后下垂，大鼠蘇醒后雙后肢呈癱瘓狀態(tài)表示造模成功?？瞻讓φ眨╯ham）組大鼠僅行T9~T11椎板切除術(shù)，不損傷脊髓。每組3只大鼠。本研究獲得廣東省第二人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2022-DW-SB-94），所有動物實驗遵循國家及醫(yī)院實驗動物福利倫理審查指南。

1.3 大鼠脊髓NSCs的分離與細(xì)胞分組

出生1~2 d大鼠以脫頸椎法處死，75%酒精常規(guī)消毒皮膚。無菌PBS清洗后，剝離背部皮膚，剝離椎板、硬脊膜，分離出脊髓組織，用DMEM/F12液沖洗3~4遍，去除脊髓組織表面的血細(xì)胞和雜質(zhì)。用眼科剪將脊髓組織剪碎至大約0.5 mm2的小塊，吹打成細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液過篩網(wǎng)（200目銅網(wǎng)過濾），獲得單細(xì)胞懸液。然后采用1 200 r/min離心8 min，獲細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞重懸于無血清NSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為（4~5）×108/L。

取剛分離或第二代脊髓NSCs懸液，置入裝有0.1%多聚賴氨酸處理過蓋玻片的3.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為無血清NSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

細(xì)胞分組如下：0.7 kPa組、20 kPa組、40 kPa組（NSCs分別培養(yǎng)于0.7、20、40 kPa剛度基底）；sh-NC組（20 nmol/L sh-NC轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞，并培養(yǎng)于40 kPa剛度基底下）；sh-Piezo1組（20 nmol/L Piezo1 shRNA轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞，并培養(yǎng)于40 kPa剛度基底下）。

1.4 免疫組織化學(xué)

大鼠麻醉處死，快速開胸，經(jīng)心灌注生理鹽水約200 ml以置換出血液，然后在冰上以損傷處為中心取出長約1 cm脊髓組織。多聚甲醛固定后OCT包埋。制備冰凍切片。經(jīng)復(fù)溫，PBS漂洗，0.3% Triton X-100通透后，10%正常山羊血清的PBS液室溫封閉1 h。然后用羊抗鼠Piezo1（1∶200）一抗4℃孵育過夜，加入稀釋后的30 μl抗鼠IgG二抗（1∶200），PBS漂洗后，DAPI復(fù)染。封片后，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 不同剛度的基質(zhì)制備

聚丙烯酰胺凝膠基底的制備方法參考Tse等［13］的研究。具體配方見表1。配好相應(yīng)剛度的溶液后，加入10%的過硫酸銨（北京化學(xué)試劑公司）和0.1%的四甲基乙二胺（美國Sigma公司），快速混勻。將混合液加入間隔為0.75 mm的平行制膠板中靜置1 h使其凝固。將水凝膠切成合適大小的圓形，PBS清洗后，將光交聯(lián)劑（Sulfo-SANPA）均勻滴于膠表面，紫外燈照射30 min，活化聚丙烯酰胺膠以便與膠原連接。PBS清洗3次，在膠的表面鋪上合適體積的I型膠原蛋白（collagen I，25 mg/L），4℃孵育過夜。

Table 1 Polyacrylamide gel formulations with different elastic modulus

1.6 Piezo1及重組纖維連接蛋白處理NSCs細(xì)胞

根據(jù)Invitrogen公司說明書，用LipofectamineTM2000將20 nmol/L sh-Piezo1或sh-NC分別轉(zhuǎn)染NSCs細(xì)胞，孵育48 h。對于重組纖維連接蛋白處理NSCs細(xì)胞，50 mg/L重組纖維連接蛋白加入40 kPa聚丙烯酰胺凝膠基底，37℃處理4 h，PBS清洗后紫外殺菌30 min。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）

RIPA裂解液在冰上裂解NSCs細(xì)胞，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。隨后取10 μg蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至12% PVDF膜上，10%牛血清白蛋白封閉1 h。加入Piezo1一抗稀釋液，4℃孵育過夜。次日加入二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的蛋白的表達(dá)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 免疫熒光檢測DCX和GFAP陽性細(xì)胞百分比

將1×104個NSCs細(xì)胞培養(yǎng)在不同剛度的基底上48 h后，吸棄培養(yǎng)板內(nèi)的促分化培養(yǎng)基；4%多聚甲醛固定后0.5% Triton X-100室溫通透20 min；10%山羊血清的PBS溶液室溫封閉30 min，隨后滴加兔抗小鼠DCX一抗（1∶800）或GFAP一抗（1∶200），4℃孵育過夜；滴加Alexa Fluor? 594標(biāo)記的熒光二抗，室溫孵育1 h；DAPI（0.1 μg/L）避光孵育10 min，封片后，于Olympus IX53顯微鏡下觀察并拍照。重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。脊髓損傷大鼠損傷組織Piezo1表達(dá)采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行兩組間比較，其他實驗數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析及Bonferroni事后檢驗進(jìn)行多組間比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 硬基質(zhì)剛度促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化

