賈中林，鄭慶霞，戴華鑫，張艷玲，周會娜，張仕祥，周漢平，梁太波

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

烤煙上部煙葉占單株總產(chǎn)量的40%左右，與其他部位的煙葉相比，上部煙葉煙氣濃度更高、香氣量更足，優(yōu)質(zhì)的上部煙葉是生產(chǎn)高檔卷煙的重要原料［1］。長期以來，我國部分煙區(qū)上部煙葉存在因成熟度不足而導(dǎo)致的化學(xué)成分不協(xié)調(diào)等問題，嚴(yán)重影響了上部葉的可用性［2-3］。自2010年以來，隨著上六片煙葉一次性成熟采收等技術(shù)的應(yīng)用，烤煙上部葉的可用性有了明顯改善，部分上部煙葉也被應(yīng)用于高端卷煙品牌的配方中。然而目前烤煙上部葉成熟過程中物質(zhì)代謝的規(guī)律尚不完全明確，一定程度上限制了相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用和推廣。

煙葉在成熟過程中經(jīng)歷了一系列復(fù)雜的生理代謝變化，代謝產(chǎn)物隨時間的動態(tài)變化對煙葉內(nèi)含物質(zhì)組成有較大影響，進而也影響煙葉的感官品質(zhì)［4］。代謝組學(xué)是一種用于全面表征代謝物全局變化的綜合分析技術(shù)，在代謝物動態(tài)變化研究中發(fā)揮著重要作用［5］。植物代謝組學(xué)始于20世紀(jì)90年代初，Sauter等［6］首次在植物系統(tǒng)中引入代謝譜的概念，通過分析特定生理時期植物樣品中的糖類、脂類、氨基酸等所有小分子代謝物的變化，可從全局表征生物體在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動后其代謝產(chǎn)物的變化［7］。目前，應(yīng)用比較廣泛的植物代謝組學(xué)測定技術(shù)主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等［8］。Zhang等［9］和Zhao等［10］運用GC-MS技術(shù)對我國不同地區(qū)（云南、貴州和河南）煙葉進行代謝組學(xué)分析，篩選出20種與產(chǎn)地相關(guān)的關(guān)鍵差異代謝物，并探討了氣候環(huán)境因素等對煙草生長發(fā)育的影響。近年來，代謝組學(xué)技術(shù)在煙草上的應(yīng)用多集中在外源脅迫和環(huán)境差異條件下的煙葉代謝組學(xué)研究領(lǐng)域［11-12］，而對煙葉成熟過程中代謝物質(zhì)的變化研究相對較少。為此，采用GC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對烤煙云煙87上部煙葉成熟過程中代謝物的動態(tài)變化進行分析，并結(jié)合煙葉成熟過程中色素、內(nèi)源激素和化學(xué)成分含量的變化，綜合研究了上部煙葉成熟過程中物質(zhì)代謝規(guī)律以及不同成熟階段代謝組的差異，旨在為進一步揭示上部煙葉的成熟機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年在福建省邵武市沿山煙草試驗站進行，供試烤煙品種為云煙87。采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)育苗方法育苗，煙苗于2021年2月20日移栽至大田，5月1日打頂，單株留葉數(shù)18片。供試煙田土壤類型為紅壤，基本理化性質(zhì)為pH 5.48、有機質(zhì)30.19 g/kg、堿解氮90.21 mg/kg、有效磷45.42 mg/kg、速效鉀304.02 mg/kg。其他田間管理措施參照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進行。

1.2 試驗設(shè)計

在烤煙打頂當(dāng)天選擇長勢一致的煙株200株掛牌標(biāo)記，作為試驗取樣煙株。取樣時間分別為烤煙打頂后第20、30、40、50和60天，葉位為煙株從上往下數(shù)第3片，取樣時將7片煙葉樣品混合作為1個生物學(xué)重復(fù)。每次取3次重復(fù)。剔除主脈和較粗的支脈，將樣品充分混合后用錫箔紙包裹立即放于液氮中速凍，干冰包埋運輸，-80℃冰箱保存。打頂后不同時期煙葉特征如圖1所示。

