任錫躍，劉 濤 ，朱發(fā)亮，王志江，葉賢文，梅 堅 ，王建軍

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明市盤龍區(qū)灃源路452 號 650201

2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明市茨壩鎮(zhèn)青松路21 號 650201

3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點實驗室，昆明市茨壩鎮(zhèn)青松路21 號 650201

4. 云南省煙草公司昆明市公司，昆明市盤龍區(qū)北京路523 號 650051

寄生疫霉（Phytophthora parasitica）屬卵菌綱（Oomycetes）、霜 霉 目（Peronosporales）、腐霉科（Eythictceae）、疫霉屬（Phytophthora），是一種寄主范圍較廣泛的病原菌，可侵染煙草、茄子和番茄等植物［1］。其中，P. parasitica 侵染煙草可引起煙草黑脛病，染病煙株莖基部產(chǎn)生黑斑，葉片自下而上變黃，最后全株枯萎，對我國的煙葉生產(chǎn)造成巨大的損失。目前常使用甲霜靈、烯酰嗎啉等農(nóng)藥防治煙草黑脛病，但大量使用農(nóng)藥會出現(xiàn)藥品殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染等問題，不利于煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［2-3］。

植物誘抗劑又名激發(fā)子，是一類可誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的特殊化合物的總稱。相比農(nóng)藥，植物誘抗劑具有安全、高效和抗性穩(wěn)定等優(yōu)點，可為煙草黑脛病防治提供新思路。β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）是從經(jīng)暴曬番茄根系中分離得到的一種次生代謝非蛋白氨基酸［4］，作為一種高效的植物誘抗劑，能夠增強植物對多種病害的抵抗能力。Wang 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，BABA 處理可誘導(dǎo)PR 表達(dá)量顯著增加，有助于葡萄抵御灰霉病菌（Botrytis cinerea）的侵染；Yao 等［6］研究表明，BABA有利于異黃酮生物合成和胼胝質(zhì)沉積，從而增強大豆對蚜蟲的抗性；何小龍等［7］報道，5.0 mmol/L BABA 可提高煙草對煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的抑制率，降低田間煙草花葉病的發(fā)病率和病情指數(shù)。然而，目前關(guān)于BABA 誘導(dǎo)煙草對P. parasitica 引起的煙草黑脛病抗性的研究還鮮見報道。為此，以云煙87為試驗材料，對供試煙草分別進(jìn)行BABA 和蒸餾水噴施處理，并用P.parasitica 侵染處理后的煙草，調(diào)查BABA 對煙草黑脛病的防治效果，測定并分析BABA 處理前后煙葉的防御酶活性、活性氧和MDA含量以及抗性相關(guān)基因的表達(dá)量變化，以期為BABA 在煙草病害防治中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試煙草品種為云煙87。煙苗培育采用漂浮育苗法，煙草長至成苗期時移栽至裝有滅菌營養(yǎng)土的塑料缽中，待煙草長到5～6 葉期時用于試驗處理。供試菌種為P. parasitica，由西南生物多樣性實驗室分離并保存。BABA購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 BABA對煙草黑脛病的防治效果測定

試驗共設(shè)置2個處理（處理A：噴施3次蒸餾水，每次間隔3 d，最后一次噴施3 d 后用菌絲塊創(chuàng)傷莖基部接種法［8］接種 P. parasitica；處理 B：噴施 3 次5 mmol/L BABA，每次間隔3 d，最后一次噴施3 d后接種P. parasitica），每個處理共計煙株10 株。處理后，以株為單位對煙草黑脛病的嚴(yán)重度進(jìn)行分級（0～9級）調(diào)查。其中全株無病的煙株記為0級；莖部病斑不超過莖圍的1/2，或1/3以下葉片凋萎的煙株記為1級；莖部病斑環(huán)繞莖圍 1/3～1/2，或1/3～1/2 葉片輕度凋萎，又或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑的煙株記為3級；莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎的煙株記為5 級；莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎的煙株記為7級；病株基本枯死的煙株記為 9 級。依據(jù) GB/T 23222—2008［9］統(tǒng)計發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，計算公式：