將NSCs分別培養(yǎng)于0.7、20、40 kPa剛度基底上，免疫熒光法檢測神經(jīng)元標(biāo)志物DCX和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP陽性細(xì)胞百分比。如圖1所示，與0.7 kPa組相比，20 kPa組和40 kPa組DCX陽性細(xì)胞數(shù)增加（圖1a，b），而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)減少（圖1c，d）。NSCs培養(yǎng)96 h時，DCX陽性細(xì)胞數(shù)較培養(yǎng)48 h增加（圖1a，b），而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)較培養(yǎng)48 h減少（圖1c，d）。

Fig. 1 Matrix stiffness affects differentiation of NSCs

2.2 Piezo1在脊髓損傷大鼠損傷組織的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與sham組比較，脊髓損傷大鼠損傷組織Piezo1蛋白表達(dá)上調(diào)（圖2a）。Western blot結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致（圖2b，c）。

Fig. 2 Expression of Piezo1 in rat spinal cord tissue

2.3 硬基質(zhì)剛度促進(jìn)Piezo1蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，與0.7 kPa基質(zhì)剛度相比，隨著基質(zhì)剛度上升，Piezo1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（圖3）。與培養(yǎng)48 h相比，NSCs在相應(yīng)剛度基質(zhì)上培養(yǎng)96 h時Piezo1表達(dá)量更高（圖3）。

Fig. 3 Effect of matrix stiffness on expression of Piezo1 in NSCs

2.4 Piezo1沉默逆轉(zhuǎn)了硬基質(zhì)剛度對NSCs分化的影響

為了檢測Piezo1是否參與基底剛度調(diào)節(jié)的NSCs細(xì)胞分化，NSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-Piezo1質(zhì)粒并于40 kPa基質(zhì)剛度條件下培養(yǎng)。Western blot實驗表明，sh-Piezo1轉(zhuǎn)染后Piezo1蛋白表達(dá)量降低，sh-Piezo1 #1的沉默效率高于sh-Piezo1 #2（圖4a，b），因此用sh-Piezo1 #1干擾質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實驗。免疫熒光結(jié)果顯示，40 kPa基質(zhì)剛度條件下沉默Piezo1后，DCX陽性細(xì)胞數(shù)減少（圖4c），而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)增加（圖4d）。上述結(jié)果說明，沉默Piezo1會逆轉(zhuǎn)硬基質(zhì)剛度引起的NSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化。

Fig. 4 Piezo1 directs neuronal-glial lineage choice in NSCs

2.5 纖連蛋白逆轉(zhuǎn)Piezo1對NSCs分化的影響

據(jù)報道，在Piezo1敲除人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，包括細(xì)胞外基質(zhì)形成、膠原分解代謝、細(xì)胞黏附、ECM-受體相互作用在內(nèi)的多種通路成分下調(diào)［14］。Western blot實驗表明，40 kPa基質(zhì)剛度條件下沉默Piezo1后，細(xì)胞外基質(zhì)IV型膠原及纖連蛋白表達(dá)下降（圖5a~c）。與sh-Piezo1處理的NSCs相比，重組纖連蛋白處理NSCs后，DCX陽性細(xì)胞數(shù)增加（圖5d），而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)減少（圖5e）。

Fig. 5 Fibronectin reversed the effect of Piezo1 on NSCs differentiation

3 討 論

本文研究發(fā)現(xiàn)，較硬的基底剛度使NSCs向神經(jīng)元分化，并能顯著上調(diào)NSCs細(xì)胞Piezo1的表達(dá)。沉默Piezo1可通過下調(diào)IV型膠原及纖連蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)硬基底剛度對NSCs分化的影響。