圖1 打頂后不同時期的煙葉特征Fig.1 Characteristics of tobacco leaves on different days after topping

1.3 測定方法

1.3.1質(zhì)體色素測定

采用李合生［13］的方法，用分光光度計（島津UV-2550型，日本Shimadzu公司）測定質(zhì)體色素含量（質(zhì)量分數(shù)）。

1.3.2化學(xué)成分測定

將保存于-80℃冰箱的樣品取出，低溫真空冷凍干燥后，用破壁機粉碎成粉末狀后進行化學(xué)成分檢測，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定煙葉淀粉［14］、水溶性糖［15］、總植物堿［16］、總氮［17］和游離氨基酸含量（質(zhì)量分數(shù)）［18］。

1.3.3內(nèi)源激素測定

采用LC-MS靶向代謝組學(xué)方法對植物生長素（Auxin，IAA）、赤 霉 素（Gibberellin，GA）、乙 烯（Ethylene，ETH）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）含量進行定量檢測，儀器為AB Sciex QTRAP 6500+質(zhì)譜儀和AB Sciex ExionLCTMAD液相色譜儀（美國Sciex公司），色譜柱為Waters XSelect HSS T3（2.1×150 mm，2.5 μm，美國Waters公司），流動相A為含0.01%甲酸的水溶液，B相為含0.01%甲酸的乙腈，柱溫45℃，進樣量10 μL，流速0.3 mL/min。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），離子源溫度550℃，負模式離子源電壓4 500 V，正模式離子源電壓4 500 V，氣簾氣壓力241 kPa，霧化氣壓力413 kPa，輔助氣壓力413 kPa；采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進行掃描。

1.3.4代謝組測定

參照Liu等［4］的方法，取煙葉粉末20 mg于2 mL離心管中，加入1.5 mL提取試劑［V（乙腈）∶V（異丙醇）∶水=3∶3∶2］，在4℃環(huán)境下超聲提取1 h，高速離心機14 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL真空濃縮干燥。干燥后的樣品加入衍生化試劑進行衍生化處理，過0.22 μm濾膜至進樣瓶中待測。使用Agilent 7890/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）對樣品進行測定，氣相色譜條件參考文獻［10］，色譜柱為DB-5MS柱（0.25 μm，0.25 mm×30 m）；載氣：氦氣；柱流速：1.2 mL/min；進樣口溫度：300℃；進樣體積1 μL；分流比10∶1；檢測器電壓保持在1.2 kV，選擇電子沖擊（EI）模式以實現(xiàn)70 eV的電離。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1代謝組數(shù)據(jù)預(yù)處理

參考鄭慶霞等［19］的方法進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，對采集的GC-MS數(shù)據(jù)進行色譜信號基線校正、峰提取、注釋和對齊等處理，采用面積歸一化法對代謝物進行相對定量。共檢出656個特征峰，80%樣品中均存在的特征峰有321個，依據(jù)代謝物的特征碎片使用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性分析，并確定代謝物種類。

1.4.2代謝組數(shù)據(jù)多元分析

采用SIMCA軟件（MKS Umetric AB，v14.1）進行多元統(tǒng)計分析。首先應(yīng)用主成分分析（PCA）對數(shù)據(jù)進行模式識別，考察各組樣品代謝組的分離情況。在PCA分析的基礎(chǔ)上，利用正交偏最小二乘-判別分析法（OPLS-DA）對在PCA模型中分離較好的兩組樣品進行加載分析，根據(jù)變量重要性分析（VIP）及t檢驗篩選并確定組間差異的變量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉成熟過程中色素含量的變化

從圖2可以看出，隨著成熟進程推進，煙葉中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均呈逐漸下降趨勢，打頂后20～30 d煙葉色素含量變化較小，打頂后40 d色素含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢。與打頂后30 d相比，葉綠素含量下降37.65%，類胡蘿卜素含量下降29.35%，整個成熟過程中葉綠含量下降速率大于類胡蘿卜素。