1.2.2 煙葉生理生化指標(biāo)和抗性相關(guān)基因表達(dá)量測定

試驗共設(shè)置4 個處理（處理1：噴施蒸餾水，不接種P. parasitica；處理2：噴施5 mmol/L BABA，不接種 P. parasitica；處理 3：噴施蒸餾水，3 d 后接種P. parasitica；處理4：噴施5 mmol/L BABA，3 d 后接種P. parasitica），每個處理共計煙株20 株，處理4 d后，取各處理的中部煙葉保存，后續(xù)用于煙葉生理生化指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá)量的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 防御酶活性測定

過氧化物酶（Peroxidase，POD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）為防御酶，這類酶不僅能清除植物受病原物侵染后形成的活性氧，而且能催化生成許多與抗性相關(guān)的化合物，在植物抗病反應(yīng)中有重要作用［10］。使用蘇州格銳思生物科技有限公司的酶活性檢測試劑盒檢測上述3種酶活性，試驗方法為分光光度法［11］，試驗儀器為紫外-可見分光光度計（UV-2450，日本島津公司），依據(jù)試劑盒說明書中的計算方法計算POD、PPO和CAT活性。

1.3.2 超氧陰離子（O2-）和丙二醛（MDA）的含量測定

超氧陰離子自由基的含量可間接反映組織細(xì)胞受損狀況和抗性強弱；MDA的含量多少與膜脂過氧化程度、膜結(jié)構(gòu)的受傷程度和植物的自我修復(fù)能力密切相關(guān)［12］。使用蘇州格銳思生物科技有限公司O2-和MDA 檢測試劑盒檢測 O2-和MDA 的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），試驗方法為分光光度法［11］，試驗儀器為紫外-可見分光光度計（UV-2450，日本島津公司），依據(jù)試劑盒說明書中的計算方法計算O2-和MDA含量。

1.3.3 抗性相關(guān)基因表達(dá)量測定

用TRIzol 法提取煙草總RNA，并進(jìn)行純化?？俁NA 用于反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈cDNA。將cDNA 作為模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL、SYBR Green超混合液10 μL、上游引物和下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。用于qPCR的引物信息見表1。以Actin為內(nèi)參基因，參照公式2-ΔΔCT計算基因的相對表達(dá)量［12］。

表1 實時定量PCR分析的基因和引物Tab.1 Genes and primers for real time quantitative PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗，使用GraphPad Prism軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BABA對煙草黑脛病的抗性誘導(dǎo)效果

研究發(fā)現(xiàn)兩個處理的煙草黑脛病發(fā)病率都為100.0%。處理A 的煙草病情指數(shù)為35.6，處理B 的煙草病情指數(shù)為15.6。5 mmol/L BABA對煙草黑脛病的防治效果為56.3%（表2）。

表2 不同處理對煙草黑脛病的防治效果Tab.2 Control effects of different treatments against tobacco black shank disease

2.2 BABA誘導(dǎo)煙葉產(chǎn)生枯斑與HIN1表達(dá)量

BABA處理煙草3 d后煙葉漸黃，形成壞死型枯斑，且下部煙葉枯斑的量和面積較上部煙葉大而多（圖1A），該病癥與超敏反應(yīng)（Hypersensitive response，HR）的癥狀類似。HIN1（Harpin-induced gene 1）為Spm（精氨）的蛋白誘導(dǎo)基因，而Spm 可作為信號參與超敏反應(yīng)途徑［13］，測定該基因的循環(huán)閾值（Cycle threshold，CT）并計算其表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)處理2的HIN1 基因表達(dá)量顯著高于處理1，處理4 的HIN1基因表達(dá)量顯著高于處理3（圖1B）。

圖1 BABA噴施后煙葉的超敏反應(yīng)Fig.1 Hypersensitive response of tobacco leaves after spraying BABA

2.3 BABA對煙草葉片防御酶的影響

由圖 2 可見，處理 2 的 POD、PPO 和 CAT 活性分別比處理1顯著提高了129.6%、81.3%和32.4%；處理4的POD和PPO分別比處理3顯著提高了264.4%和169.0%。表明在煙草感染黑脛病的過程中，BABA可誘導(dǎo)煙草葉片中PPO、POD和CAT活性提高。