內(nèi)源性NSCs的激活及分化一直是脊髓損傷研究的重點(diǎn)［15］。然而現(xiàn)有研究多以生物化學(xué)手段為主，機(jī)械力學(xué)因素對NSCs分化的調(diào)控研究較少。研究表明，與正常的脊髓組織相比，受傷的脊髓基質(zhì)剛度明顯降低［4-5］。且隨著脊髓受力增加，脊髓剛度降低［16］。本文用0.7 kPa基底剛度模擬受傷脊髓組織的強(qiáng)度，用40 kPa基底剛度模擬正常脊髓組織的強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)，40 kPa基底剛度使NSCs向神經(jīng)元分化，而0.7 kPa基底剛度使NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。這解釋了為什么受傷后NSCs更趨向于向星形膠質(zhì)細(xì)胞而非神經(jīng)元分化的原因。最新的研究表明，軟基質(zhì)支持多能細(xì)胞的成脂分化和軟骨分化，而硬基質(zhì)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增值［17］。基底剛度對不同組織細(xì)胞分化的影響有很大差異，如大腦在軟基質(zhì)剛度下表現(xiàn)為神經(jīng)源性，而肌肉在較硬基質(zhì)剛度下表現(xiàn)為肌源性［18］。另有研究指出，神經(jīng)植入物的表面剛度適應(yīng)神經(jīng)組織的表面剛度可以最大程度地減少炎癥反應(yīng)并改善生物相容性［19］。綜上所述，脊髓、大腦組織相關(guān)的組織工程材料需更多考慮軟基質(zhì)剛度。

本文研究發(fā)現(xiàn)，基底剛度調(diào)控NSCs分化可能與Piezo1有關(guān)。Piezo1是一種機(jī)械敏感性陽離子通道，可以通過調(diào)節(jié)鈣離子的流入進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞密度和干細(xì)胞活化，在動物生物力學(xué)中起著重要的作用［20］。Piezo1對機(jī)械刺激有反應(yīng)，并在星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性中起作用［21］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松的病人Piezo1表達(dá)下降與成骨功能減弱相一致，在成骨細(xì)胞中敲除Piezo1的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨發(fā)育缺陷，成骨細(xì)胞功能顯著降低［22］。Lee等［23］報道，小鼠關(guān)節(jié)軟骨受到力學(xué)刺激時Piezo1表達(dá)量增加，引發(fā)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的增強(qiáng)；在遭受過度應(yīng)力時，可通過抑制Piezo1調(diào)控的力傳導(dǎo)減輕軟骨損傷和創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎。本文研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1參與基底剛度對NSCs分化的調(diào)節(jié)。首先，在脊髓損傷患者損傷組織Piezo1表達(dá)顯著升高；基底剛度增加時Piezo1表達(dá)量增加。其次，沉默Piezo1逆轉(zhuǎn)硬基底剛度對NSCs分化的影響，使之向膠質(zhì)細(xì)胞分化。以上結(jié)果說明，硬基底剛度通過促進(jìn)Piezo1表達(dá)促進(jìn)其神經(jīng)生成。這一研究結(jié)果與Pathak等［24］的研究結(jié)果一致，即抑制Piezo1抑制神經(jīng)生成，促進(jìn)膠質(zhì)生成。另有研究指出，老年大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞可以在新生大鼠的大腦中被激活，且Piezo1蛋白可以告訴細(xì)胞周圍環(huán)境是柔軟的還是僵硬的。抑制Piezo1蛋白的表達(dá)可以促使老化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)再生能力［25］，提示Piezo1可能調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)剛度。

細(xì)胞外基質(zhì)影響干細(xì)胞分化的研究已有報道［26］。體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，纖連蛋白是細(xì)胞分化成為特定細(xì)胞類型的關(guān)鍵［27］。缺乏ECM蛋白時，Piezo1受體對機(jī)械力刺激不敏感，因而難以被機(jī)械力激活；而IV型膠原增加Piezo1受體對機(jī)械力刺激的敏感性［28］。本文研究表明，敲低Piezo1后，纖連蛋白表達(dá)下降；重組纖連蛋白處理可逆轉(zhuǎn)Piezo1對NSCs的影響，促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。新生小鼠的脊髓損傷模型表明，新生小鼠的脊髓修復(fù)不伴隨瘢痕形成，這與小膠質(zhì)細(xì)胞的短暫激活及纖連蛋白的表達(dá)增高有關(guān)，從而促進(jìn)大量神經(jīng)軸突穿過損傷區(qū)域［29］。Piezo1介導(dǎo)的纖連蛋白改變是否會促進(jìn)神經(jīng)軸突穿過脊髓損傷區(qū)域值得進(jìn)一步研究。

當(dāng)然，2D維度環(huán)境無法概括3D維度環(huán)境所發(fā)現(xiàn)的所有信息［30］。因此，在解釋生物學(xué)數(shù)據(jù)并將體外研究結(jié)果轉(zhuǎn)換為體內(nèi)實驗時，維度是重要的考慮因素，也是后續(xù)工作需要研究的一個重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)沉默Piezo1可逆轉(zhuǎn)硬基底剛度對NSCs分化的影響。機(jī)制研究表明，Piezo1通過上調(diào)纖連蛋白表達(dá)促進(jìn)NSCs神經(jīng)元分化。這一發(fā)現(xiàn)，為基于生物材料治療脊髓損傷提供了新的視角。