圖2 打頂后不同時期煙葉色素含量的變化Fig.2 Pigment contents in tobacco leaves on different days after topping

2.2 煙葉成熟過程中化學(xué)成分含量的變化

由表1可知，煙葉成熟過程中總氮含量整體呈下降趨勢，在打頂后40～60 d總氮含量顯著低于打頂后20～30 d，打頂后40～50 d時總氮含量出現(xiàn)短暫升高，推測可能與外界環(huán)境變化等因素有關(guān)。煙葉含氮化合物中游離氨基酸含量在打頂后20～50 d逐漸下降，并在打頂后50 d時降至最小值3.98 mg/g，在打頂后60 d升高至6.77 mg/g。在成熟過程中煙葉總植物堿逐漸積累，在成熟后期（打頂后50～60 d）總植物堿含量顯著高于其他時期。煙葉碳水化合物中總糖和還原糖含量在成熟前期（打頂后20～30 d）升高，在打頂后40 d呈明顯下降趨勢，之后總糖和還原糖含量逐漸升高，至打頂后60 d達到最大值，分別為6.88%和4.78%。淀粉含量在打頂后40 d呈現(xiàn)明顯上升趨勢，至打頂后50 d達到最大值35.08%，在打頂后60 d含量顯著下降?？梢姡蝽敽?0 d和60 d是煙葉中碳水化合物和含氮化合物含量發(fā)生明顯變化的兩個關(guān)鍵時間節(jié)點。

表1 煙葉成熟過程中化學(xué)成分含量的變化①Tab.1 Contents of chemical components in tobacco leaves during ripening

2.3 煙葉成熟過程中內(nèi)源激素含量變化

從圖3可看出，隨著煙葉成熟進程的推進，IAA和GA含量均呈先升高后降低的變化趨勢。IAA含量在打頂后20～30 d顯著高于打頂后40～60 d，GA含量在打頂后20～40 d顯著高于打頂后50～60 d。ETH含量在打頂后20～40 d逐漸升高，并在打頂后40 d達到最大值，之后開始下降。ABA含量整體呈升高趨勢，在打頂后60 d達到最大值19.14 ng/g?？傮w來看，隨著煙葉成熟進程的推進，促進生長類激素IAA和GA含量整體呈下降趨勢，促進成熟和衰老類激素ETH和ABA含量整體呈升高趨勢，4種激素均在打頂后40 d前后發(fā)生顯著變化。

圖3 煙葉成熟過程中內(nèi)源激素含量的變化Fig.3 Changes of endogenous hormone contents in tobacco leaves during ripening

2.4 不同成熟期煙葉差異代謝物分析

代謝物數(shù)據(jù)的層次聚類分析結(jié)果如圖4所示。所有樣品依據(jù)打頂后天數(shù)不同被劃分為三大簇。簇1包括打頂后20 d和30 d的樣品，簇2包括40 d和50 d的樣品，成熟后期60 d的樣品被單獨歸為一簇。聚類結(jié)果表明，不同成熟期樣品具有明顯的差異，可將煙葉成熟期劃分為3個階段，分別為打頂后20～30 d、40～50 d和60 d。

圖4 不同成熟期煙葉代謝物HCA圖Fig.4 HCA diagram of metabolites in tobacco leaves at different ripening stages

為了更直觀地展示不同成熟期樣品之間的差異，對所有樣品進行了無監(jiān)督主成分分析。從圖5可看出，樣品按照取樣時間聚類，其中打頂后20 d 和30 d 樣品的代謝輪廓相似，40 和50 d 樣品的代謝輪廓差異較小，20 d 和 30 d、40 d 和 50 d、60 d 煙葉樣品代謝輪廓明顯分離，說明3組煙葉樣品的代謝輪廓差異較大，與HCA 結(jié)果一致。根據(jù)HCA 和PCA 結(jié)果，挑選代謝輪廓差異較明顯的20 d、40 d和60 d煙葉樣品進行后續(xù)差異代謝物篩選分析。

圖5 不同成熟期煙葉代謝物PCA圖Fig.5 PCA diagram of metabolites in tobacco leaves at different ripening stages