圖2 不同處理對煙草防御酶的影響Fig.2 Effects of different treatments on tobacco defense enzymes

2.4 BABA 對煙草 O2-、MDA 含量以及抗性相關(guān)基因表達(dá)量的影響

處理2 的O2-含量比處理1 顯著增加142.2%；處理4的O2-含量比處理3顯著增加31.8%，但處理4與處理2相比，O2-含量顯著降低（圖3A）。此外，處理2的MDA 含量比處理1 顯著增加311.0%，處理3 和處理4 的MDA 含量均比處理2 顯著降低，且處理3 和處理4的MDA含量無顯著差異（圖3B）。NtrbohD基因可編碼NADPH氧化酶［又名呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白（Respiratory burst oxidase homolog ，RBOH）］，而NADPH氧化酶又可促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生［14］，故測定該基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)處理1 和處理2 的NtrbohD基因相對表達(dá)量無顯著差異；處理4 的NtrbohD基因相對表達(dá)量比處理3顯著降低56.9%（圖3C）。

圖3 不同處理對煙草活性氧及相關(guān)基因的影響Fig.3 Effects of different treatments on reactive oxygen and related genes in tobacco

3 討論

5 mmol/L BABA 噴施煙草3 d 后煙葉產(chǎn)生較多枯斑，根據(jù)Siegrist等［15］的研究，BABA誘導(dǎo)葉面枯斑的產(chǎn)生是一種超敏反應(yīng)，該反應(yīng)可阻止P. parasitica的擴散，減弱黑脛病對植株的危害。本研究中發(fā)現(xiàn) BABA 誘導(dǎo) PPO、POD 和 CAT 活性提高，這與前人［16-20］的研究結(jié)果一致。其中，PPO 和 CAT 活性的提高，可維持煙草對氧自由基的清除能力，保持植物體內(nèi)氧自由基的平衡。此外，PPO 和POD 活性的提高可使煙草中酚類物質(zhì)和芳香胺氧化為植保素和木質(zhì)素，抵御P. parasitica侵染［21-22］。

本研究中發(fā)現(xiàn)BABA 可誘導(dǎo)煙葉活性氧O2-含量顯著升高，活性氧能直接殺死病原菌并激活抗病基因的表達(dá)，其迸發(fā)是植物產(chǎn)生的最快的防御反應(yīng)，在植物免疫過程中起著至關(guān)重要的作用，可增強煙草對黑脛病的抗性［23］。本研究中還發(fā)現(xiàn)處理1和處理2 NtrbohD 的表達(dá)量無顯著差異；處理4 NtrbohD的表達(dá)量比處理 3 顯著降低，這與 Peng 等［24］發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘抗劑氟噻唑吡乙酮（Oxathiapiprolin）在增加擬南芥活性氧的同時還上調(diào)了RBOHD 表達(dá)水平的研究結(jié)果不一致，推測原因是BABA 誘導(dǎo)CAT 和POD酶活性提高從而抑制了接種P. parasitica 后活性氧的迸發(fā)，使該基因的表達(dá)水平達(dá)到動態(tài)平衡，在激活防御體系的同時緩解了活性氧對植物的氧化損傷。

4 結(jié)論

使用5 mmol/L BABA 處理煙草，發(fā)現(xiàn)BABA 可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生超敏反應(yīng)，并提高HIN1 基因的表達(dá)量。此外，煙草未接種P. parasitica時，BABA處理可誘導(dǎo)煙葉O2-含量增加142.2%，說明BABA可促使活性氧迸發(fā)。煙草接種P. parasitica 后，BABA 處理可誘導(dǎo)煙葉POD 和PPO 活性分別提高264.4%和169.0%，但該處理的NtrbohD 基因表達(dá)量降低了56.9%。BABA 處理可維持煙草對由P. parasitica 傷害產(chǎn)生的氧自由基的清除能力，抑制活性氧迸發(fā)，緩解活性氧對煙草的傷害，對煙草黑脛病的防治效果達(dá)到56.3%。