設(shè)立20 d vs 40 d、40 d vs 60 d、20 d vs 60 d 3個對比組進行正交偏最小二乘判別分析，以VIP＞1和p＜0.05為依據(jù)篩選差異代謝物，從3個對比組中分別篩選出28、21和30種差異代謝物。去除重復(fù)代謝物后，3個對比組中總共篩選出差異代謝物38種，分為4類，分別為氨基酸類（脯氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸等）、糖類（果糖、半乳糖、葡萄糖等）、有機酸類（檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等）和降煙堿、莨菪亭等其他類代謝物。

從聚類熱圖（圖6）可知，煙葉成熟過程中上調(diào)的差異代謝物主要是莨菪亭、降煙堿、糖苷類代謝物和蘋果酸、檸檬酸等有機酸類代謝物以及半乳糖和蔗糖等糖類代謝產(chǎn)物，下調(diào)差異代謝物主要是脯氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸等氨基酸類代謝物和棕櫚酸、琥珀酸、亞麻酸、莽草酸、甘油酸等有機酸類代謝物。此外，還有一些糖類代謝物如葡萄糖、果糖和阿洛糖等在打頂后20～40 d呈下調(diào)變化趨勢，40～60 d呈上調(diào)變化趨勢。

圖6 差異代謝物聚類熱圖Fig.6 Cluster heat map of differential metabolites

Venn圖（圖7）顯示，3個對比組有13個共同差異代謝物，分別為棕櫚酸、奎尼酸、4-氨基丁酸、甘油-糖苷、L-蘇糖酸、蘋果酸、肌醇、D-果糖、甘油酸、D-阿洛糖、13-維甲酸、亞麻酸、莨菪亭。說明這些差異代謝物在上部煙葉成熟過程中均有較積極響應(yīng)，可能是成熟過程中較關(guān)鍵的代謝物。與40 d vs 60 d組相比，20 d vs 40 d組特有的差異代謝物有糖類物質(zhì)庚糖、半乳糖、蜜二糖，脂肪酸類物質(zhì)酮戊二酸、莽草酸和氨基酸類物質(zhì)脯氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸等，這些物質(zhì)在成熟前期有較強的響應(yīng)。40 d vs 60 d組特有的差異代謝物為L-谷氨酸、景天庚酮糖和二十碳三烯酸，說明這3種物質(zhì)在煙葉成熟后期有較強的響應(yīng)。20 d vs 60 d 組中特有的差異代謝物有降煙堿、琥珀酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷、阿拉伯呋喃糖、乙醇胺和葡萄糖酸，這些差異代謝物雖然在打頂后20～40 d 和40～60 d 沒有明顯變化，但在打頂后 20～60 d 呈現(xiàn)顯著變化，可見這些物質(zhì)在成熟過程中的變化具有累加效應(yīng)。

圖7 差異代謝物韋恩（Venn）圖Fig.7 Venn diagram of differential metabolites

將各組篩選出的差異代謝物映射到KEGG通路上進行注釋和通路富集分析（圖8），20 d vs 40 d 組中的差異代謝物共富集到32條代謝通路上。其中顯著富集的有4條，分別為乙醛酸和二羧酸代謝，丁酸代謝，氨基酰-tRNA 生物合成，檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）。40 d vs 60 d組差異代謝物共富集到27條代謝通路上，其中顯著富集的有4條，分別為乙醛酸和二羧酸代謝，丁酸代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。20 d vs 60 d組中的差異代謝物共富集到34條代謝通路上，其中顯著富集的有7條，分別為乳糖代謝，丁酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨基酰-tRNA生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，硫代謝?？梢?，煙葉成熟過程中差異代謝物主要是富集在糖代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝等途徑中，其中乙醛酸和二羧酸代謝，丁酸代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)），氨基酰-tRNA 生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等通路在煙葉成熟過程中起重要調(diào)控作用，對煙葉代謝產(chǎn)物的形成具有重要影響。

2.5 代謝物間的相關(guān)性分析

對篩選出的關(guān)鍵代謝物進行相關(guān)性分析的結(jié)果如圖9所示。莨菪亭和蘋果酸呈極顯著正相關(guān)，二者與甘油酸、棕櫚酸、蘇糖酸、奎尼酸、4-氨基丁酸、亞麻酸呈極顯著負相關(guān)。代謝通路分析表明，莨菪亭參與次生代謝物的生物合成途徑，蘋果酸參與碳水化合物代謝中的TCA 循環(huán)，棕櫚酸和亞麻酸參與脂肪酸代謝，甘油酸是磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，同時可以作為前體物參與糖酵解途徑，4-氨基丁酸參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，奎尼酸參與莽草酸代謝通路中的氨基酸合成途徑。結(jié)合煙葉成熟過程中各代謝物的表達變化，即莨菪亭和蘋果酸呈上調(diào)表達，甘油酸、棕櫚酸、蘇糖酸、奎尼酸等呈下調(diào)表達，推測在煙葉成熟過程中初生代謝如氨基酸合成代謝、脂肪酸代謝的活動減弱，而糖代謝活動和次生代謝物的生物合成活動逐漸增強。果糖和阿洛糖參與淀粉和蔗糖代謝，二者呈極顯著正相關(guān)，且均與肌醇呈極顯著負相關(guān)。肌醇是半乳糖代謝的中間產(chǎn)物，結(jié)合物質(zhì)含量的表達變化可知，在煙葉成熟過程中淀粉和蔗糖的代謝活動增強，肌醇含量減少可能與半乳糖代謝中的物質(zhì)更多地向合成半乳糖、葡萄糖等物質(zhì)方向轉(zhuǎn)變有關(guān)。

圖9 煙葉代謝物相關(guān)性分析Fig.9 Correlation analysis of metabolites in tobacco leaves

3 討論

煙葉生長發(fā)育是一個動態(tài)的過程，不同生長階段煙葉生理功能和代謝組存在較大差異。本研究將上部煙葉成熟過程大致劃分為3個階段，分別為打頂后20～30 d、40～50 d 和60 d，隨著成熟進程的推進，煙葉葉綠素含量逐漸下降，在打頂后30～40 d變化最明顯，說明此階段煙葉光合生理功能發(fā)生了較大變化。打頂后40 d煙葉中促進生長類激素IAA含量呈顯著下降的變化趨勢，促進成熟衰老類激素ETH 和ABA含量則顯著增加?？梢?，打頂后40 d可能是煙葉生理功能由盛轉(zhuǎn)衰的關(guān)鍵節(jié)點。本研究中從上部葉成熟過程中共篩選出38種差異代謝物，這些差異代謝物以糖類（果糖、葡萄糖、半乳糖等）、脂肪酸類（檸檬酸、草酸、棕櫚酸、亞麻酸等）和氨基酸類（脯氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸等）物質(zhì)為主，此外還有降煙堿、莨菪亭、綠原酸和糖苷類成分等物質(zhì)。

糖類物質(zhì)是植物能量代謝中的核心要素，可以調(diào)節(jié)植物生長和葉片衰老等發(fā)育進程。本研究中發(fā)現(xiàn)，在煙葉成熟過程中總糖、還原糖和淀粉含量整體上呈增加趨勢，但在打頂后40 d，總糖和還原糖均呈現(xiàn)顯著下降趨勢，差異代謝物聚類熱圖結(jié)果顯示，果糖、葡萄糖和阿洛糖等糖類代謝產(chǎn)物在打頂后40 d也呈現(xiàn)下調(diào)變化。近年來糖類物質(zhì)在植物成熟衰老中的作用已被廣泛研究，其對衰老的影響在不同物種之間存在差異［20-21］。在擬南芥葉片發(fā)育過程中糖的積累逐漸增加，施加外源糖會導(dǎo)致葉片衰老提前［22］。而對向日葵的研究發(fā)現(xiàn)，葉片中糖含量隨葉片生長發(fā)育而降低［23］，低水平的糖會促進乙烯的產(chǎn)生或增加對乙烯的敏感性，從而促進衰老［24］。在本研究中，糖代謝類產(chǎn)物在打頂后40 d 出現(xiàn)明顯下調(diào)，這與Li等［25］發(fā)現(xiàn)煙葉衰老初期單糖含量水平顯著下降的現(xiàn)象一致，說明葉片衰老可能是受糖含量變化的誘導(dǎo)影響。在打頂后60 d，煙葉總糖、還原糖含量以及代謝物中果糖、葡萄糖、蔗糖等呈現(xiàn)上調(diào)表達，而煙葉淀粉含量出現(xiàn)明顯下降，成熟后期糖類物質(zhì)含量的升高可能是由于煙葉中淀粉降解所致。

煙葉在生長發(fā)育過程中通過光合作用產(chǎn)生大量的碳水化合物，再通過呼吸作用將這些碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機酸和其他中間產(chǎn)物，檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）是其中一條關(guān)鍵的代謝途徑，是糖類物質(zhì)代謝、脂類物質(zhì)代謝和氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐［26］。本研究中，20 d vs 40 d組中的差異代謝物顯著富集在TCA 循環(huán)通路上，說明呼吸作用在此階段發(fā)生了顯著變化，結(jié)合TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸、酮戊二酸以及蘋果酸在煙株打頂后20～40 d呈上調(diào)表達，可知在煙株打頂后40 d煙葉呼吸作用顯著上調(diào)。本研究中還發(fā)現(xiàn)，煙葉中亞麻酸、棕櫚酸和甘油酸等不飽和脂肪酸含量在成熟過程中均表現(xiàn)為下調(diào)變化，不飽和脂肪酸含量的下降對烤煙品質(zhì)有促進作用［27］，進一步印證了前人通過提高成熟度來提升煙葉品質(zhì)的結(jié)論［28］。

氮素重新利用是植物成熟衰老過程中一個重要的生理活動，氨基酸是植物氮代謝的重要產(chǎn)物［29-30］。本研究中各成熟階段的差異代謝物均富集到氨基酸類代謝通路中，主要有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基酰-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等通路，表明氨基酸代謝在煙葉成熟衰老過程中具有重要作用。對煙葉化學(xué)成分含量的分析發(fā)現(xiàn)，在打頂后20～50 d，煙葉游離氨基酸和總氮含量逐漸下降，總植物堿逐漸積累，脯氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、4-氨基丁酸等氨基酸類代謝物在成熟過程中呈下調(diào)表達，降煙堿則呈上調(diào)表達。煙葉游離氨基酸含量下降，一方面與氮素的轉(zhuǎn)移再利用有關(guān)，另一方面可能是作為前體物參與了生物堿的合成。降煙堿由煙堿去甲基化形成，與打頂后20 d相比，在打頂后40 d和60 d，煙葉中降煙堿含量明顯上調(diào)表達，可見煙葉中煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化主要發(fā)生在衰老葉片中［31-32］。在氮素充足的條件下，TCA 循環(huán)產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，天冬氨酸是合成生物堿的初始底物，因此在成熟過程中隨著檸檬酸和蘋果酸含量的上調(diào)，生物堿含量也逐漸增加［33］。

4 結(jié)論

①根據(jù)上部煙葉成熟過程中色素、內(nèi)源激素、化學(xué)成分含量和代謝物的變化規(guī)律，將煙葉成熟過程分為3個階段，即煙株打頂后20～30 d、40～50 d和60 d，其中打頂后40 d可能是上部煙葉成熟過程中生理功能由盛轉(zhuǎn)衰的一個關(guān)鍵節(jié)點。②果糖、阿洛糖、4-氨基丁酸、棕櫚酸、亞麻酸、甘油酸、蘋果酸、奎尼酸、莨菪亭、肌醇等可能是上部煙葉成熟過程中關(guān)鍵的代謝物，主要參與了氨基酸代謝、糖代謝和脂肪酸代謝等生物過程。其中乙醛酸和二羧酸代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，TCA 循環(huán)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等通路在上部煙葉成熟過程中起重要的調(diào)控作用。